Preparação de Contas de Compensação Econômicas e Universais Compatíveis para Anticorpos Multiespécies

Resumo

Este protocolo descreve um método econômico para preparar esferas de compensação compatíveis com múltiplas espécies para compensação de fluorescência em citometria de fluxo utilizando microsferas de poliestireno acopladas à proteína A/G/L recombinantes.

Resumo

Este protocolo descreve um método econômico e reprodutível para preparar esferas de compensação compatíveis com múltiplas espécies para compensação de fluorescência em citometria de fluxo multicolorido. Aqui, a proteína de ligação à imunoglobulina A/G/L (Proteína A/G/L) contendo múltiplos domínios de ligação à imunoglobulina foi recombinada em Escherichia coli (E. coli), purificada por cromatografia de afinidade com níquel e acoplada covalentemente a microsferas de poliestireno carboxilado por meio da química EDC/NHS. As esferas resultantes se ligam a anticorpos de diversas espécies e subclasses, gerando sinais de fluorescência fortes e distintos, adequados para a instalação de compensação. Esses resultados fornecem orientações práticas para selecionar o diâmetro das esferas e a carga proteica para alcançar intensidades de fluorescência adequadas a diferentes requisitos de compensação. A execução bem-sucedida do protocolo é indicada por uma purificação eficiente de proteínas e um pico claro e de alta intensidade de fluorescência das esferas conjugadas em comparação com as esferas controle durante a análise de citometria de fluxo. Essa abordagem simples e escalável permite a preparação rotineira de esferas de compensação estáveis e versáteis em laboratórios padrão, reduzindo custos e melhorando a flexibilidade para aplicações de citometria de fluxo.

Introdução

A citometria de fluxo tornou-se uma ferramenta indispensável em imunologia, biologia celular e pesquisa clínica para análise multiparamétrica de populações ^{celulares 1,2,3}. Um desafio crítico na citometria tradicional de fluxo multicolorido é o transbordamento de fluorescência, no qual o espectro de emissão de um fluorocromo se sobrepõe a múltiplos canais detectores, levando à contaminação do sinal e interpretação^{equivocada 4,5}. Portanto, a compensação adequada é essencial para uma interpretação precisa dos dados.

Tradicionalmente, controles de compensação são preparados usando células coloridas de cor única. No entanto, números limitados de células, expressão variável de antígenos e ligação diferencial dos anticorpos às células apresentam^{desafios 6}. Como consequência, esferas sintéticas modificadas para se ligar a anticorpos conjugados com fluorocromo surgiram como uma alternativa^{prática 7,8}. As esferas oferecem vantagens de capacidade de ligação consistente, alta intensidade de fluorescência e independência dos níveis de expressão celular^{de antígenos.} Comparado a reagentes de captura de espécie única ou restritos a Fc, a incorporação de múltiplos domínios de ligação à imunoglobulina (Proteína A, G e L) expande a cobertura da espécie e a compatibilidade do formato de anticorpos, permitindo uma única preparação de esferas para acomodar diversos anticorpos conjugados com fluorocromo.

Entre as esferas usadas para compensação, o acoplamento de proteínas de ligação à imunoglobulina, como Proteína A, Proteína G e Proteína L, proporciona ampla compatibilidade com isótipos de anticorpos de diferentes espécies. As proteínas A e G se ligam à região Fc de muitas subclasses de IgG, enquanto a proteína L se liga às cadeias leves κ das imunoglobulinas e, assim, expande a capacidade de ligação a fragmentos de Fab e anticorpos de cadeia^{única 10,11}.

Embora esferas comerciais de compensação estejam disponíveis, seu custo relativamente alto pode ser proibitivo para laboratórios com orçamentos limitados, restringindo assim sua aplicação^{ampla 3}. Diante desses desafios, há necessidade de plataformas flexíveis e personalizáveis para esferas que permitam aos pesquisadores definir o tamanho das contas, domínio de ligação de anticorpos e tipos de anticorpos usados para controles de compensação. O objetivo desse protocolo é fornecer um método simples, econômico e reprodutível para preparar esferas de compensação compatíveis com múltiplas espécies para citometria de fluxo multicolorida. Este protocolo descreve o design, expressão e purificação de uma proteína de fusão recombinante contendo múltiplos domínios de ligação à imunoglobulina das Proteínas A, G e L, seguida por sua conjugação covalente com esferas de poliestireno modificadas por carboxila de diâmetros definidos.

O protocolo descreve o design molecular da proteína de fusão, sua expressão e purificação em E. coli, e a preparação de reagentes de compensação baseados em esferas compatíveis com múltiplos anticorpos conjugados com fluorocromo. Este protocolo é destinado a laboratórios que realizam citometria de fluxo multicolorido em diversos ambientes de pesquisa, incluindo imunologia, oncologia e estudos translacionalistas, especialmente quando são necessárias redução de custos, compatibilidade entre espécies e controles flexíveis de compensação.

Protocolo

NOTA: Prepare todos os buffers e reagentes de forma fresca, conforme listado na Tabela 1. Preparar soluções do EDC e do NHS imediatamente antes do uso; Não os armazene. Para todos os outros tampões (Lise, Ligação, Lavagem, Elução, MES, PBS, Tris), prepare as soluções de estoque com antecedência e armazene-as a 4 °C. Equilibre os buffers armazenados à temperatura de reação apropriada (temperatura ambiente ou 4 °C) antes do uso. Certifique-se de que o buffer FACS e o buffer de armazenamento sejam preparados frescos ou armazenados a 4 °C.

1. Expressão e purificação da proteína recombinante A/G/L

1. Expressão da proteína recombinante A/G/L
   1. Transforme o plasmídeo A/G/L da proteína pET28 em células competentes para E. coli BL21(DE3) usando um protocolo padrão de choque térmico.
   2. Placar as células transformadas em ágar LB contendo 50 μg·^mL-1 kanamicina e incubar durante a noite a 37 °C.
   3. Inocule uma única colônia em 5–10 mL de caldo LB contendo kanamicina (50 μg·^mL-1) e cultive durante a noite a 37 °C, com agitação a 200 × g.
   4. Transfira a cultura durante a noite para 200 mL de LB contendo kanamicina (concentração final 50 μg·^mL-1) em uma diluição de 1:100.
   5. Cultive a cultura a 37 °C até que a densidade óptica a 600 nM (OD600) atinja 0,6–0,8.
   6. Induzir a expressão proteica adicionando isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a uma concentração final de 0,5 mM e incubar a 28 °C por 12–16 horas.
   7. Colhe as células por centrifugação a 4 °C, 4000 × g por 10 minutos.
   8. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular no buffer de lise. Proceda imediatamente ou armazene os pellets a -80 °C.
      Ponto de pausa: Pellets celulares podem ser armazenados a -80 °C por várias semanas antes da lise.
2. Lise Celular
   1. Ressuspenda o pellet bacteriano em 10 mL de tampão de lise por grama de massa de células úmidas.
   2. Lisar as células usando um homogeneizador de alta pressão ajustado a 1000 bar, passando a suspensão por 2–3 ciclos até que a solução fique menos viscosa e translúcida.
      Nota: Alternativamente, a perturbação celular pode ser realizada por sonicação no gelo usando modo pulso (5 s LIGADO / 10 segundos DESLIGADO) por 8 a 12 ciclos, evitando superaquecimento. Garanta a lise completa examinando uma pequena alíquota ao microscópio.
   3. Centrifuge o lisado a 12000 × g por 30 minutos a 4 °C.
   4. Colete o sobrenadante como fração de proteína solúvel para purificação.
3. Purificação de afinidade Ni-NTA
   1. Equilíbrio de colunas e carga de amostras
      1. Equilibre a coluna Ni-NTA com 10 volumes da coluna (CV) de buffer de ligação contendo 10 mM de imidazol.
      2. Filtre o lisado clarificado através de um filtro de 0,45 μM, adicione imidazol a uma concentração final de 10 mM e o coloque na coluna a 0,5 CV·^min-1.
      3. Colete a fração de fluxo para monitorar a eficiência da ligação.
   2. Lavagem
      1. Lave a coluna com 10 CV de tampão de ligação e tampão de lavagem contendo 20 mM de imidazol a uma vazão de 1 CV·^min-1.
   3. Elução
      1. Elude a proteína alvo com tampão de elução a uma vazão de 1 CV·^min-1.
      2. Colete frações e monitore A280 para identificar frações contendo proteínas.
   4. Troca de Buffers e Armazenamento de Proteínas
      1. Transfira a solução proteica purificada para um tubo de ultrafiltração centrífuga de corte de peso molecular (MWCO) de 50 kA.
      2. Centrifuge a 3.500 × g por 15–20 minutos a 4 °C até atingir a concentração desejada.
      3. Descarte o fluxo-atravessado e adicione um volume igual de buffer PBS (pH 7,4) ao retentado para troca de buffer.
      4. Repita a centrifugação e a substituição do PBS 2–3 vezes para substituir completamente o buffer original pelo PBS.
      5. Após a etapa final de concentração, colete o retentado e meça a concentração de proteína.
      6. Verifique as frações eluídas pelo SDS-PAGE; o peso molecular esperado da proteína A/G/L é de aproximadamente 90 kDa.
      7. Aliquota a proteína purificada e armazene a -80 °C até novo uso.
         NOTA: O protocolo pode ser pausado nesta etapa. Proteínas purificadas A/G/L podem ser armazenadas a -80 °C para conjugação posterior das contas. Após a concentração, aproximadamente 10 mg de proteína purificada A/G/L foram obtidos a partir de 200 mL de cultura bacteriana, com concentração final de 2–5 mg·mL⁻¹.

2. Conjugar as esferas à Proteína A/G/L

1. Pré-lavagem das contas
   1. O vórtice aplica o material de esferas na velocidade máxima por 20–30 s em temperatura ambiente (20–25 °C) para resuspender uniformemente. Transfira 0,2 mL de 8 μM (5 mg) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   2. Esferas de pellets por centrifugação, 5000 × g por 3 minutos em temperatura ambiente.
   3. Aspire cuidadosamente e descarte o sobrenadante sem perturbar a pelota.
   4. Adicione 1 mL de 0,1 M de tampão de mes, ressuspenda suavemente por pipeteamento ou vórtice suave, centrifuge novamente 5000 × g por 3 minutos em temperatura ambiente e remova o sobrenadante. Repita essa lavagem uma vez (total de duas lavagens de MES).
2. Ativação com EDC/NHS
   ATENÇÃO: EDC e NHS são irritantes e devem ser manuseados com equipamentos de proteção individual apropriados em uma exaustão.
   1. Ressuspenda as esferas em um buffer MES de 0,5 mL, depois adicione sequencialmente 50 μL de 50 mg·^mL-1 NHS e 100 μL de 50 mg·^mL-1 EDC.
      Nota: As soluções do EDC e do NHS devem ser preparadas frescas imediatamente antes do uso.
   2. O vórtice forma esferas e incuba em um shaker rotativo em temperatura ambiente por 30 minutos para ativar.
3. Remova os reagentes de ativação e lave
   1. Esferas de pellet: 5000 × g, 3 min, em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
   2. Adicione 1 mL de tampão PBS, ressuspenda suavemente, centrifuge (5000 × g, 3 min, em temperatura ambiente) e remova o sobrenadante. Realize uma lavagem PBS para remover os reagentes de ativação.
4. Acoplamento de proteínas
   1. Resuspenda o pellet ativado em 0,4–0,5 mL PBS (alvo final de volume de reação 0,5–0,6 mL). Mantenha o volume baixo para aumentar a concentração eficaz de proteína.
   2. Adicione 100 μg de proteína A/G/L. Misture suavemente.
   3. Incube a reação em um agitador rolante em temperatura ambiente por 2 horas para acoplamento rápido, ou 4 °C durante a noite. Mantenha um rolo suave para evitar que a conta se afunde.
5. Reação de extinção/terminação
   1. Contas de pellet (5000 × g, 3 min) e remova o sobrenadante.
   2. Adicione 1 mL 0,1 M Tris (pH = 7,4) para apagar os ésteres restantes do NHS. Resuspenda e incube em um shaker rolante por 30 minutos em temperatura ambiente.
   3. Esferas de pellets e lave com 1 mL PBS no mesmo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifuge novamente (5000 × g, 3 min) e descarte o sobrenadante. Depois, resuspenda as contas com um buffer de armazenamento de 0,5 mL.
      Ponto de pausa: O protocolo pode ser pausado nesta etapa. As contas de ressuspensão podem ser armazenadas a 4 °C.
6. Misturar e armazenar
   1. Contando contas conjugadas e contas não conjugadas. Misture as esferas conjugadas e não conjugadas em uma proporção de 25%–75% no novo tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
   2. Suspenda a mistura de esferas em 1 mL de tampão de armazenamento (PBS contendo 1% de BSA e 0,05% de conservante antimicrobiano).
   3. Transfira a suspensão para um tubo rotulado e guarde a 4 °C. Não é necessário proteção contra luz. Resuspenda suavemente antes do uso para garantir uma distribuição uniforme das contas. Nessas condições, as contas permanecem estáveis por pelo menos 6 meses.

3. Controle de Qualidade Representante

1. Incubar 10 μL de esferas conjugadas com 1 μL de anticorpo fluorescente em um tampão FACS de 100 μL por 15–30 min em temperatura ambiente.
   NOTA: Cada tubo deve conter apenas um anticorpo fluorescente.
2. Lave as esferas com 1 mL PBS, resuspenda em 300–500 μL PBS e passe no batrô de fluxo.
3. Ajuste o canal de detecção de acordo com o fluoróforo conjugado ao anticorpo (por exemplo, laser de 488 nM com detector FITC para anticorpos conjugados com FITC). Uma faixa representativa de tensão de tubo fotomultiplicador (PMT) de 0–200 V pode ser usada como ponto de partida e ajustada com base no desempenho do instrumento. Colete pelo menos 10.000 eventos por amostra.
4. Gate nos miçangas por FSC/SSC. Esferas positivas devem mostrar um pico único claro com alto MFI no canal do fluoróforo; O controle negativo deve mostrar apenas o fundo.

Resultados

A proteína de fusão recombinante A/G/L consiste em 816 aminoácidos com um peso molecular calculado de 90,5 kDa (Arquivo Suplementar 1). Essa proteína de fusão mantém cinco domínios B que se ligam a IgG da Proteína A, dois domínios de ligação a IgG da Proteína G e cinco domínios B de ligação à cadeia leve κ da Proteína L, enquanto o domínio de ligação à albumina foi removido (Figura 1A, Tabela de Suplementos 1). Um resíduo de...

Discussão

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho prático e eficiente para a preparação de esferas de compensação fluorescentes baseadas em proteína recombinante A/G/L. O procedimento inclui expressão bacteriana, purificação por afinidade Ni-NTA e acoplamento covalente da proteína purificada a microesferas de poliestireno modificado com carboxila, utilizando química EDC/NHS. As esferas resultantes podem se ligar a anticorpos de múltiplas espécies e subclasses, fornecendo uma ferramenta versát...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AF647 Rat Ig2a	BioLegend	141711
APC Mouse IgG1	BioLegend	353311
BL21(DE3) Células Competentes	Sangon	B528414
BSA	Solarbio	A8010
EDC	Thermo Fisher	22980	CAS: 1892-57-5
FITC IgG de Hamster Armênio	BioLegend	400905
Imidazol	Sigma-Aldrich	I202	CAS: 288-32-4
IPTG	GoldBio	I2481C	CAS: 367-93-1
Kanamicina	Sangon	A600286	CAS: 8063-07-8
KCl	Aladdin	P112134	CAS: 7447-40-7
KH2PO4	Aladdin	P434010	CAS: 7778-77-0
MES	Sigma-Aldrich	M3671	CAS: 145224-94-8
Na2HPO4	Aladdin	S274390	CAS: 7558-79-4
NaCl	Aladdin	C111549	CAS: 7647-14-5
NHS	Thermo Fisher	24500	CAS: 6066-82-6
Ni NTA Beads 6FF	Smart-Lifesciences	SA005005
PE mouse IgG2a	BioLegend	362603
ProClean 300	Beyotime	ST853
Tris	Sigma-Aldrich	252859	CAS: 77-86-1
Triptona	Oxoide	LP0042
Ultra Filtro Centrífugo, MWCO de 50 kDa	Millipore	UFC9050
Microsferas uniformes de poliestireno carboxil	Tomicro Biotech	10ml, 25mg/ml	Xangai, China
Extrato de Levedura	Oxoide	LP0021