Um Protocolo Metodológico e Considerações para Estimulação Ultrassônica Transcraniana em Estudos Clínicos Exploratórios em Humanos

Summary

A estimulação ultrassônica transcraniana (TUS) é uma técnica promissora e não invasiva, capaz de estimular o cérebro humano em qualquer profundidade, oferecendo novas possibilidades terapêuticas para tratar diversas condições neurológicas. Esse protocolo fornece uma estrutura empírica padronizada, porém adaptável, para a aplicação da TUS em adultos neurotípicos e pacientes com doenças neurológicas, como AVC.

Abstract

A estimulação ultrassônica transcraniana (TUS) está surgindo como uma técnica neuromoduladora não invasiva, capaz de fornecer estimulação de precisão milimétrica em profundidades cerebrais inteiras. Os esforços de pesquisa têm se concentrado cada vez mais em seu potencial translacional. Dados promissores foram relatados em várias populações de doenças, incluindo doença de Parkinson e AVC, abrindo caminho para aplicações clínicas da TUS. Estudos clínicos até o momento, no entanto, mostram variabilidade substancial na fixação do transduttor, abordagens de direcionamento e parâmetros acústicos. Isso limita a interpretabilidade e a comparabilidade dos resultados. Guias metodológicos existentes abordam a TUS humana em geral, mas não focam em aplicações em populações neurológicas. Esse protocolo experimental apresenta uma estrutura padronizada, porém adaptável, para aplicar a TUS a coortes neurológicas, como o AVC. Ele oferece orientações detalhadas sobre: (1) componentes essenciais e opcionais de hardware no contexto de TUS orientados para terapia; (2) configurações de hardware e seleção de parâmetros, incluindo estratégias para minimizar confusões auditivas; (3) procedimentos de calibração e garantia de qualidade para garantir que o transdutor entregue as formas de onda conforme especificado; (4) abordagens de direcionamento baseadas em métodos de simulação ou não simulação para localização precisa do foco/focos do TUS para a(s) região(s) anatômica(s) pretendida(s); (5) adaptação metodológica para populações clínicas; e (6) medidas de desfecho para TUS clínico, abrangendo avaliações de segurança e medidas substitutas como excitabilidade corticoespinhal e aprendizado de sequências motoras. Esse protocolo foi projetado como um recurso modular replicável. Ele atende tanto usuários iniciantes (que buscam uma entrada prática para o TUS baseado em pacientes) quanto pesquisadores experientes (buscando alinhar-se com padrões científicos e metodológicos emergentes). O objetivo é apoiar o crescente interesse clínico na TUS e facilitar resultados clinicamente tradutíveis, reproduzíveis e comparáveis entre grupos de pesquisa e populações de pacientes.

Introduction

Uma combinação única e desejável, a natureza profunda, focal e não invasiva da estimulação ultrassônica^{transcraniana 1} (TUS) tem estimulado um interesse crescente em explorar seus potenciais terapêuticos para doenças neurológicas e neuropsiquiátricas (por exemplo,^{AVC 2}, doença de Parkinson³,^{depressão 4}, doença de^{Alzheimer 5}, etc.). Consenso de especialistas e diretrizes buscaram melhorar a reprodutibilidade e a interpretabilidade da pesquisa do^{TUS 6,7}. No entanto, esses abordam principalmente as aplicações mais amplas da pesquisa básica do TUS e oferecem menos orientações sobre a exploração da relevância terapêutica em humanos. Por exemplo, ao comparar pesquisas básicas e clínicas com TUS, a duração total de estimulação (TSD) difere substancialmente – frequentemente até cerca de 80 s em pesquisa^{básica 8,9} versus mais de 10 min em protocolos exploratórios projetados para aproximar o uso^{clínico 2}. Tais distinções ressaltam a necessidade de orientação personalizada ao aplicar exploratoriamente a TUS a uma coorte neurologicamente doente. Embora esse protocolo foque na TUS no AVC, seu arcabouço é amplamente aplicável a outras populações de pacientes, bem como a adultos neurotípicos.

O TUS fornece ondas de pressão ao tecido cerebral alvo para^{modulação 7}. Componentes essenciais do hardware do TUS incluem gerador(is) de função(s), um amplificador, um transdutor e, especialmente para TSDs estendidos, um suporte de transdutor^{na cabeça 6}. O gerador de funções produz a forma de onda elétrica que define o padrão de pressão de saída emitido pelo transdutor. Embora alguns geradores de função possam gerar as tensões de pico necessárias para transdutores TUS, a maioria requer um amplificador para aumentar o sinal entre o(s) gerador(es) de função e o transdutor. O amplificador aumenta a amplitude da forma de onda elétrica até o nível necessário para a geração eficaz de ultrassons. Sistemas TUS comercialmente disponíveis frequentemente integram o gerador de funções e o amplificador em uma única unidade turnkey, permitindo conexão direta ao transdutor. O transdutor, tipicamente feito de materiais piezoelétricos, converte os sinais elétricos em vibrações mecânicas para produzir ondas de ultrassom. Embora a seguração manual do transdutor seja possível, essa abordagem é trabalhosa e suscetível a erros de deslocamento, enquanto um pequeno deslocamento pode causar um completo desajuste de direcionamento do tecido^{pretendido 7}. Braço mecânico com apoio para o queixo também é usado e funciona bem para pesquisa básica com TSDs relativamente mais curtos. Uma alternativa viável para TUS clínico exploratório com TSDs com mais de 10 minutos é a impressão 3D de um suporte transdutor equipado com flanges para fixação segura da tira (Figura 1), que pode equilibrar a estabilidade posicional com facilidade de uso em ambientes clínicos exploratórios e conforto do participante.

Figura 1: Montagem impressa em 3D para transdutor TUS. Transdutor de estimulação transcraniana ultrassônica (TUS) de elemento único (peça central apontada pela seta vermelha) alojado em um suporte transdutor impresso em 3D (apontado pela seta azul) com aberturas superiores (apontadas pela seta verde) para o rastreador de ferramentas da neuronavegação, aberturas laterais (apontadas pela seta marrom) para fixar transdutor TUS e rastreador de ferramentas usando parafusos, e flanges para fixação na cabeça baseada em correia. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Componentes de hardware opcionais incluem um circuito de adaptação de impedância elétrica, um medidor de potência, um osciloscópio, um sistema de neuronavegação e um termopar. Esses dispositivos ajudam respectivamente a reduzir reflexões elétricas para otimizar a transferência de potência, verificando indiretamente as saídas acústicas (medidor de potência e osciloscópio), garantindo precisão espacial e monitorando a segurança. Seus detalhes de implementação e considerações metodológicas são detalhados nas seções de Discussão e Protocolo.

Otimizar os parâmetros da estimulação transcraniana por ultrassom é uma área ativa e em evolução de pesquisa, que se refere ao design da forma de onda de propulsão elétrica. O eixo vertical de uma forma de onda de acionamento determina a amplitude da saída de pressão do transduttor. O eixo horizontal de uma forma de onda de acionamento determina o tempo de saída de pressão do transdutor, que pode ser dividido em alguns tipos de duração e repetição. Utilizando a nomenclatura descrita nas diretrizes de relatório do International Transcranial Ultrasonic Stimulation Safety and Standards Consortium (ITRUSST⁾¹⁰, os parâmetros de temporização do TUS são organizados do menor ao menor ao maior período da seguinte forma: duração de rampa (RD) é o tempo durante o qual a pressão de saída aumenta de zero até o máximo prescrito; duração do pulso (PD) é a duração para uma saída de pressão única, ativa e contínua; intervalo de repetição de pulso (PRI) é a duração entre o início de duas PDs adjacentes, consistindo em uma PD e um "tempo de desligamento" durante o qual a saída do transdutor é zero, e o recíproco do PRI é a frequência de repetição do pulso (PRF); Duração do trem de pulsos (PTD) é a duração durante a qual o PRI é repetido; Intervalo de trem de pulsos (PTI) é a duração entre o início de dois PTDs adjacentes, consistindo em um intervalo PTD e um inter-PTD durante o qual a saída do transdutor é zero; A duração da repetição do trem de pulsos (PTRD) é a duração pela qual a PTI é repetida.

Figura 2: Ilustração da forma de onda TUS. Formas típicas de onda de estimulação ultrassônica transcraniana para potenciais eficácias clínicas. A nomenclatura segue as diretrizes de relatório do^{ITRUSST 10}. RD, duração da rampa; PD, duração do pulso; PRI, intervalo de repetição de pulso; PRF, frequência de repetição de pulso; PTD, duração do trem de pulsos; PTI, intervalo de trem de pulsos; PTRD, duração da repetição do trem de pulsos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

A Figura 2 ilustra esses parâmetros de tempo. A Tabela 1.1 relata os parâmetros de tempo em Huang et al., 2025², a partir dos quais este protocolo é derivado, de acordo com a forma tabular recomendada pelas diretrizes de relatório^{do ITRUSST 10}, enquanto a Tabela 1.2 relata parâmetros adicionais. Efeitos auditivos são amplamente reconhecidos como um grande problema nos experimentos de^{TUS 6,11}. A rampa da forma de onda do drive é o método mais utilizado para mitigar efeitos auditivos e, portanto, será considerada a principal medida de mitigação neste protocolo. Teoricamente, perfis de ramping distintos podem ser aplicados no início e no fim de cada saída de pressão ativa (ou seja, PD, PTD, PTRD), mas a maioria dos estudos emprega a mesma PD simétrica repetida durante toda a sessão de estimulação, resultando em uma única RD no sinal de impulso. O ramping é implementado usando funções de janela, que definem a "forma" e a "velocidade" do sinal indo de zero ao máximo prescrito, sendo a janela de Tukey a mais comumente usada na literatura¹⁰. Após controlar confusões auditivas, selecionar parâmetros para provocar efeito excitatório versus inibitório permanece uma área de pesquisa ativa e depende da questão experimental específica. As escolhas de parâmetros em Huang et al., 2025², das quais este protocolo é derivado, foram informadas pela literatura^{existente 12}, com uma PD reduzida de 0,36 ms para 0,2 ms para margens adicionais de segurança. Aspectos metodológicos foram adaptados de Legon et al., 2018¹³. Essas seleções são um exemplo detalhado, e não um padrão prescritivo, refletindo a fase ainda exploratória do TUS clínico. Consulte a literatura relevante para orientações adaptadas à hipótese e aos objetivos específicos do estudo.

A calibração dos transdutores é uma consideração crítica do TUS, e a varredura de tanques de água representa o método mais abrangente atualmente disponível. Para sistemas TUS não turnkey, recomenda-se fortemente a varredura inicial do tanque de água para estabelecer a sensibilidade de transmissão do transduttor, ou seja, a relação entre a tensão de acionamento elétrico em Volts e a pressão resultante em Pascals. Sistemas turnkey frequentemente vêm com configurações pré-configuradas pelo fabricante que podem reduzir a necessidade de uma calibração inicial, mas verificar a saída do transdutor garante entrega TUS precisa e de alta qualidade. Da mesma forma, embora calibrações subsequentes possam ser minimizadas se necessário, verificações regulares são recomendáveis para aumentar o rigor do estudo.

A varredura de tanques de água geralmente requer equipamentos e treinamento especializados. Este protocolo fornece uma breve visão geral no Passo 2 (baseado em Chen et al., 2023¹⁴). Alternativamente, o procedimento pode ser terceirizado para um laboratório colaborativo com a expertise apropriada, confirmando que todos os parâmetros necessários foram coletados (Passo 2.7). As medições de medidores de potência fornecem um método simples e indireto para medir a saída do transdutor. Após calibração ou caracterização do fornecedor, as leituras dos medidores de energia podem servir como referência para a saída pré-administração. A variação na potência de saída implica mudanças correspondentes nas saídas de pressão, indicando a necessidade de recalibração ou ajuste do sinal de acionamento para manter a estimulação consistente.

O direcionamento dos TUS envolve determinar a posição ideal do transdutor, tanto a localização quanto a orientação, para estimular efetivamente o tecido de interesse. A abordagem atual de ponta emprega simulações numéricas para identificar a posição ótima dos transdutors (Passo 3 do protocolo), embora isso represente um exemplo e não um padrão definitivo. Alternativamente, um método baseado empiricamente anteriormente registrado localiza a localização do couro cabeludo onde a estimulação magnética transcraniana (TMS) mais efetivamente provoca respostas motoras contralaterais, e posiciona o transdutor nesse local com sua superfície normal ao couro cabeludo ^2,3 (Passo 4). Em princípio, essa abordagem guiada por TMS pode ser estendida para outras áreas cerebrais que possuem saída identificável, como a visão dos fosfenos para o córtex visual. No entanto, são necessários mais dados/publicações para validar a aplicabilidade mais ampla dessa abordagem.

As medidas de desfecho para TUS clínico incluem avaliações baseadas em segurança e eficácia. Dado o estágio exploratório da tradução clínica, a eficácia pronunciada pode ainda não ser detectável usando medidas clínicas padrão. Portanto, indicadores de resposta substituta são frequentemente usados no lugar de medidas de eficácia para detectar efeitos abaixo da eficácia clínica. O monitoramento de segurança pode incluir avaliações online e offline. A segurança online pode ser monitorada usando termopares colocados no couro cabeludo durante a estimulação, oferecendo uma abordagem prática no ambiente clínico (Passo 6.5). Para segurança offline, este protocolo fornece instruções para quantificação do coeficiente de difusão aparente (ADC) (Passo 8), já que o ADC é comumente usado para avaliar a integridade^{tecidular 15}. Os indicadores de resposta de barriga de aluguel variam dependendo da doença-alvo ou do domínio de interesse. Para estudos de recuperação motora pós-AVC, serão descritas medidas contralaterais de excitabilidade corticoespinhal (ECS) e aprendizagem de sequências motoras (MSL) (Etapas 9-11), pois fornecem marcadores neurofisiológicos e funcionais confiáveis para a eficácia clínica exploratória da TUS.

Em conjunto, esse protocolo fornece um exemplo detalhado, modular e adaptável para a administração de TUS tanto em adultos neurológicos quanto neurotípicos, enfatizando a facilidade de uso e a duração prolongada da estimulação. O protocolo é derivado de Huang et al., 2025^2, que emprega um sistema de acionamento não turnkey que permite a personalização da modelagem de pulsos e do transdutor de elemento único. De forma passo a passo, o princípio geral independente do sistema é apresentado primeiro e, quando apropriado, é apresentado um exemplo específico de implementação do sistema.

Protocol

Os procedimentos experimentais apresentados em Huang et al., 2025² foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional da Duke e estão de acordo com a Declaração de Helsinque recentemente atualizada. Obtenha consentimento informado de cada participante antes da inscrição.

NOTA: Siga as instruções enquanto trabalha simultaneamente com o hardware/software para aprimorar a compreensão e garantir uma implementação precisa. A Figura 3A mostra uma visão geral das etapas envolvidas, a Figura 3B mostra um fluxograma de decisão para escolher a segmentação baseada em simulação (Passo 3) versus não baseada em simulação (Etapa 4). Materiais suplementares fornecem listas de verificação pré e pós-TUS cobrindo a elegibilidade para consentimento, triagem de segurança, controle de qualidade dos equipamentos TUS e monitoramento de eventos adversos.

1. Triagem consentida e de segurança

1. Critérios de inclusão: i) ≥ 21 anos de qualquer raça ou sexo, ii) primeiro AVC isquêmico ou hemorrágico há mais de 1 mês, iii) apresentou fraqueza unilateral do membro e teve uma escala de Fugl-Meyer de Membros Superiores ≤ 62 (escroto máximo = 66), e iv) abdutora parética do polegar, curta (APB) possui potenciais evocados motores (MEPs) que podem ser provocados pela EMT. Critérios de exclusão: i) funções do braço afetadas por qualquer distúrbio neurológico concomitante, ii) demência grave documentada antes do início do AVC, independentemente do estado da medicação, ou iii) qualquer contraindicação para ressonância magnética (MRI⁾¹⁶/^{TMS 17}/TUS¹⁰.
2. Informe cada participante sobre o(s) propósito(s) do estudo, os procedimentos principais envolvidos e quaisquer riscos associados. Responda a quaisquer dúvidas ou preocupações que possam expressar e peça para confirmar sua compreensão do processo de consentimento assinando o formulário de consentimento.
3. Faça uma pesquisa de cada participante com a lista de verificação de segurança TUS¹⁸ e TMS¹⁷ . Exclua participantes que não cumpram todos os requisitos de segurança.

2. Caracterização do transdutor ^{TUS 14}

NOTA: Execute os passos desta seção para obter uma caracterização inicial de um novo transdutor TUS ou, em intervalos regulares, uma confirmação/calibração da relação tensão-pressão acústica de entrada do transdutor. A Figura 4 mostra a configuração do experimento para essa caracterização baseada em tanque de água de um transdutor TUS.

1. Encha um tanque de água com água desgaseificada e deionizada para evitar danos potenciais ao hidrofone.
2. Fixe o transdutor de ultrassom na luminária do tanque de água e monte o hidrofone no sistema de posicionamento de 3 eixos.
3. Conecte o hidrofone a um osciloscópio e ligue a energia do hidrofone somente depois que ele estiver totalmente imerso em água.
4. Acione o transdutor usando um gerador de funções e amplificador de potência de radiofrequência, somente depois que o transdutor estiver totalmente imerso na água e o hidrofone estiver ligado.
   NOTA: Certifique-se de que a forma de onda elétrica de entrada contenha pelo menos 5 ciclos para cada pulso (ou seja, PRI e PTI) para estabilizar a saída do transdutor.
5. Posicione a ponta do hidrofone na região focal aproximada visualmente definida do transdutor de ultrassom usando um sistema de posicionamento de 3 eixos, escaneie o hidrofone pelo tanque de água em locais de possível saída de pressão primária, registre a leitura do osciloscópio em cada local para obter a distribuição acústica da pressão e registre a localização do hidrofone onde a região focal é encontrada.
   NOTA: Calcule as pressões acústicas usando a sensibilidade do hidrofone (ou seja, mV/MPa) e a leitura do osciloscópio do sinal elétrico gravado pelo hidrofone.
6. Avalie a sensibilidade de transmissão do transdutor de ultrassom (ou seja, pressão de saída do transdutor sobre a amplitude pico a pico da tensão de entrada, kPa/_{V PP)} no ponto focal aplicando diferentes tensões de entrada.
7. Confirme que a sensibilidade transmissora (kPa/_{V PP)} do transdutor, a profundidade focal do transdutor (mm) e a largura do feixe de ultrassom de -6 dB (mm) foram todas coletadas ao terceirizar a caracterização do transdutor para um laboratório colaborativo com a expertise adequada. A profundidade focal define a profundidade máxima de penetração na qual a energia potencialmente terapêutica pode ser efetivamente entregue à região cerebral alvo. A largura do feixe de -6 dB do campo do ultrassom especifica a extensão lateral da região focal, delineando assim o volume efetivo de tratamento dentro do tecido cerebral.

3. Segmentação TUS baseada em simulação (recomendado, varredura do participante necessária)

NOTA: O direcionamento de TUS baseado em simulação requer uma localização intracraniana predeterminada para ser estimulado. Essa seleção de alvos é específica para o estudo, e métodos comumente usados incluem abordagens anatômicas baseadas em atlas de ressonância magnética e abordagens funcionais guiadas por dados individuais de ativação funcional^{da ressonância magnética 7}, além da alvo informada por^{conectividade 19}. Selecione o método adequado ao estudo e à hipótese e siga a literatura^{relevante 7,19} para determinar o alvo intracraniano. Em seguida, siga os passos abaixo para obter a posição do transdutor TUS para estimular o alvo intracraniano.

1. Reconstrua um modelo segmentado de cabeça a partir da ressonância magnética - exemplo de implementação: Instale o software de simulação de campo elétrico (e-field) (veja Tabela de Materiais) se ainda não estiver instalado, e abra um terminal na pasta da varredura estrutural da ressonância magnética do participante. Execute o pipeline CHARM do software^{e-field 20} digitando charm ParticipantID ./ParticipantID_T1.nii.gz e pressionando Enter/return no teclado. Se um T2 estiver disponível, pode ser executado o charm ParticipantID ./ParticipantID_T1.nii.gz ./ParticipantID_T2.nii.gz em vez disso. Note os espaços e pontos nos comandos acima. Dependendo do tipo de terminal, a barra frontal (/) pode precisar ser substituída por barra para trás (\).
2. Verifique os resultados da segmentação, especialmente para a lesão (se houver) e o crânio - exemplo de implementação: Verifique os resultados de segmentação do CHARM abrindo a charm_report.html na pasta m2m_ParticipantID criada e clicando no visualizador para navegar pelas fatias. Confirme especialmente o contorno dos ossos corticais e trabeculares, do cérebro (substâncias cinzentas e brancas) e do couro cabeludo, pois o software de direcionamento^{TUS a jusante 21} (veja Tabela de Materiais) utiliza principalmente esses elementos. Siga o guia do software e-field para editar manualmente o modelo da cabeça caso a segmentação não seja satisfatória.
   NOTA: Para participantes com lesão como AVC, o software do campo eletrônico permite delimitação personalizada de uma lesão e, assim, atribuição de segmentação personalizada. No entanto, o software de segmentação TUS, a partir da V0.4.3, ainda não conseguiu reconhecer segmentos personalizados do software do campo eletrônico. Portanto, quando há uma lesão presente, basta apenas confirmar que os contornos dos tipos de tecido mencionados estão corretos e não são afetados pela lesão.
3. Configuração para definição intracraniana de alvos - exemplo de implementação: Acesse o Novo Projeto SimNIBS... no software de neuronavegação (veja Tabela de Materiais) e selecione o arquivo .msh na pasta m2m.
   NOTA: A versão 2.5.9 do software de neuronavegação foi usada para detalhar este e os passos seguintes, mas esses passos são aplicáveis às versões de 2.5.9 a 2.5.3.
4. Configuração para registro físico de ressonância magnética da cabeça - exemplo de implementação: Clique Configurar Pontos de Referência... na aba Landmarks , coloque pontos de referência na ponta do nariz, na nasion e na incisura supratragic esquerda/direita, depois salve o arquivo do projeto.
   NOTA: Pontos de referência para esta etapa devem ser onde a pele não está comprimida ou esticada durante a ressonância. Escolha pontos de referência diferentes dos acima, conforme desejado, dependendo da obtenção da ressonância magnética dos participantes.
5. Defina um alvo intracraniano e carregue em um software de segmentação TUS - exemplo de implementação: Clique em Configurar Alvos... na aba Alvos e traga Scalp & Targets, Inline & Targets e Inline 90 & Targets para visualizar. Clique com o botão esquerdo no foco TUS pretendido dentro do cérebro, projete um cursor deslocado para o couro cabeludo usando o controle deslizante Crosshairs Offset no canto inferior direito, deslize o controle AP à direita para minimizar a distância entre couro cabeludo e alvo em Inline & Targets, depois deslize o deslizador Lat até que o transdutor virtual fique tangencial ao couro cabeludo em Inline 90 & Targets. No menu suspenso Novo... (canto superior esquerdo da janela), selecione Trajetória para salvar essa posição. No canto inferior esquerdo da janela, alterne fUS, selecione uma pasta de resultados e depois clique em Calcular Simulação para invocar o software de direcionamento TUS.
   NOTA: Verifique cuidadosamente se há algum seio anatômico/cavidade preenchida de ar ao longo do trajeto da trajetória criada nesta etapa. Se sim, escolha a próxima melhor trajetória evitando o seio nasal/cavidade.
6. Inicialize o software de direcionamento TUS - exemplo de implementação: Confirme que as entradas preenchidas automaticamente no software de direcionamento TUS em Entrada de imagem estão corretas, exceto o perfil térmico, selecione o transdutor que será usado ("Single" significa transdutor de elemento único) e, se houver mais de um backend de computação disponível, selecione o backend de computação desejado. Em seguida, clique em Select Thermal Profile ... para carregar o arquivo .yaml correto que descreve o padrão temporal do sinal de condução do TUS. Consulte a documentação do software de direcionamento TUS para a construção deste arquivo .yaml. Como exemplo, o arquivo .yaml para o padrão temporal TUS em Huang et al., 2025² seria
   BaseIsppa: 8,0 # L/^{cm 2}
   AllDC_PRF_Duration: #All combinações de tempo que serão consideradas
   - DC: 0,2
   PRF: 1000,0 #Hz
   Duração: 0,5 #s
   DuraçãoOff: 1.0 #s
   Repetições: 480
   NOTA: Este exemplo é apenas para fins ilustrativos. Repetições 480 seriam excessivas demais para o software de segmentação do TUS calcular. Esse arquivo .yaml afeta apenas a simulação térmica do software de direcionamento TUS e não afeta sua simulação acústica, enquanto a simulação acústica é o único componente no qual a segmentação TUS se baseia. Para TUS longo, use o software de mira TUS para direcionamento e não para simulação térmica. Use o software de simulação acústica de código aberto (veja Tabela de Materiais) para simulações térmicas de paradigmas de longa duração. Consulte sua documentação para estimar aumento de temperatura, minutos equivalentes cumulativos a 43 °C (CEM43) de dose térmica e índice térmico, garantindo que os parâmetros selecionados estejam em conformidade com as diretrizes de segurança biofísica¹⁸ da Food^{and Drug Administration} e ITRUSST.
7. Obtenha máscaras de tecido e parâmetros de entrada para simulação acústica - exemplo de implementação: Pressione CONTINUE para chegar ao Passo 1 - Calcule a Máscara e selecione a frequência correta dos EUA (kHz) (ou seja, a frequência fundamental do transduttor) e o PPW desejado (ou seja, pontos por comprimento de onda). 9 PPW garantem resultados estáveis e precisos, mas geram uma carga computacional maior, e o padrão de 6 PPW é o mínimo do software de segmentação TUS, que equilibra computação rápida, estabilidade e precisão. Clique em Calcular máscara de planejamento. Após o término do cálculo, inspecione a máscara de saída para garantir que o couro cabeludo, osso e cérebro estejam rotulados com precisão desejada.
8. Entrada caracterizações do transdutor e execução do direcionamento TUS - exemplo de implementação: Clique no Passo 2 - Simulador AC. Se o Single foi selecionado no Passo 3.6, insira Distância Focal (mm) e Diâmetro (mm) do transdutor, insira a distância entre o couro cabeludo e o plano de saída do transdutor (devido a meios de acoplamento como gel espalhado ou almofada de gel) na Distância Tx plano externo à pele (mm), e insira Profundidade máxima além do alvo (mm). Essa profundidade é o espaço além do alvo pretendido a incluir na simulação. Os 40 mm padrão são suficientes na maioria dos casos, mas se o alvo pretendido estiver acima do tecido ósseo, aumentar essa profundidade garante que a reflexão resultante seja considerada. Após as entradas acima, pressione Calcular Campos, espere o cálculo terminar, pressione Calcular Ajustes Mecânicos e depois pressione Calcular Campos novamente. Inspecione o foco TUS resultante em relação ao alvo pretendido usando as duas barras deslizantes horizontais. Se o foco não estiver aceitavelmente próximo do alvo, repita o ajuste mecânico, calcule a ação do campo até uma distância aceitável de foco-alvo (Figura 5A).
   NOTA: Consulte a documentação do software de segmentação TUS para tipos de transdutores diferentes do Single.
9. Salve o alvo TUS otimizado computacionalmente – exemplo de implementação: Feche o software de direcionamento TUS para retornar ao software de neuronavegação. Note que um novo alvo Trajectória X-mod foi adicionado, onde Trajetória X é o nome dado à trajetória criada no Passo 3.5. Este é o alvo para a colocação do transdutor durante o TUS. Feche a janela de Alvos e salve o arquivo do projeto atual.
10. NOTA: Os passos 3.1 a 3.9 devem ser concluídos antes que o participante chegue para o TUS.

4. Segmentação de TUS não baseada em simulação (varredura do participante opcional, aplicável a domínios com resultados TMS legíveis)

1. Inicializar TMS neuronavegado - exemplo de implementação: Clique em Novo Projeto Vazio e clique aqui para escolher um conjunto de dados anatômico para selecionar a ressonância magnética participante no software de neuronavegação. Ataque o Projeto Principal do Novo MNI se a ressonância magnética estrutural do participante não estiver disponível.
   NOTA: Use um sistema/software de neuronavegação de preferência. Este protocolo utiliza um software de neuronavegação em sua versão 2.5.9 (veja Tabela de Materiais) para ilustrar procedimentos representativos.
2. Pule essa etapa se não estiver usando uma ressonância magnética participante. Reconstruir o cérebro e o couro cabeludo a partir de ressonância magnética participante - exemplo de implementação: vá para a aba Reconstruções se estiver usando uma ressonância magnética participante, depois Nova Reconstrução... menu suspenso, selecione Pele e pressione o botão Calcular Pele na janela aberta para reconstruir o couro cabeludo. Feche a janela de skins, menu suspenso Nova Reconstrução , selecione Cérebro Curvilineo Completo, defina o espaçamento de fatia para 0,5 mm na janela aberta, e clique em Calcular Curvilinear. Após a reconstrução do cérebro, ajuste a barra deslizante de profundidade de peeling até que o cérebro reconstruído fique exposto exatamente na superfície externa do córtex, e feche a janela cerebral curvilínea.
3. Pule essa etapa se não estiver usando uma ressonância magnética. Configuração para registro físico da ressonância magnética da cabeça - exemplo de implementação: Vá para a aba Marcos se estiver usando uma ressonância magnética, depois Configure Marcos..., e coloque pontos de referência no entalhe nasion e supratrágico esquerdo/direito com um clique esquerdo no couro cabeludo reconstruído e clique em Novo no canto superior esquerdo. Confirme a localização do marco de referência verificando a mira nas três vistas de ressonância magnética. Ajuste o(s) mirador(es) para ajustar a posição dos pontos de referência, se necessário. Feche a janela de marcos de registro assim que estiver satisfeito e salve o arquivo do projeto.
   NOTA: Os passos 4.1 a 4.3 devem ser concluídos antes que o participante chegue para o TUS. Escolha pontos de referência diferentes da nasion e das relevadas supratrágicas esquerda/direita, conforme necessário. Bons pontos de referência são aqueles em que a pele não é comprimida/esticada durante a aquisição da ressonância magnética.
4. Pule essa etapa se o TUS for usado para o domínio visual. Prepare-se para a gravação por eletromiograma (EMG) - exemplo de implementação: Identifique o músculo representado no alvo do TUS pretendido, limpe a pele sobre o músculo de interesse com lenços umedecidos com álcool, faça a barba se necessário e permitido, e aplique eletrodos EMG na barriga e tendão do músculo. Aplique outro eletrodo em uma área óssea adjacente para servir de referência.
   NOTA: Durante a preparação da pele, tenha cautela com os participantes que usam anticoagulantes.
5. Inicializar o TMS neuronavegado - exemplo de implementação: vá para a aba Sessões no software de neuronavegação, depois Novo... menu suspenso, Sessão Online para abrir uma nova janela de sessão. Nesta janela de sessão, vá até a aba IOBox , nas opções de gatilho TTL, verifique o canal/interruptor correto que recebe o sinal de disparo do estimulador TMS e certifique-se de que o tempo morto esteja definido para 0 ms.
6. Pule essa etapa se o TUS for usado para o domínio visual. Configuração integrada de neuronavegação-EMG - exemplo de implementação: Para o domínio motor, se estiver usando o EMG do sistema de neuronavegação, verifique o canal correto de Acquire EMG e insira um Teste: tempo suficiente para capturar EMGs do músculo de interesse.
7. Preparar o participante para neuronavegação - exemplo de implementação: Anexe o rastreador de sujeito ao participante e garanta estabilidade. Vá até a aba Polaris no software de neuronavegação e posicione a câmera/participante de modo que o ponto verde (o participante) fique aproximadamente no centro das três caixas ciano (alcance de visão da câmera).
8. Realize registro físico de ressonância magnética da cabeça - exemplo de implementação: Vá à aba Registro , clique esquerdo em um ponto de referência, coloque de forma estável o ponteiro do sistema de neuronavegação no respectivo ponto de referência do participante enquanto garante que tanto o ponteiro quanto o rastreador de sujeito sejam visíveis pela câmera, e clique em Amostrar & Ir para o Próximo Marco. Repita até que todos os pontos de referência sejam amostrados.
9. Pule essa etapa se estiver usando uma ressonância magnética participante. Escala de modelo de ressonância magnética para a cabeça física do participante - exemplo de implementação: Se não estiver usando a ressonância magnética do participante, vá até a aba Escalonamento , coloque o ponteiro de forma estável no vértice do couro cabeludo do participante e clique em Adicionar Referência. Repita para o ponto mais externo à esquerda, direita, frente e atrás da cabeça.
10. Valide o registro da ressonância magnética do participante e atualize se necessário – exemplo de implementação: Vá até a aba Validação , deslize suavemente o ponteiro no couro cabeludo do participante ao redor do ponto de entrada pretendido do TUS/TMS e verifique a distância da pele <-> da Cruz , sendo que mais próximo de zero é melhor (< 1 mm pode ser usado como limiar operacional quantitativo). Se a distância exibida for considerada inaceitável, vá para Registro, Limpe Todos e repita os Passos 4.8 - 4.9 até uma distância aceitável.
11. Configure a janela de neuronavegação - exemplo de implementação: vá na aba Executar, abra as vistas Bullseye (Centrado na Coil), Curvilinear Brain & Samples e Skin & Samples , e defina o Driver: para a bobina TMS correta. Se estiver usando o EMG do sistema de neuronavegação, coloque também o EMG e o EMG Pod Recording .
    NOTA: Use Bullseye (Centrado no Alvo) no lugar do Bullseye (Centrado pela Bobina), se desejado.
12. Procure por uma colocação de uma bobina TMS com respostas - exemplo de implementação: Use tanto o cérebro curvilíneo quanto a posição aproximada no couro cabeludo para obter os primeiros arranques, coloque a bobina TMS em vários locais e orientações do couro cabeludo e administre pulsos únicos de TMS com intervalo^{de 10 s e 23}. Se não houver resposta em toda a área anatomicamente razoável, aumente a saída do estimulador.
    NOTA: Veja a Tabela de Materiais para os modelos de estimulador e bobina TMS e hardware e software de aquisição EMG. Como exemplo de implementação, a aquisição EMG tinha taxa de amostragem EMG de 5000 Hz, filtro passa-banda de 20 a 20000 Hz, filtro de entalhe de 60 Hz, ganho de 1000x, rejeição manual de artefatos, e utilizou o algoritmo de detecção MEP descrito em Soda et al., 2020-24.
13. Use uma resposta específica de domínio para definir a posição alvo da bobina TMS - exemplo de implementação: Repita o Passo 4.12 até que uma resposta seja observada, ou seja, EMG com amplitude de pico a pico pronunciada para o domínio motor (Figura 6), e os participantes relatem visão confiante dos fosfenos para o domínio visual. Acerte => Alvo e clique com o botão esquerdo desta amostra na lista Alvos para amostra: para tornar essa localização e posicionamento da bobina um alvo.
14. Obtenha repetições adicionais no alvo inicial do TMS - exemplo de implementação: Administrar 2 a 3 pulsos adicionais enquanto se alinha a esse alvo, posicionando a bobina de forma que as três métricas exibidas na visão Bullseye (Centrado na Bobina) ou na Bullseye (Centrada no Alvo) fiquem o mais próximas possível de zero. Registre as respostas resultantes.
15. Verifique respostas em posições adjacentes ao alvo TMS inicial - exemplo de implementação: Mova a bobina ~7 mm para longe desse alvo no primeiro quadrante na visão Bullseye (Centrado pela Bobina) / Centro-alvo (Centrado no Alvo), fixe a bobina nessa nova localização e orientação, administre ~3 pulsos e registre as respostas resultantes. Repita para os outros três quadrantes. Se uma configuração de bobina não central gerar uma resposta média mais forte do que a do centro, faça da respectiva amostra um alvo clicando com o botão esquerdo na lista Samples gravados: => Alvo, e clique esquerdo nesta amostra na lista Alvos para amostra:
16. Repita os passos 4.14 e 4.15 até que um centro tenha a resposta média mais forte entre ele e seus quatro quadrantes. A amostra respectiva deste centro será a amostra-alvo para o TUS. Registre esse número de exemplo e salve o arquivo do projeto.

5. Configurações TUS

1. Conecte o hardware TUS e inicie a gravação do osciloscópio - exemplo de implementação: Conecte os geradores de funções, amplificador e osciloscópio conforme ilustrado em (Figura 7A). Ligue o osciloscópio, coloque-o no modo Run e ajuste os eixos vertical e horizontal na escala de interesse.
   NOTA: Ter dois geradores de funções nem sempre é necessário. Modelos selecionados de geradores de funções podem produzir formas de onda com mais de um nível de controle de frequência. Além disso, o hardware usado nesse protocolo já corresponde em impedâncias elétricas. O(s) resistor(es) precisam ser conectados em série entre o amplificador e o osciloscópio quando a impedância elétrica não é garantida.
2. Inicie e verifique o sinal de acionamento, depois (para sistemas não turnkey) inicie a saída de potência - exemplo de implementação: Vire o interruptor MAIN POWER do amplificador de O para I. Ajuste a saída de potência do amplificador para zero, depois configure os geradores de funções na forma de onda escolhida, garantindo que o ramping seja adicionado ao início e ao fim de cada PD. Após verificar as configurações em ambos os geradores de funções, pressione Output no gerador superior, depois Output no gerador inferior, e então ajuste a potência do amplificador para 100% girando a roda ADJUST e verificando o valor Ganho: exibido, depois pressione o botão POWER do amplificador para iniciar sua saída (Figura 7B).
3. Verifique a forma de onda do sinal de acionamento e permita que a saída do sistema se estabilize - exemplo de implementação: Confirme que a forma de onda observada no osciloscópio está como desejada e deixe o sistema de acionamento funcionar por 15 minutos (critério empiricamente obtido para hardware especificado na Tabela de Materiais) para garantir uma saída estável (Figura 7C).
   NOTA: A saída estabilizadora do amplificador não está relacionada à flutuação de tensão. Está permitindo que a tensão se estabilize dentro da faixa desejada, por exemplo, para que o V_PP diminua de 10 a 20% em relação ao valor inicial e mantenha-se nesse nível, com o amplificador neste protocolo (veja Tabela de Materiais). Sistemas de acionamento diferentes teriam diminuição/aumento de V_PP e durações diferentes para garantir uma saída estável. Determine empiricamente o comportamento e a duração específicos do sistema necessários para uma produção estável antes de ter o primeiro participante do estudo.
4. Valide a mitigação baseada em ramping para efeitos auditivos. Verifique a forma de onda do sinal do drive no início e no final de cada PD para ver ramping. Ajuste (ou diminua incrementalmente) a saída do amplificador até zero, imerga totalmente o transdutor na água com o plano de saída (ou seja, lado de estimulação) ~1 polegada abaixo da superfície da água e voltado para cima, então ajuste (ou aumente incrementalmente) a saída do amplificador até 100%. A implementação infrutuosa do ramping fará com que as gotas de água sejam ejetadas da superfície da água, parecendo uma fonte, enquanto ramping bem-sucedido produzirá ondulações na superfície da água sem que as contas saiam dela.
5. Calibrar transdutor TUS para neuronavegação - exemplo de implementação: Monte um rastreador de ferramenta de neuronavegação no suporte do transdutor. No software de neuronavegação, em Janela, Calibrações de Ferramentas, clique em Nova Calibração para criar uma nova calibração para o transdutor TUS. Insira um nome após o nome de Calibração: e selecione o rastreador de ferramentas correto em Rastreador de ferramentas: Segure o transdutor montado com o rastreador de ferramentas contra o bloco de calibração, com o pino indicador de referência do bloco tocando e perpendicularmente ao centro do plano de saída do transdutor, pressione Iniciar Contagem Regressiva de Calibração, fique parado por 5 segundos e confirme que o software de neuronavegação deu Sucesso. Se não, repita essa última ação até que o Sucesso seja visto. Após concluir, feche as janelas de Editar Calibração e Calibração de Ferramentas .
   NOTA: Para usos subsequentes, substitua a ação Nova Calibração por um clique esquerdo simples na respectiva calibração sob a lista de Calibração de Ferramentas Existentes e clique em Recalibrar.
6. Terminar configurações de TUS - exemplo de implementação: Pressione o botão POWER do amplificador (não seu interruptor PRINCIPAL de ENERGIA ) para desligar sua saída quando o participante estiver pronto para o TUS, desconecte o osciloscópio do amplificador e conecte o transdutor à saída do amplificador.

6. Administração do TUS

1. Pule essa etapa se estiver usando o alvo que não seja baseado em simulação. Carregar o alvo de TUS baseado em simulação para a neuronavegação e realizar o registro de ressonância magnética do participante (Passos 4.7-4.10) - exemplo de implementação: Vá para a aba Sessões no software de neuronavegação se estiver usando o alvo baseado em simulação e o participante estiver pronto para TUS, Novo... menu suspenso e Sessão Online para abrir uma nova janela de sessão. Lá, na aba Alvos , clique com o botão esquerdo no alvo do mod Trajectória X e pressione Adicionar => para torná-lo um alvo para esta sessão. Em seguida, execute exatamente os Passos 4.7-4.10, depois vá para a aba Executar .
2. Configurar a neuronavigation para administração de TUS - exemplo de implementação: Abra pelo menos a visão Bullseye (Centrada na Bobina) ou Bullseye (Centrada no Alvo) na janela Executar , configure o Driver: para o transdutor TUS correto e selecione o alvo correto na lista Targets to Sample: no canto superior esquerdo.
3. Prepare o couro cabeludo participante para acoplamento de TUS - exemplo de implementação: Pente o cabelo para longe ao máximo, expondo o couro cabeludo aproximadamente na localização do transdutor de TUS, e crie uma linha de separação antero-posterior ao fazer isso. Aplique gel de ultrassom desgasificado ao longo dessa linha de separação, aplique pressão com o dedo centrado para fora na direção natural do cabelo para estourar bolhas de ar e saturar o cabelo. Dependendo do tamanho do transduttor, crie de 1 a 3 linhas de separação adicionais a ~1,5 cm de distância de cada lado da linha inicial e repita as ações acima. Em seguida, volte à linha inicial de despedida e repita as ações acima 4 vezes.
   NOTA: Esta etapa segue a recomendação prática⁷ do ITRUSST.
4. Acople o transdutor TUS ao participante - exemplo de implementação: Prenda o transdutor TUS na cabeça do participante e alinhe o transdutor ao alvo ajustando sua posição de modo que as três métricas exibidas em Bullseye (Centrado em Coil) ou Bullseye (Centrado no Alvo) fiquem o mais próximo possível de zero, enquanto desvios de distância < 1,5 mm, desvios de inclinação (pitch + roll) < 2 graus, e desvios rotacionais (yaw) < 1 grau podem ser usados como critérios operacionais quantitativos. Quando estiver satisfeito com a posição do transdutor, aperte levemente a alça. Certifique-se de que o participante esteja confortável e não esteja engasgado.
5. (Opcional, mas recomendado) Insira um fio termopar entre o transdutor e o couro cabeludo se for desejada uma avaliação de segurança online. Insira dentro do gel de ultrassom e, de preferência, próximo ao couro cabeludo e não à superfície do transdutor. Insira em direção a uma das bordas do transdutor e não pelo centro, de modo que a onda de ultrassom seja minimamente afetada enquanto monitora a temperatura do couro cabeludo em tópicos. Coloque fio termopar na cabeça para mantê-la no lugar caso haja movimento da cabeça. Use fita de papel para equilibrar a facilidade de remoção e a pegajosidade.
6. Inicie o TUS e registre a posição inicial do transdutor - exemplo de implementação: Pressione o botão POWER do amplificador para ligar sua saída e, assim, o TUS. Simultaneamente, pressione o botão Sample Now no canto inferior esquerdo da janela do software de neuronavegação para registrar a posição inicial do transduttor.
7. Registre a posição dos transdutors em todo o TUS e ajuste conforme necessário - exemplo de implementação: Aperte Sample Now durante o TUS conforme desejado para registrar a colocação do transduttor. Monitore de perto as três métricas em Bullseye (Centrado em Coil) ou Bullseye (Centrado em Alvo). Ajuste a posição do transdutor se ele se desviar do alvo, evidente pelas três métricas se afastando do zero (Figura 8).
8. Monitore a temperatura do couro cabeludo se for usado um termopar e intervenha se a leitura do termopar chegar a 43,3 °C (110 °F)²⁵ ou se o participante relatar sensação excessiva de calor.
   NOTA: Esse limiar de 43,3 °C (110 °F) no couro cabeludo serve para evitar queimaduras ≥ segundo grau. Os limites de dose térmica intracraniana são abordados pelas diretrizes^{de segurança 18} do ITRUSST, que afirmam que os efeitos térmicos são considerados seguros pelo ITRUSST se algum dos três for atendido: aumento da temperatura intracraniana ≤ 2 °C a qualquer momento, dose térmica ≤ 0,25 CEM43, ou tempo máximo de exposição dependendo do nível de índice térmico (TI, 40 min para 2,0 < TI ≤ 2,5, e 10 minutos para 2,5 < TI ≤ 3,0). Consulte as diretrizes de segurança do ITRUSST para cálculos térmicos intracranianos. TI geralmente significa TI cranial (TIC) para a maioria dos sistemas^{TUS 18}, mas TI para tecido mole (TIS) e osso em foco (TIB) também são definidos. Determine se TIC, TIS ou TIB corresponde melhor ao cenário.

7. Finalização do TUS

1. Finalize o TUS, verifique o bem-estar do participante e limpe o couro cabeludo do participante - exemplo de implementação: Pressione o botão POWER do amplificador para desligar sua saída e, assim, o TUS. Retire o transdutor e todos os equipamentos/equipamentos na cabeça, inspecione o couro cabeludo em busca de vermelhidão e examine o participante para qualquer desconforto ou evento adverso. Depois de garantir que não há desconforto ou evento, ou após responder/resolver as perguntas levantadas, limpe suavemente o gel de ultrassom o máximo possível.
2. Finalizar e exportar dados da neuronavegação - exemplo de implementação: Aperte Finalizar na janela de neuronavegação e salve o projeto por Arquivo e Salve Projeto. Selecione a sessão atual na lista Sessões: clicar em Revisar, selecionar arquivo de texto Brainsight (.txt) no menu suspenso Export... no canto inferior esquerdo da janela que se abre, certifique-se de que Orientação (3 vetores direcionais) esteja selecionada e Fixar para: menu suspenso é Nada, configure outras configurações conforme desejado e clique em Salvar para exportar a localização e orientação registrada do TUS durante a estimulação.
   NOTA: Não é obrigatório garantir que não haja espaços em cada nome de amostra, mas é uma boa prática.

8. Avaliação de segurança offline (opcional, mas recomendada)

1. Adquirir o gradiente de aquisição rápida (MPRAGE) preparado por magnetização T1 tridimensional e uma sequência de imagem por tensor de difusão (DTI) no mínimo. Imagens de recuperação por inversão atenuada por fluido (FLAIR) ponderadas em T2, na mesma resolução do MPRAGE T1, serão opcionais, mas valiosas, especialmente para o AVC. Adquira antes e depois do TUS.
   NOTA: Escolha parâmetros de neuroimagem e scanner conforme desejar, este protocolo tem T1 MPRAGE: 1 mm de resolução isotrópica espacial, 2400 ms TR, 3 ms TE e 900 ms TI; DETALHE: resolução espacial isotrópica de 1 mm, 5000 ms TR, 90 ms TE e 1806 ms TI; e DTI: aquisições de imagem duplo spin-echo, ecoplanar, resolução espacial isotrópica de 2 mm, fator b = 1000 s/^{mm 2} e espessura de corte de 2,5 mm. Veja a Tabela de Materiais para o scanner utilizado.
2. Converta imagens raw para NIFTI (ou seja, formato .nii), se não for padrão, usando um método de escolha. Veja a Tabela de Materiais para exemplos de métodos.
3. Separe a imagem DTI 4D e obtenha uma máscara cerebral - exemplo de implementação: Instale o software de processamento^{DTI 26} se ainda não estiver instalado (veja a Tabela de Materiais), execute o fslsplit no NIFTI de difusão 4D e execute bet no arquivo resultante vol0000 para uma máscara^{cerebral 27}.
4. Correto para distorções induzidas por correntes de Foucault na imagem DTI - exemplo de implementação: Criar um arquivo index.txt com uma única linha de N 1s com um único espaço entre eles (por exemplo, para N = 5, index.txt conteria apenas: 1 1 1 1 1 1) onde N é o número de valores no arquivo bval, e execute o eddy²⁸ com --imain, --mask, --bvecs, --bvals, --index, --acqp, --data_is_shelled, --repol e --out opções, onde o arquivo de texto índice é a entrada para --index, e uma única linha de arquivo de texto delineado por espaço contendo 0, 1, 0, 0,08 (ou seja, 0 1 0 0,08) é a entrada para --acqp.
5. Pule essa etapa para adultos neurotípicos. Delinee a lesão para uma máscara de lesão - exemplo de implementação: Use uma ferramenta de segmentação de lesão preferida ou desenhe manualmente no FLAIR uma máscara da lesão se estiver estudando uma coorte com lesão, use T1 se FALIR não estiver disponível e salve a máscara como NIFTI.
6. Segmentar as imagens anatômicas de ressonância magnética - exemplo de implementação: Instale o software de processamento de RM (veja Tabela de Materiais) se ainda não estiver instalado, execute o spm fmri na janela de comandos da plataforma de programação (veja Tabela de Materiais), pressione o botão Segmento , menu suspenso SPM , Ferramentas, Clínica e Normalização de segmentos para abrir a janela de segmentação. Insira T1 em Anatomicos, máscara de lesão em mapas de lesão (deixe em branco se neurotípico), FLAIR para Exames Patologicos, e pressione o triângulo verde para iniciar a^{segmentação 29}.
7. Ajuste um modelo de tensor de difusão à imagem DTI corrigida por eddy para um mapa escalar de DTI - exemplo de implementação: execute dtifit³⁰ com as opções --data, --out, --mask, --bvecs, --bvals e --verbose ativadas, onde a entrada para --out no Passo 8.4 (o eddy step) é a entrada para --data. Execute o fslsplit na imagem de difusão 4D após o dtifit para criar um novo vol0000.
8. Obter uma localização representativa e orientação do transdutor durante a administração do TUS - exemplo de implementação: Use um script personalizado ou pipeline^{publicado 31} no arquivo de texto do software de neuronavegação (Passo 7.2), importe essa representação no software de neuronavegação pela aba Alvos , Novo... menu suspenso no canto superior esquerdo, e Importar do Arquivo... a representação, clique com o botão esquerdo sob a lista de Nomes , e aperte Ir para confirmar que está em um local e orientação sensatos.
   NOTA: Certifique-se de que este arquivo de software de neuronavegação seja construído sobre a imagem da ressonância magnética pré-TUS. Certifique-se de que a localização e orientação do transdutor derivado do software de neuronavegação tenham coordenadas no mesmo espaço da imagem de ressonância magnética na qual a simulação acústica é executada.
9. Obter uma região de interesse (ROI) para tecido estimulado por TUS - exemplo de implementação: Execute uma simulação acústica realizando as etapas 3.1 - 3.2 e 3.6 - 3.8. Execute Calculate Fields uma vez durante o Step 3.8.
10. Alinhar as varreduras anatômicas pré-TUS e máscaras de segmentos de tecido do Passo 8.6 ao mapa escalar DTI pré-TUS, b0 (do Passo 8.7) - exemplo de implementação: Use o coregister-est&reselice do software de processamento de ressonância magnética, onde o vol0000 é a referência, o pré-TUS T1 é a fonte, e os arquivos c1 a c5 do Passo 8.6 para o pré-TUS são inseridos em outras imagens. Alinhe pós-TUS, dtifit-ed vol0000 para pré-TUS, dtifit-ed vol0000 usando a mesma ferramenta (ou seja, referência = pré-TUS, dtifited vol0000 e source = pós-TUS, dtifit-ed vol0000), depois alinhe as máscaras pós-TUS T1 e segmento do Passo 8.6 para qualquer um dos vol0000 de forma semelhante.
11. Intersecte o ROI estimulado por TUS (Passo 8.9) com as máscaras de cinza e substância branca para o ROI final da leitura do ADC - exemplo de implementação: Binarize máscaras de matéria cinzenta e substância branca rodando fslmaths rc1_* -thr 0.5 -bin ID_GM.nii e fslmaths rc2_* -thr 0.5 -bin ID_WM.nii, combine as máscaras resultantes executando fslmaths ID_GM.nii -adicione ID_WM.nii ID_WGM.nii, e obter a interseção entre essa máscara combinada e o campo acústico simulado executandof-slmaths *_FullElasticSolution.nii.gz -mas ID_WGM.nii ID_roi_WGM.nii , onde *_FullElasticSolution.nii.gz é a saída da simulação do Passo 8.9.
12. Sobrepor a máscara final de ROI (Passo 8.11) e obter ADCs pré e pós-TUS - exemplo de implementação: Sobrepor este ID_roi_WGM.nii ao vol0000 dtifit-ed pré e pós-TUS no visualizador de ressonância magnética (veja Tabela de Materiais), depois desenhar, Descritivo, registrar o valor na MEDIAN, e obter a mudança pós-vs-pré-ADC calculando a (pós)/pré-percentagem usando as medianas pré e pós-TUS.

9. Avaliação das variações da ECS induzidas pelo TUS

Os passos desta seção são modulares. Realize-as para avaliar o CSE na frequência e nos momentos desejados em relação ao TUS. Escolha a frequência e os pontos de tempo com base na pergunta específica de pesquisa. Veja a Tabela de Materiais para os modelos de estimuladores e bobinas TMS e hardware de aquisição EMG.

1. Avalie o CSE no músculo cuja representação cortical recebe TUS e realize o Passo 4.4 nesse músculo para preparar eletrodos EMG.
2. Execute os Passos 4.5-4.11 para preparar a neuronavegação.
3. Determine a configuração da bobina TMS (posição e orientação) que melhor estimula o músculo de interesse, ou seja, o hotspot.
   1. Use o hotspot TMS obtido durante o direcionamento TUS não baseado em simulação se o direcionamento TUS não for baseado em simulação - exemplo de implementação: no software de neuronavegação, na lista abaixo Alvos para amostragem:, clique com um clique esquerdo na amostra que produziu a resposta EMG mais forte para torná-la um alvo de neuronavegação.
      NOTA: Veja a Tabela de Materiais para os modelos de estimulador e bobina TMS e hardware e software de aquisição EMG. Como exemplo de implementação, a aquisição EMG tinha taxa de amostragem EMG de 5000 Hz, filtro passa-banda de 20 a 20000 Hz, filtro de entalhe de 60 Hz, ganho de 1000x, rejeição manual de artefatos, e utilizou o algoritmo de detecção MEP descrito em Soda et al., 2020-24.
   2. Se o direcionamento do TUS for baseado em simulação, execute os Passos 4.12 a 4.16 para identificar o hotspot.
4. Determinar o limiar do motor de 1 mV (MT_{1 mV}) - exemplo de implementação: Coloque a bobina TMS alinhada ao ponto quente obtido acima minimizando as três métricas exibidas na janela do alvo (desvios de distância < 1,5 mm, desvios de inclinação (pitch + roll) < 2 graus e desvios rotacionais (yaw) < 1 grau), determine a saída do estimulador TMS necessária para provocar MEPs de 1 mV, ou seja, MT_1mV, usando um algoritmo de escolha (por exemplo, PEST³²). Se 1 mV MEP não for possível atingir 100% da saída máxima do estimulador (MSO), determine a porcentagem de MSO necessária para MEPs de 0,05 mV.
   NOTA: A porcentagem de MSO necessária para MEPs de 0,05 mV não é MT_1mV (veja o Passo 9.5). Além disso, ao realizar essa seção mais de uma vez, esse passo de_1mV de MT só precisa ser determinado na primeira vez, a menos que o próprio_{MT 1mV} seja escolhido para ser usado como medida global de CSE.
5. Fornecer 20 pulsos TMS simples na MT_1mV com intervalo interpulso > 10 s²³.
   NOTA: Se MT_1mV não for alcançável, mas_{MT 0,05mV} for, use 100% MSO. Se tanto MT_1mV quanto MT_0,05mV não forem alcançáveis, esse participante não será elegível para essa avaliação CSE.

10. Avaliação das variações da MSL induzidas pelo TUS

NOTA: Os passos desta seção são modulares. Realize-as para avaliar o MSL na frequência e nos pontos de tempo desejados em relação ao TUS. Escolha a frequência e os pontos de tempo com base na pergunta específica de pesquisa.

1. Use software/linguagem de escolha (veja Tabela de Materiais para exemplos) para construir uma tarefa de produção de sequência discreta, onde um teclado físico de cinco botões é colocado em frente a uma tela de computador que mostra cinco caixas vazias horizontais equidistantes, de 2 cm x 2 cm, alinhadas com os cinco botões do teclado. Faça uma conta aparecer em uma caixa de cada vez, desaparecer quando o botão correspondente da caixa for pressionado e aparecer em outra caixa. Faça a conta aparecer nas cinco caixas sem repetição, formando uma sequência de aparição, por exemplo, a caixa número 1-4-3-2-5. Peça para a tarefa repetir uma sequência doze vezes. Tenha uma página de boas-vindas antes do início da tarefa e faça a transição dessa página para a tarefa iniciada com o pressionar de qualquer tecla. Tenha um gravador de tempo de resposta que acompanhe o tempo decorrido entre cada aparição da conta e o pressionar correspondente do botão. Um exemplo de pseudocódigo seria
   boxes = [1, 2, 3, 4, 5]
sequence = [1, 4, 3, 2, 5]
repeats = 12
rt_log = []
print("Welcome! Press any key to begin.")
wait_for_any_key()
show_boxes() # draw empty boxes
for r in range(repeats):
  for target in sequence:
    show_bead(target) # bead in current box
    start = current_time()
    while True:
      key = wait_for_key()
      if key == target: # correct button
        rt = current_time() - start
        rt_log.append(rt)
        clear_bead()
        break
      else:
        continue # ignore wrong presses
print("Task complete. Thank you!")
save(rt_log, "results.csv")
   NOTA: O número de botões/caixas e a repetição da sequência podem variar dependendo do desenho do experimento. Considerações são o nível de função na coorte de interesse e o equilíbrio das sequências entre os participantes, ou seja, o número de participantes deve ser divisível pelo número de sequências possíveis. O intervalo entre o desaparecimento da conta e o próximo aparecimento, e entre o fim de uma sequência e o início da seguinte, também depende do desenho do experimento.
2. Faça o participante sentar com uma postura confortável. Coloque o teclado em um local de alcance confortável com a mão paretica do participante.
3. Explique ao participante que: "Haverá cinco caixas na tela. Uma conta/círculo aparecerá em uma das caixas. Quando você vir a conta/círculo, pressione a tecla correspondente usando a mão afetada pelo traço. Faça isso o mais rápido que puder, pois vamos cronometrar, ok? Alguma pergunta?"
   NOTA: Evite a menção a "sequência" em qualquer forma. A MSL precisa ser aprendizagem implícita para ser uma medida do estado do córtex^{motor 33}. A menção a "sequência" aumenta a chance de os participantes indexarem cada caixa e lembrarem explicitamente da sequência, anulando a capacidade da MSL de avaliar o estado do córtex motor.
4. Atribua uma sequência aleatória ao participante após responder a qualquer pergunta que ele possa ter, e diga que "Você pode pressionar qualquer tecla para começar quando estiver pronto."
5. Monitore a postura do participante durante a tarefa e intervenha se houver algum sinal de queda. Ao mesmo tempo, se o participante usar a outra mão/braço para ajudar, lembre-o de que apenas a mão parética deve ser usada para essa tarefa.
6. Verifique se o participante está bem concluído a tarefa, remova o teclado/tela, elogie o participante pelo desempenho e expresse gratidão.

11. Análise de dados

NOTA: A análise geral dos dados depende do desenho experimental. Os passos abaixo fornecem instruções para uma unidade básica de medida CSE/MSL, juntamente com um exemplo simples e canônico de porcentagem pós-pré-comparação.

1. Análise do CSE
   1. Verifique cada traço EMG para um MEP identificável que tenha latência de início de pelo menos 19 ms (para APB), calcule a amplitude de pico a pico entre o início e o deslocamento de cada MEP e calcule a amplitude mediana de pico a pico para os 20 MEPs dentro do bloco. Essa amplitude mediana será a medida da CSE para esse bloco.
      NOTA: O início da latência MEP depende do músculo, do estado muscular (repouso vs. ativo) e do distúrbio neurológico, por exemplo, membro superior: 10-40 ms³⁴; Membro inferior: 30-45 ms^35,36. Consulte a literatura se o músculo de interesse não for o APB. O início/deslocamento de uma MEP pode ser determinado usando o método de limiar descrito em Soda et al., 2020²⁴.
   2. Obtenha a porcentagem de mudança pós-CSE subtraindo a medida pós-CSE da medida pré-CSE e dividindo essa diferença pela medida pré-CSE.
2. Análise MSL
   1. Calcule o tempo de resposta mediano dentro de cada repetição de sequência, ou seja, mediana dos cinco pressionamentos de botão, e então calcule a mediana das doze medianas dentro da repetição. Essa "mediana da mediana" será a medida do MSL para esse bloco.
   2. Obtenha a porcentagem pós-pré-mudança MSL subtraindo a medida pós-MSL da medida pré-MSL e dividindo essa diferença pela medida pré-MSL.

Results

O direcionamento TUS baseado em simulação define primeiro manualmente a posição inicial do transdutor com base na proximidade ao alvo intracraniano e perpendicularidade ao crânio, e utiliza essa posição inicial e especificações do transdutor para resolver o campo acústico intracraniano. Em seguida, calcula a discrepância entre o alvo de estimulação pretendido e o foco do campo acústico, atualiza a posição do transdutor na direção oposta dessa discrepância, resolve para o campo acústico u...

Discussion

Houve um entusiasmo significativo em pesquisa pela aplicação da TUS em condições neurológicas; no entanto, existe a necessidade de maior rigor científico e replicação dos resultados. Uma TUS bem-sucedida no tecido-alvo pretendido depende de várias etapas críticas. Primeiro, a sensibilidade à transmissão do transdutor precisa ser corretamente caracterizada. As opções incluem seguir a Etapa 2 desse protocolo, terceirizar para um colaborador e utilizar o serviço do fornecedor. A segunda eta...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Impressora 3D	UltiMaker	S3	Para ser usado na fabricação do suporte do transduttor.
Ressonância magnética 3T	General Electric	Signa UHP
BabelBrain	Samuel Pichardo (Universidade de Calgary)	Versão 0.4.3	Referido no texto principal como "software de mira TUS." Acessível em https://proteusmrighifu.github.io/BabelBrain/
Brainsight	Pesquisa Rebelde		Referido no texto principal como "software/sistema de neuronavegação." Para uso para direcionamento TUS/TMS, vem com um computador Mac, uma câmera infravermelha e fiduciais.
amplificador EMG e conversor analógico-digital	Cambridge Electronic Design Ltd	CED 1902,   MICRO4	Para ser usado para adquirir, amplificar e digitalizar sinais EG.
DCM2NIIX	Christopher Rorden	V1.0.20250506	Converter neuroimagens de DICOM para NIFTI. Acessível em https://pypi.org/project/dcm2niix/
E-prime	Ferramentas de Software de Psicologia	E-prime 3.0	Referido no texto principal como um software de exemplo para MSL. A ser usado para criar a tarefa de produção de sequências discretas.
Fiduciários e faixa de cabeça	Pesquisa Rebelde	ST-1275 (rastreador de sujeito), LCT-494 (rastreador de bobina grande), P-1528 (ponteiro)	Para ser usado em conjunto com o Brainsight para neuronavegação.
FSL	Universidade de Oxford		Referido no texto principal como "software de processamento DTI." Para ser usado no opcional, mas recomendado, Passo 8 para processamento de imagem por difusão.
Gerador de funções	Tecnologias Keysight	33210A	Para gerar o sinal de acionamento para o transdutor TUS.
Hidrofone	Onda Corporation	HNA-0400	Para medir a saída de pressão do transdutor.
ITK-SNAP	Laboratório de Computação e Ciência de Imagens da Penn	ITK-SNAP 4.0	Referido no texto principal como "visualizador de ressonância magnética". Acessível em https://www.itksnap.org/pmwiki/pmwiki.php?n=Downloads.SNAP4
K-Wave	Bradley Treeby, Ben Cox e Jiri Jaros	K-Wave Versão 1.4	Referido no texto principal como "software de simulação acústica de código aberto." Acessível em http://www.k-wave.org/
MATLAB	MathWorks Inc.	R2024b	Referido no texto principal como a "plataforma de programação." Acessível em https://www.mathworks.com/products/matlab.html
MRIcroGL	Ferramentas e Ferramentas de NeuroImagem Colaboratório de Recursos	v1.2.20220720	Converter neuroimagens de DICOM para NIFTI. Acessível no https://www.nitrc.org/projects/mricrogl/
MRIcron	Ferramentas e Ferramentas de NeuroImagem Colaboratório de Recursos	v1.0.20190902	Referido no texto principal como "visualizador de ressonância magnética". Acessível em https://www.nitrc.org/projects/mricron
Osciloscópio	SIGLENT Technologies	SDS 1202X-E	A ser usado para medir a entrada do transdutor TUS e registrar medições de hidrofone.
Python	Fundação de Software Python	Python 3.13	Referido no texto principal como uma linguagem de exemplo para MSL. A ser usado para criar a tarefa de produção de sequências discretas.
Amplificador de potência RF	Instrumentação RF/Micro-ondas em AR	50A250	A ser usado para amplificar a saída dos geradores de funções até a amplitude exigida pelo transdutor TUS.
Sinal	Cambridge Electronic Design Ltd	Signal 7.05a (x86)	Referido no texto principal como "software de aquisição EMG." Para ser usado para adquirir sinais EMG do conversor analógico-digital para um computador.
SimNIBS	Axel Thielscher (Universidade Técnica da Dinamarca)	Versão 4.5	Referido no texto principal como "software e-field". Acessível em https://simnibs.github.io/simnibs/build/html/index.html
SPM12	Laboratório de Imagem Funcional (University College London)		Referido no texto principal como "software de processamento de ressonância magnética". A ser usado no opcional, mas recomendado, Passo 8 para processamento de imagens de ressonância magnética.
Estimulador TMS e bobina	Magstim Inc.	BiStim2, 70 mm em figura de oito	Para ser usado na aplicação de pulsos TMS.
Transdutor	Blatek Industries	AT32080
Montagem transdutora	Equipe da Duke University		Montagem de transdutor impressa em 3D em ácido poliactic (PLA) e adicionada com tiras de tecido.
Gel de ultrassom	Laboratórios Parker	Aquasonic 100	A ser aplicado entre o transdutor do TUS e o couro cabeludo participante.
Tanque de água e sistema de posicionamento de 3 eixos	Onda Corporation	Sistema de Varredura de Hidrofones AIMS III	Personalizado com a empresa.