Artigo de método

Modelagem de doenças mitocondriais usando organoides cerebrais: um foco na encefalomiopatia mitocondrial, acidose láctica e episódios semelhantes a derrames

DOI:

10.3791/69303

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10 de outubro de 2025

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1Department of Molecular Genetics, Kitasato University School of Medicine, 2Molecular Genetics Unit, Kitasato University Graduate School of Medical Science, 3Department of Otolaryngology, Head & Neck Surgery, Gene Therapy for Hearing Impairment and Deafness, Tübingen Hearing Research Center, University of Tübingen, 4Department of Physiology, Keio University School of Medicine, 5Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University Medical Center, 6Institute for Disease Modeling, Kurume University School of Medicine, 7Department of Diabetes, Endocrinology and Nutrition, Graduate School of Medicine, Kyoto University, 8Department of Clinical Biology and Hormonal Regulation, Tohoku University Graduate School of Medicine, 9Keio University Regenerative Medicine Research Center

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os organoides cerebrais servem como um modelo valioso para estudos de encefalomiopatia mitocondrial, acidose láctica e episódios semelhantes a AVC (MELAS), oferecendo insights sobre sua fisiopatologia subjacente e fornecendo uma plataforma para triagem de drogas. Organoides derivados de linhagens celulares com níveis variados de heteroplasmia de genes causadores de doenças exibem diferenças fenotípicas significativas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Encefalomiopatia mitocondrial, acidose láctica e episódios semelhantes a AVC (MELAS) são distúrbios mitocondriais mais comumente causados por uma variante m.3243A>G no tRNALeu mitocondrial. Para investigar a fisiopatologia do MELAS, geramos organoides cerebrais a partir de múltiplas linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) derivadas de um paciente com MELAS portador da variante m.3243A>G. Essas linhagens compartilham um fundo genético nuclear idêntico, mas diferem em seus níveis de heteroplasmia envolvendo a variante m.3243A>G. Observamos diferenças significativas no tamanho do organoide, morfologia e eficiência da indução neural, que se correlacionaram com o grau de heteroplasmia. Os neurônios dissociados dos organoides foram transferidos para um sistema de cultura 2D, que é conveniente e adequado para triagem de drogas de alto rendimento. Os organoides também exibiram diferenças significativas na formação de redes neurais, dependendo dos níveis de heteroplasmia. Nossos resultados sugerem que os modelos organoides baseados em iPSC derivados de pacientes representam uma plataforma útil para estudar os mecanismos MELAS e para a triagem de drogas. Este vídeo apresenta métodos abrangentes e fáceis de usar, incluindo protocolos para geração de organoides e avaliação de fenótipos.

Introdução

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Miopatia mitocondrial, encefalopatia, acidose láctica e episódios semelhantes a AVC (MELAS) são doenças mitocondriais caracterizadas por disfunção neurológica, episódios semelhantes a AVC e vários sintomas sistêmicos. A causa mais comum é uma variante m.3243A>G no gene tRNA da leucina mitocondrial, MT-TL11. Acredita-se que essa variante prejudique a modificação da taurina no anticódon, reduzindo assim a eficiência da tradução da leucina e contribuindo para a disfunção mitocondrial no MELAS 2,3,4. Notavelmente, melhorias nos sintomas foram relatadas após a administração de altas doses de taurina 5,6. No entanto, a presença de não respondedores sugere que mecanismos fisiopatológicos adicionais, ainda não identificados, podem contribuir para a doença em indivíduos com a variante m.3243A>G.

Para elucidar os mecanismos da doença causados por variantes genéticas, é ideal usar modelos experimentais nos quais todas as variáveis são idênticas, exceto a variante causadora, permitindo comparações fenotípicas precisas. Linhagens celulares editadas pelo genoma e modelos animais com variantes corrigidas são frequentemente usados como controles para distúrbios genéticos nucleares. No entanto, o reparo de variantes do mtDNA permanece tecnicamente desafiador, mesmo com tecnologias avançadas de edição de genoma7. Portanto, o estabelecimento de modelos experimentais com fundos nucleares idênticos permanece um desafio. Para resolver esse problema, utilizamos duas linhagens de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) derivadas do mesmo paciente com MELAS que diferem apenas em seus níveis de heteroplasmia (ou seja, a proporção de DNA mitocondrial carregando o MT-TL1 m.3243A>G variante8) e geramos organoides cerebrais como um modelo de doença. Embora os níveis de heteroplasmia possam flutuar durante a passagem ou diferenciação celular, potencialmente influenciando os fenótipos e causando variabilidade lote a lote nos resultados experimentais, as células derivadas do paciente que carregam variantes do gene mitocondrial permanecem valiosas para investigar a patogênese da doença.

Neste estudo, geramos organoides cerebrais a partir de iPSCs derivados de um paciente com MELAS e investigamos sua fisiopatologia para entender melhor os mecanismos da doença. Usando duas linhagens de iPSC com altos e baixos níveis de heteroplasmia, observamos diferenças significativas na eficiência da indução neural, que se correlacionou com o grau de heteroplasmia. Nossas descobertas sugerem que os organoides cerebrais baseados em iPSC derivados de pacientes fornecem uma plataforma valiosa para elucidar os mecanismos subjacentes ao MELAS e para facilitar a triagem de drogas.

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Protocolo

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As duas linhagens de iPSC (2-6 e 2-8) foram derivadas dos fibroblastos do mesmo paciente com MELAS usando métodos bem estabelecidos8. Eles diferem apenas em seus níveis de heteroplasmia. A linhagem 414C2 iPSC estabelecida a partir de um indivíduo saudável foi usada como controle. O protocolo utilizado neste estudo seguiu as diretrizes do Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade Kitasato (#G22-02).

1. Cultura de células

  1. Descongelamento de estoques de células congeladas
    1. Prepare placas de 6 poços revestindo com laminina de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Aquecer o meio de cultura para iPSCs sem alimentador contendo 10 μM de inibidor de ROCK a 37 °C.
    3. Retirar o frasco para injetáveis de iPSC congelado do tanque de azoto líquido (LqN2) e descongelar rapidamente num banho-maria a 37 °C.
    4. Transfira a suspensão descongelada para 10 mL de meio pré-aquecido. Centrifugue a 120 × g durante 5 min à temperatura ambiente (22 °C).
    5. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet batendo no tubo. Adicione células frescas médias e sementes em placas de 6 poços pré-revestidas com laminina. Incubar a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.
  2. Variação média
    1. Substitua o meio (sem inibidor de ROCK) a cada 1-2 dias.

2. Geração de organoides cerebrais

  1. Início da diferenciação (Dia 0)
    1. Remova o meio das placas de cultura iPSC (~ 70-80% confluente). Lave as células com PBS.
    2. Adicionar a solução enzimática e incubar a 37 °C durante 5 min.
    3. Adicione meio para interromper a reação. Transfira as células para um tubo de 15 mL. Centrifugue a 190 × g durante 5 min à temperatura ambiente (22 °C).
    4. Ressuspenda o pellet em 1 mL de meio de diferenciação contendo 30 μM de inibidor de ROCK, 5 μM de SB431542 e 2,5 μM de IWP-2.
      NOTA: O meio básico é o mesmo usado na etapa 1.1.2.
    5. Conte as células. Semeie 3 × 103 células em 100 μL por poço em placas em forma de U, 96 poços e baixa fixação. Incubar durante 6 dias a 37 °C, 5% CO2.
  2. Variação média (Dia 6)
    1. Transferir organoides (do passo 2.1.5) de uma placa de 96 poços para uma placa de 10 cm utilizando uma pipeta de diâmetro largo. Adicione 50 μL de meio (DMEM/F12 com 1% de N2, substituto de glutamina a 1% de NEAA, 2,5 μM de IWP-2, 5 μg/mL de sulfato de heparano e 1% de PS) a cada poço de uma nova placa de 96 poços.
      NOTA: Use pipetas de diâmetro largo durante os experimentos ao transferir organoides para evitar interromper sua estrutura 3D. Além disso, as pipetas de 8 canais são úteis para realizar experimentos com rapidez e precisão.
    2. Colete organoides em tubos de 2 mL. Remova cuidadosamente o meio para não aspirar os organoides e adicione 1,5 mL de DMEM/F12. Repita 3x para lavar os organoides.
    3. Remova o meio e adicione 500 μL de meio fresco aos tubos com organoides. Transfira todos os organoides para um prato de 10 cm e, em seguida, adicione 5 mL de meio para facilitar a coleta de cada organoide.
    4. Pegue um único organoide usando uma micropipeta ajustada para 50 μL e transfira-o para um poço de placa de 96 poços. Repita até que todos os organoides sejam transferidos para a placa de 96 poços (volume final de 100 μL). Incubar durante 3 dias a 37 °C, 5% CO2.
  3. Variação média (Dia 9)
    1. (Opcional) Transfira organoides para um prato de 10 cm ao usar pipetas de 8 canais. Pule a etapa 2.3.1 ao usar micropipetas de canal único e prossiga para a etapa 2.3.2.
    2. Colete organoides em tubos de 2 mL. Lave 3x com DMEM/F12 conforme a etapa 2.2.2.
    3. Ressuspender em meio de diferenciação (1:1 DMEM/F12 e neurobasal) contendo 1% de N2, 2% de B27 sem vitamina A, 100 μM de 2-mercaptoetanol (ME), 2,5 μg/mL de insulina, 1% de substituto de glutamina, 0,5% de NEAA e 1% de extrato de membrana basal.
      NOTA: Prepare pequenas alíquotas de extrato de membrana basal para uso único e armazene a -20 ° C até que seja necessário. Descongele o extrato a 4 °C sem permitir que exceda 8 °C, depois misture em meio frio e aqueça o meio em temperatura ambiente por aproximadamente 30 min.
    4. Transfira ~ 10 organoides por poço para uma placa de 6 poços. Ajuste o volume final do meio para 1 poço a 2 mL. Cultivar estaticamente por 6 dias a 37 °C, 5% CO2.
  4. Variação média (Dia 15)
    1. Colete organoides em tubos de 15 mL. Deixe o tubo intacto até que todos os organoides tenham assentado. Remova o sobrenadante e adicione um meio de diferenciação fresco (o mesmo que o passo 2.3.3, mas com B27 + vitamina A).
      NOTA: Normalmente, os organoides se depositam no fundo do tubo sem centrifugação. No entanto, pequenos organoides derivados de iPSCs de pacientes podem não afundar com eficiência. Nesse caso, centrifugue os tubos a 120 × g por 3 min em temperatura ambiente para coletar os organoides.
    2. Transfira ~ 10 organoides por poço para uma placa de 6 poços. Cultivar estaticamente por 15 dias a 37 °C, 5% CO2.
    3. Substitua o meio a cada 5-7 dias até o dia 30.

3. Dissociação de organoides cerebrais para cultura 2D (Dia 30)

  1. Placas de revestimento com poli-L-ornitina (PO)
    1. Prepare a solução estoque de PO dissolvendo 10 mg de PO em 66,7 mL de H2O e faça pequenas alíquotas para uso único. Armazene-os a -20 °C até o uso.
    2. Diluir a solução-mãe PO 1:5 com H2O e revestir as placas de cultura com a solução diluída. Incubar durante a noite a 37 °C.
  2. Revestimento de laminina
    1. Remova o PO e lave os poços 3 x 5 min com PBS.
    2. Adicione laminina (1:1.000 em PBS) e incube a 37 ° C por 3 h ou durante a noite.
      NOTA: A solução estoque de laminina é de 1 mg / mL. Preparar alíquotas pequenas e conservar a -80 °C até serem necessárias.
  3. Dissociação em neurônios únicos
    1. Descongelar a solução de dissociação a 4 °C durante 1 h antes da utilização.
    2. Transfira os organoides para um tubo de 15 mL e deixe o tubo intacto até que todos os organoides tenham assentado. Remova o sobrenadante e adicione 5mL de PBS para enxaguar os organoides.
    3. Depois de remover o PBS, adicione 1 mL de solução enzimática e pipete suavemente 1–2x. Incubar a 37 °C durante 5 min; pipeta várias vezes. Se necessário, incube por mais 2–3 min. Pipete novamente para completar a dissociação.
    4. Centrifugue a 200 × g por 5 min. Remova o sobrenadante, adicione 1 mL de solução de dispersão e pipeta.
    5. Solução de isolamento de camada abaixo e centrifugue a 200 × g por 5 min.
    6. Adicione 1 mL de meio neuronal (neurobasal com 1% de B27, 0,25% de substituto de glutamina, 1% de PS) e misture. Passe a suspensão através de um filtro de 70 μm para um tubo de 50 mL.
    7. Conte as células. Células de sementes a 1 × 105 células/cm2 em placas revestidas de PO/laminina. Substitua o meio a cada 4-7 dias até o dia 60.

4. Colheita de células e organoides para análise celular e molecular

  1. Fixação organoide para imunofluorescência (Dia 30)
    1. Colha organoides (etapa 2.4.3) em microtubos.
    2. Remova o meio com cuidado para não aspirar organoides e adicione 1 mL de PBS para enxaguar os organoides.
    3. Remova o PBS com cuidado para não aspirar organoides e adicione 4% de paraformaldeído (PFA) para fixar por 30 min em temperatura ambiente.
    4. Lave 3x com PBS.
    5. Conservar a 4 °C até à utilização.
  2. Coleta de organoides para RT-qPCR (dia 30)
    1. Transfira organoides (etapa 2.4.3) para microtubos. Lavar com PBS conforme descrito no passo 4.1.2.
    2. Adicionar tampão de lise e congelar em azoto líquido (LqN2). Conservar a -80 °C até à utilização.
  3. Fixação celular para imunofluorescência (Dia 60)
    1. Remova o meio de cultura e adicione PBS para lavar as células.
    2. Fixe em 4% de PFA por 15 min em temperatura ambiente.
    3. Remova o PFA e adicione PBS às células de lavagem. Repita esta etapa 3x.
    4. Conservar a 4 °C até à utilização.

5. RT-qPCR

  1. Extraia o RNA total dos organoides de acordo com as instruções do fabricante do kit.
  2. Sintetize cDNA a partir de 1 μg de RNA total preparado na Etapa 5.1 de acordo com as instruções do fabricante do kit em um volume total de reação de 20 μL.
  3. Realize PCR quantitativo usando os seguintes primers: FOXG1_forward: CGCCAGATTTCCATGTGTGC; FOXG1_reverse: GTTCTCAAGGTCTGCGTCCA; ACTB_forward: TGAAGTGTGACGTGGACATC; ACTB_reverse: GGAGGAGCAATGATCTTGAT. Configure a concentração final para cada reação da seguinte forma: 1x master mix fluorescente, primer direto de 0,25 μM, primer reverso de 0,25 μM. O volume total da reação é de 15 μL, incluindo 0,2 μL de cDNA da Etapa 5.2. Utilizar as seguintes condições de PCR: desnaturação inicial a 95 °C durante 1 min; 40 ciclos de 95 °C durante 15 s e 60 °C durante 30 s.
  4. Normalize a expressão FOXG1 para ACTB como o controle interno.

6. Coloração de imunofluorescência

  1. Incube organoides (Dia 30) em sacarose a 10% por 1 h a 4 ° C, depois 30% de sacarose por ≥3 h a 4 ° C.
  2. Monte organoides em meio de incorporação e prepare a criossecção (10 μm) usando criostato. Armazene as seções em vidros deslizantes a -20 ° C até o uso.
  3. Remova o meio de incorporação por lavagem PBS (2 x 5 min).
  4. Permeabilize em PBST a 0,3% por 10 min. Lave com PBS.
  5. Bloqueio em soro de cabra normal a 10% em PBST a 0,1% por 1 h. Incubar durante a noite a 4 °C com anticorpos primários: anti-FOXG1 (1:200), anti-TUBB3 (1:500-1:1.000). Lave 3x com PBS.
  6. Incubar com anticorpo secundário (1:500) + Hoechst 33258 (1:500) por 1 h. Lave 3x com PBS.
  7. Monte e observe sob um microscópio confocal.

7. Análise de heteroplasmia

  1. Colha iPSCs usando raspadores de células e transfira para microtubos. Adicione 0,5 mL de PBS e centrifugue a 100 × g por 5 min. Remova o sobrenadante e prossiga para a Etapa 7.2.
  2. Extraia o DNA total de acordo com as instruções do fabricante do kit.
  3. Configure a concentração final para cada reação de PCR: 1x master mix fluorescente, primer direto de 0,25 μM, primer reverso de 0,25 μM. O volume total da reação é de 15 μL, incluindo 50 ng de DNA total da Etapa 7.2. Utilizar as seguintes condições de PCR: desnaturação inicial a 95 °C durante 1 min; 40 ciclos de 95 °C durante 15 s e 60 °C durante 30 s. As sequências de primers são as seguintes: MELASwt_foward: gtttgttaagatggcagagc; MELASwt_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; MELASmut_foward: gtttgttaagatggcagg; MELASmut_reverse: ggaattgaacctctgactgtaaagttt; FBXO15_ para a frente: gccaggaggtcttcgctgta; FBXO15_ reverso: aatgcacggctagggtcaaa.
  4. Use valores de ciclo limite para calcular o número de cópias do DNA mitocondrial (mutante versus selvagem).
  5. Normalize para o número de cópias do gene nuclear FBXO15 .

8. Avaliação do tamanho e forma do organoide

  1. Capture imagens de organoides usando microscópio com formato TIFF.
  2. Meça o tamanho e a circularidade usando um software de análise de imagem de código aberto. Abra os arquivos TIFF salvos na Etapa 8.1 clicando em Arquivo | Abra e selecione o arquivo. Escolha Seleções à mão livre e trace o organoide. Em seguida, clique em Analisar | Medir. Os valores de Área e Circularidade nos resultados foram utilizados para a análise na Etapa 8.3.
  3. Analise os dados realizando um teste t para avaliar se há diferenças significativas em comparação com as linhas de controle usando software estatístico.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geramos organoides cerebrais e conduzimos culturas neuronais 2D usando um protocolo relativamente simples com pequenas modificações baseadas em Nakamura et al.9 (Figura 1). No protocolo anterior, foram utilizadas placas de 96 poços em forma de V, enquanto neste estudo, usamos placas de baixa fixação de 96 poços em forma de U para permitir que as células se agreguem naturalmente no centro de cada poço. Usando a linha iPSC de controle s...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoides induzidos a partir de células-tronco embrionárias humanas (ESCs)/iPSCs representam modelos promissores de doenças intratáveis raras, enquanto a geração de organoides cerebrais normalmente requer longos períodos de cultura com duração de vários meses10 e o uso de equipamentos caros, como um recipiente projetado que agita continuamente o meio de cultura e mantém condições estáveis para cultura de células 3D de longo prazo. Neste estudo, estabelecemos orga...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As iPSCs 414C2 foram obtidas do RIKEN BRC. O apoio financeiro foi fornecido pela JSPS KAKENHI (24H00648 para M.F., 23K08971 para C.S.) e pelo Programa de Rede de Pesquisa Translacional da AMED (25yf0126001j002 para M.F.). Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Serviço Alemão de Intercâmbio Acadêmico (DAAD) para F.B.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Prato de cultura celular de 10 cmCorning353003
Superfície de fixação ultra baixa de 6 poçosCorning3471
70 & mu; Filtro de células MCorning352350
AccutaseNacalai Tesque12679-54enzimas usadas para dissociar iPSCs
Suplemento B27Thermofischer scientific17504001
Suplemento de B27 sem vitamina AThermofischer scientific12587010
β-mercaptoetanol (2-ME)sigmaM3148Descarte conforme as regras da instituição.
Cultura Celular com 6 poços multiplacasCorning353046
Ponta do protetor de célulaBMBio ECOBMT-200WPonta pipett de grande diâmetro
Raspadores de célulaSUMITOMO BAKELITECO., LTD.MS-93100
Microscópio confocalZeissLSM710
CriostatoLeicaCM3050
Laminina de Cultivo de Camundongo 1R& D3400-010-02usado para revestir placas de culturas 2D de neurônios dissociados
DMEM/F12FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.042-30795
Meio de Montagem por FluorescênciaDAKOS302380-2Meio de montagem
Anticorpo FOXG1Abcamab196868
GlutamaxThermofischer scientific35050061
Anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado contra camundongo IgG (H+L), Alexa Fluor Plus 488Thermofischer scientificA32723
Anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado contra IgG de Cabra (H+L), Alexa Fluor Plus 555Thermofischer scientificA32732
Heparan Sulfato (HS)sigmaH7640
Kit de RNA-para-cDNA de alta capacidadeThermofischer scientific4387406usado para sintetizar cDNA a partir de RNA
Hoechst 33258Thermofischer scientificH3569
ImageJVersão 1.52AUsado para medir o tamanho e a circularidade de organoides
Seda iMatrix-511Takara Bio Inc.892021revestimento para placas para cultura iPSC
insulinaFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.  090-06481
IWP2Tocris Biociências3533
Keyence BZ-X810KeyenceBZ-X810usado para capturar imagens para a Figura 3A
LSM710Carl Zeiss AGMicroscópio confocal
LSM980Carl Zeiss AGMicroscópio confocal
LUNA Universal qPCR Master MixBiolaboratórios da Nova InglaterraM3003
MatrigelCorning354277
Suplemento N2Thermofischer scientific17502001
Meio neurobasalThermofischer scientific21103049
Solução para Dissociação de Neurônios  FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.291-78001
aminoácidos não essenciais (NEAA)Nacalai Tesque06344-56
Soro Normal de CabraJackson ImmunoResearch Inc. 005000121
Nunclon Sphera 96-Poço, Microplaca Tratado com Esfera Nunclon, Microplaca de Fundo em Forma de UThermofischer scientific174929
Paraformaldeído (PFA)Nacalai Tesque09154-85Descarte conforme as regras da instituição.
PBSNacalai Tesque14249-24
PBSNacalai Tesque27575-31
penicilina/estreptomicina (PS)Nacalai Tesque26253-84
Poli-L-ornitina (PO)sigmaP3655
Éter octilfenil polioxietileno(10) (Tritão)FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.168-11805
PRISM GraphPadVersão 9.5.0
QIAamp DNA Mini Kit  QIAGEN51304usado para extrair DNA total
RNeasy Mini KitQIAGEN74104usado para extrair RNA total
SB-431542Cayman Chemical13031
Óculos deslizantesMATSUNAMICRE-05
StemFit AK02NTakara Bio Inc.AK02Nmeio usado para a cultura de iPSCs indiferentes e da diferenciação do Dia 0 ao Dia 6
SacaroseFUJIFILM Wako Pure Chermical Co.196-00015
Composto Tecido-Tecido O.C.T.Sakura Finetek Japan Co., Ltd.4583Meio de criopreservação
Anticorpo TUBB3PromegaG712A
Y27632FUJIFILM Wako Pure Chermical Co.030-24021Inibidor de ROCHAS
ZENCarl Zeiss AG2.3SP1 (edição preta)software para analisar as imagens tiradas   com microscópio confocal (LSM710)
ZENCarl Zeiss AG2.6 (edição azul)software para analisar as imagens tiradas   com microscópio confocal (LSM980)

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sproule, D. M., Kaufmann, P. Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: basic concepts, clinical phenotype, and therapeutic management of MELAS syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1142, 133-158 (2008).
  2. Kirino, Y., Suzuki, T. Human mitochondrial diseases associated with tRNA wobble modification deficiency. RNA Biol. 2 (2), 41-44 (2005).
  3. Shaffer, S. W., et al. Role of taurine in the pathologies of MELAS and MERRF. Amino Acids. 46, 47-56 (2014).
  4. Shaffer, S. W., Kim, H. W. Effects and mechanisms of taurine as a therapeutic agent. Biomol Ther. 26, 225-241 (2018).
  5. Rikimaru, M., et al. Taurine ameliorates impaired mitochondrial function and prevents stroke-like episodes in patients with MELAS. Intern Med. 51 (24), 3351-3357 (2012).
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  7. Tolle, I., Tiranti, V., Prigione, A. Modeling mitochondrial DNA diseases: from base editing to pluripotent stem-cell-derived organoids. EMBO Rep. 24 (4), e55678(2023).
  8. Fujikura, J., et al. Induced pluripotent stem cells generated from diabetic patients with mitochondrial DNA A3243G mutation. Diabetologia. 55 (6), 1689-1698 (2012).
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