Artigo de método

Um modelo animal de pulpite baseado em uma linhagem de camundongos em bragem externa e sua análise histológica

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DOI:

10.3791/69786

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27 de fevereiro de 2026

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1Department of Operative Dentistry, Dow Dental College, Dow University of Health Sciences, 2Dow Institute of Advanced Biological and Animal Research, Dow University of Health Sciences, 3Department of Pathology, Dow International Medical College, Dow University of Health Sciences, 4Department of Oral Pathology, Dow Dental College, Dow University of Health Sciences, 5Qatar University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para criar um modelo de pulpite em camundongos NMRI (Instituto de Pesquisa Médica Naval). Além disso, são descritos os passos para fazer um clipe de retração da mandíbula e preparar slides para histologia a partir da mandíbula do animal. Ao seguir um protocolo padrão, variações na metodologia e nos resultados podem ser evitadas.

Resumo

Os camundongos do Instituto de Pesquisa Médica Naval (NMRI) não foram relatados anteriormente por criarem um modelo de inflamação da polpa dentária. Neste protocolo, apresentamos um modelo animal utilizando camundongos NMRI e fornecemos procedimentos histológicos detalhados para o modelo de pulpite para garantir a reprodutibilidade. Incluímos 70 camundongos com IRM que foram aleatoriamente distribuídos em dois grupos: Grupo A (n=35), no qual a pulpite foi induzida apenas pela exposição à polpa, e o Grupo B (n=35), que recebeu exposição à polpa seguida pela aplicação de Zymosan. Após a exposição polpar do molar maxilar direito, os animais eram sacrificados em intervalos de tempo designados (0, 6, 9, 12, 24, 48 e 72 horas). A mandíbula maxilar foi obtida para histologia e análise histomorfológica quantitativa. Um aumento gradual dependente do tempo na inflamação foi observado na análise histológica para ambos os grupos. Ambos os modelos animais permitiram o estudo da inflamação em até 72 horas. A técnica apresentada neste artigo é reprodutível e ajudará a padronizar o estudo histológico da pulpite.

Introdução

Diversos modelos animais foram usados para estudar a pulpite 1,2,3,4. Entre eles, modelos de camundongos baseados em C57BL/6 e BALB/c são exclusivamente relatados em pesquisas sobre pulpite 5,6,7,8. Ambos são consanguíneos e têm requisitos rigorosos para reprodução 7,9. Os camundongos NMRI usados no protocolo atual são uma cepa de origem extramédia, oferecendo múltiplas vantagens em relação às cepas endogâmicas. Tem baixos custos de montagem e manutenção. Alta reprodução, melhor imunidade e baixa mortalidade resultam em uma renovação mais precoce e maiordas colônias 10. Portanto, é mais viável logisticamente efinanceiramente 11. Além disso, nossos resultados indicam que o perfil doençal da inflamação pulpar produzida neste modelo é semelhante aos modelos previamente relatados em camundongosendogâmicos 5,6,8. Além disso, camundongos com IRM podem suportar a exposição da polpa ao Zymosano por até 72 horas, desenvolvendo um perfil de doença observável. Esta é uma alternativa viável a outras cepas endogámicas para estudar pulpite12.

Zymosan é um extrato da parede celular de Saccharomyces cerevisiae, e é composto principalmente por quitina, mananos, manoproteínas eß-glucanos 13. Zymosan e Candida albicans compartilham uma estrutura de parede celular semelhante e são detectados pela imunidade inata do hospedeiro por meio de uma lectina tipo C, receptor de reconhecimento de patógenos, Dectina-114. A dectina-1 é expressa principalmente por células dendríticas e macrófagos. Detecta ß-glucanos em patógenos fúngicos e utiliza a via Syk/CARD9 para a formação de mediadoresinflamatórios 15. Portanto, o Zymosan é uma alternativa viável para estudar o efeito da exposição por C. albicans na doença pulpar, em vez de usar oorganismo 16. Isso é confirmado por nossos resultados publicados anteriormente, que mostram uma detecção precoce de transcritos de Dectina-1 em polpa exposta ao Zymosan. De forma semelhante, foram observados macrófagos de Dectina-1 expressando CD68+ve tambémno 12.

As técnicas histológicas descritas em publicações anteriores são frequentemente insuficientes para que pesquisadores iniciantes se reproduzam com confiança. Consequentemente, ocorre uma extensa tentativa e erro, levando à perda desnecessária de animais durante a otimização dos procedimentos histológicos. O protocolo atual padroniza a técnica de preparação de lâminas e já foi aplicado com sucesso a ratostambém 17. Aqui, todas as etapas essenciais do modelo da pulpite são descritas em detalhes, incluindo um método reprodutível para retração da mandíbula, indução da pulpite por exposição à polpa, indução da inflamação polpar usando Zymosan e subsequente análise histológica.

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Protocolo

O estudo atual com animais foi elaborado de acordo com as diretrizes do ARRIVE. O Conselho Institucional de Revisão para Pesquisa e Ética Animal da Dow University of Health Sciences aprovou este estudo com animais (Carta nº AR. IRB-06/DUHS/Aprovação/2016/05). O protocolo incluiu um total de 70 camundongos NMRI. Os animais foram obtidos da 'Central Animal House Facility' do Dow Institute for Advanced Biological and Animal Research. O tamanho da amostra desse protocolo é baseado em um estudoanterior 8.

1. Animais

NOTA: Os animais selecionados para o estudo pesavam entre 26 e 30 g e eram mantidos em gaiolas padrão sob as seguintes condições: temperatura de ±21 °C, umidade relativa de ±55% e proporção de 12 horas de luz/escuro com água filtrada livre e ração padrão (dieta normal para refeições). Havia monitoramento regular para qualquer sinal de agressividade, desconforto ou irritação. O diclofenaco sódico (200 μL subcutâneo, 25 mg/mL) foi usado em caso de dor ou desconforto. Eles podiam se aclimatar por duas semanas antes de qualquer experimentação. Dez animais cada foram mantidos em gaiolas devidamente rotuladas. Para identificação animal, um marcador era colocado em sua cauda.

  1. Divida os animais (n=70) aleatoriamente em dois grupos: Grupo A (n=35), Grupo B (n=35).
  2. No Grupo A, induzir pulpite apenas pela exposição da polpa (veja os passos 4.1.1 a 4.1.9).
  3. Para animais do Grupo B, aplique solução de Zymosan sobre a polpa exposta (veja os passos 4.2.1 a 4.2.3).

2. Solução de Zymosan

  1. Siga um método previamente publicado para preparação da solução de Zymosan, conforme descritoabaixo 18.
  2. Use soro salino tamponado com fosfato (PBS) para fazer uma solução de 1 mg/mL a partir de 1 mL de Zymosan.
  3. Autoclave a solução a 121 °C por 15 minutos.
  4. Deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente por 1 hora.
  5. Centrifuge a solução a 4 °C e 300 x g por 10 minutos.
  6. Descarte o sobrenadante e lave o pellet três vezes por centrifugação com PBS estéril gelado.
  7. Armazene a solução a 4 °C até o uso adicional.
    NOTA: A solução deve ser usada em até 30 dias, após os quais pode ser descartada.

3. Clipe de retração da mandíbula

  1. Use fio ortodôntico de aço inoxidável de 0,7 mm para fazer um clipe de retração da mandíbula.
  2. Pegue um fio de 100 mm de comprimento e faça um laço de 5 mm de diâmetro em seu centro.
  3. Gire ambas as partes do fio a 5 mm do laço e 15 mm no total em ângulos retos, sem curvas acentuadas.
  4. A uma distância de 25 mm da curva, faça uma ranhura e vire a extremidade restante para fora. Use a Figura 1A como orientação.

4. Modelo animal

  1. Grupo A (n = 35)
    1. Anestesiar os animais por meio de uma injeção intraperitoneal de 0,1 mL/20 g de coquetel cetamina-xilazina (87,5 mg/kg de cetamina + 12,5 mg/kg de xilazina).
    2. Use um estereoscópio de braço longo inclinado 10x para todos os procedimentos (Figura 1B). Posicione o braço inclinado de modo a que haja uma visão direta dos dentes maxilares retraídos do animal. (Figura 1C)
    3. Aperte o clipe e coloque a parte entalhada entre os incisivos maxilar e mandibular em cada lado do clip.
    4. Após soltar o clipe, fixe suas extremidades com a ajuda de fita adesiva (Figura 1C).
    5. Use uma pinça dental para expandir as bochechas do animal com a mão não funcional. (Figura 1D,E).
      NOTA: Evite pressão excessiva. A lesão causada por uma pinça pode causar sangramento fatal e morte do animal.
    6. Use uma fresa redonda de carboneto #1/4 com uma ferramenta de mão tipo E de baixa velocidade em um micromotor elétrico sob ampliação 10x até metade da profundidade no centro do primeiro molar maxilar direito para criar uma cavidade classe 1. Sombra de polpa pode ser visível neste momento (Figuras 1D, E).
    7. Passe a fresa suavemente em velocidades lentas em um movimento amplo. Use um motor elétrico para controlar o RPM.
    8. Use uma lima endodôntica do tipo K número 15 para expor a polpa (Figura 2B).
      NOTA: O uso de um instrumento endodôntico manual #15 deve ser extremamente suave, caso contrário ocorrerá uma perfuração de furcação, que só será evidente quando as lâminas histológicas forem preparadas. O diâmetro da rebarba redonda de carboneto #1/4 é de 0,25 mm, e uma lima do tipo #15K tem 0,15 mm de largura. Portanto, 0,15 mm será o tamanho de exposição na polpa (Figura 2C).
    9. Deixe a polpa exposta aberta para indução da pulpite
  2. Grupo B (n = 35)
    1. Repita todos os passos indicados no passo 4.1 com a adição do seguinte.
    2. Use uma micropipeta (0,2-2 μL) para colocar 0,2 μL da solução de Zymosan previamente preparada sobre a polpa exposta.
      NOTA: Deve-se ter cuidado ao dispensar a solução de Zymosan. O derramamento inadvertido da solução na cavidade oral pode causar a morte do animal. Portanto, a gaze é usada para cobrir o dente, de modo que o excesso de solução de Zymosan seja absorvido pela gaze (Figura 2D).
    3. Deixe a polpa tratada aberta para indução da pulpite com solução de Zymosan.

5. Preparação da amostra

  1. Sacrifique cinco animais de cada grupo em 0, 6, 9, 12, 24, 48 e 72 h por inalação de dióxido decarbono 19.
  2. Use uma câmara de eutanásia de 7,25 L.
  3. Não pré-carregue a câmara comCO2.
  4. Coloque os animais diretamente na câmara.
  5. Adicione 100% deCO2 com uma taxa de enchimento entre 30 e 70% do volume da câmara por minuto.
  6. Mantenha a vazão de CO2 em 5 L/min.
  7. Aqueça oCO2 e deixe-o se misturar com o ar presente na câmara.
  8. Observe os animais em busca de sinais de inconsciência em até 23 minutos.
  9. Monitore os animais para ver se a respiração cessa e os olhos podem ficar grisalhos.
  10. Mantenha o fluxo de CO2 por pelo menos um minuto após a paralisação da respiração.
  11. Confirme a morte dos animais antes de removê-los da câmara. Certifique-se de que não há respiração e que os olhos pareçam pálidos.
  12. Separe as cabeças dos animais imediatamente após a eutanásia.
  13. Use o primeiro molar maxilar não tratado do lado esquerdo do animal sacrificado a 0 h como controle.
  14. Use formalina tamponada a 10% em tubos cônicos de 15 mL devidamente rotulados para armazenar as mandíbulas maxilares por 2 dias.

6. Histologia

  1. Descalcifique as mandíbulas fixas com 10% de ácido fórmico por 3 dias.
    NOTA: Após o terceiro dia, verifique se uma lâmina cirúrgica pode cortar a mandíbula. Se ainda não estiver macio o suficiente, mergulhe novamente em ácido fórmico 10% e verifique diariamente até poder ser cortado com uma lâmina cirúrgica.
  2. Corte a mandíbula com uma lâmina nº 22. Faça o corte paralelo ao plano oclusal, ao longo do plano sagital, mantendo a lâmina imediatamente no lado palatal das cúspides palatinos dos molares maxilares (Figura 3A).
  3. Marque a superfície oclusal de todos os dentes com tinta da Índia.
    NOTA: Esta marcação ajudará a reconhecer a superfície oclusal durante a secção (Figura 3B).
  4. Embutida a mandíbula seccionada em cera de parafina em uma base de aço inoxidável, colocando-a plana contra a base do molde, com a superfície cortada voltada para a base.
    NOTA: A incorporação dessa forma garante que a superfície cortada entre primeiro no micrônomo, que a orientação da amostra esteja correta e que as seções sagitais sejam produzidas conforme mostrado na Figura 3E.
  5. Remova o cassete de embedding contendo a mandíbula embutida do molde base e coloque-o em um micrótomo.
  6. Faça seções sagitais de 3 μm de espessura e coloque-as sobre uma lâmina limpa e carregada do microscópio (Figura 3C).
  7. Observe lâminas não coradas sob um microscópio composto.
    NOTA: Continue observando as seções cortadas até que a cavidade fique visível na superfície oclusal. Se as seções forem corretamente feitas ao longo do plano sagital, ao longo do eixo longo do primeiro molar maxilar, observar-se-á que todo o espaço da polpa mostra uma ou duas raízes e a câmara polpar (Figura 3E). A partir desse ponto, teoricamente pode-se fazer 50 slides a partir de uma seção, já que o tamanho da exposição é 0,15 mm. (3 μm = 0,003 mm, 0,003 x 50 = 0,15)
  8. Realize etapas padrão de procedimentos de coloração por Hematoxilina e Eosina para as lâminas selecionadas, mostrando uma ou duas raízes, junto com toda a câmara polpária.
  9. Observe as lâminas tingidas sob um microscópio composto.
  10. Selecione cinco melhores lâminas por intervalo de tempo que permitam observar o máximo espaço de polpa.

7. Análise estatística

  1. Realize análises estatísticas usando softwares estatísticos padrão.
    NOTA: Para análise histomorfológica quantitativa, as lâminas observadas de cada intervalo de tempo foram pontuadas de acordo com um critério previamente publicado (Tabela 1)8. O teste H de Kruskal-Wallis com correção de Bonferroni em p=0,0018 foi usado para comparar escores de diferentes intervalos de tempo. O teste Mann-Whitney U foi usado em p ≤ 0,05 para comparar os Grupos A e B. Todas as comparações foram realizadas usando software estatístico padrão.

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Resultados

Neste protocolo, apresentamos um procedimento detalhado passo a passo para dois modelos animais de inflamação da polpa dentária em camundongos por IRMN, juntamente com seus métodos histológicos correspondentes. O uso de equipamentos adequados é essencial para o sucesso do protocolo. Nesse sentido, o estereoscópio de braço longo inclinado 10x é o equipamento mais crucial. A preparação da cavidade classe 1 foi realizada usando um micromotor elétrico a aproximadamente um terço de sua veloci...

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Discussão

O protocolo atual apresenta o desenvolvimento de um modelo de lesão dentária tipo 3 (pulpite irreversível) em camundongos por RMRI pela primeira vez na literatura relatada. Também detalha a análise histológica da inflamação polpar induzida por Zymosano e fornece um método reprodutível para preparar lâminas histológicas de mandíbulas de animais.

Seguindo esse protocolo, um modelo de lesão dentária tipo 3 foi produzido em camundongos com IRMN. Trabalhos anterior...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

O estudo foi autofinanciado. Os autores reconhecem a ajuda do Sr. Muhammad Adeel, do Departamento de Histologia da Dow University of Health Sciences, para a Histologia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Molde baseLaboratórios Histo-line, ItáliaR4166C2:D23Para incorporar a amostra em parafina
Carteto de bur #1/4 rodadaMeio-Oeste, Wichita Falls, Texas389101
Microscópio composto Motic BA310Motic Inc. Co. Ltd, Hong Konghttps://moticmicroscopes.com/products/ba310e
Diclofenaco sódico 25mg/mLIndus Pharma (DYCLO)https://sahar.ph/product/dyclo-diclofenac-sodium-25-mg-ml-im-iv/200 e micro; L subcutâneo
Peça manual de baixa velocidade tipo E Rose201-M4Sendo Foshan, Chinahttps://www.beingfoshan.com/en/h-pd-353.html
Incorporação de fita cassete Laboratórios Histo-line, ItáliaR4004
Câmara de EutanásiaConductScience, Illinois EUACS-EUTH2ACapacidade de 7,25 litros, para ratos e ratos [até 500g]
Tubos Falcon 15 mlNest188271
Formalin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos158127buffered 
Ácido fórmico  Suprimentos de Laboratório BDH Poole, Inglaterra & nbsp;2842810%
Homogeneizador Omni Mixer Homogeneizador, Omni International, Geórgia, EUAhttps://omni-inc.com/high-shear-lab-homogenizers/omni-th-0-2ml-100ml/omni-tissue-homogenizer-th
Tinta da ÍndiaSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos198285
Arquivo endodôntico do tipo K número 15Mani, Japãohttps://www.mani.co.jp/en/product/dental_01.html
Coquetel de cetamina-xilazinaBrookes Pharma Pvt Ltd / Mylab (Pvt.) Ltd.87,5mg/kg de cetamina + 12,5mg/kg de xilazina
Microtomo HM 315 RMicrom, Alemanha901100
Micro-motor Maratona-IIIBT-Marathon, Saeyang Microtech Co., Ltd. Coreiahttps://www.saeyang.com/theme/basic/sub/product/view.php?it_id=1752202111Uso em 1/3 da velocidade máxima
Micropipeta 0,2-2 & micro; L Gilson, Françahttps://www.gilson.com/default/
pipetman-p2-0-2-2-micro-l-metal
-ejector.html?srsltid=AfmBOoobE
0iSWY_902ZHGZ7AoJ6wzN5PI
0H4V4vkxHQgK1mq7Wg2kkbS		0.2-2 & micro; L 
Soro tampão com fosfato & nbsp;Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados UnidosP4417
Pacote Estatístico para as Ciências SociaisIBM, Armonk, Nova YorkSPSS para Mac versão 23.0   
Estereomicroscópio BMK-3 LEDTechno Meiji, Japãohttps://meijitechno.com/product/bmk-3-led-stereo-microscope/
Lâmina cirúrgica nº 22Lâmina cirúrgica de penas, Feather Safety Razor Co Ltd., Osaka, JapãoFB. 12
Zymosan ASigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados UnidosCat no Z42501mg/mL de 1 mL de Zymosan

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