Artigo de método

Um Ensaio Chromatin para tecido do cérebro humano

DOI:

10.3791/717

21 de março de 2008

Neste artigo

Resumo

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Até recentemente, estudos de expressão no cérebro humano eram limitados a quantificação de RNA ou proteína. Com as técnicas de imunoprecipitação de cromatina descritas neste documento, será possível mapear a metilação da histona e outros reguladores epigenética da expressão gênica no cérebro pós-morte.

Resumo

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Crônica doenças neuropsiquiátricas como a esquizofrenia, doença bipolar e autismo são pensados ​​para resultar de uma combinação de fatores genéticos e ambientais que podem resultar em alterações epigenéticas da expressão gênica e outra patologia molecular. Tradicionalmente, no entanto, estudos de expressão no cérebro pós-morte foram confinados a quantificação de mRNA ou da proteína. As limitações encontradas na investigação pós-morte do cérebro, como variabilidades no tempo autólise e integridades tecidos também são susceptíveis de impacto a todos os estudos de estruturas de maior cromatina ordem. No entanto, a organização nucleosomal de DNA genômico, incluindo DNA: núcleo da histona vinculativo - parece ser em grande parte preservados em amostras representativas prestados pelos bancos cérebro diferentes. Portanto, é possível estudar o padrão de metilação e outras modificações covalentes das histonas no núcleo definido loci genômicos no cérebro pós-morte. Aqui, apresentamos uma versão simplificada nativa imunoprecipitação da cromatina protocolo (NChIP) para amostras congeladas (nunca fixo) cérebro humano. Começando com micrococcal digestão nuclease de homogeneizados de cérebro, NChIP seguido por qPCR pode ser concluída dentro de três dias. A metodologia apresentada aqui deve ser útil para elucidar os mecanismos epigenéticos de expressão gênica em normais e doentes cérebro humano.

Protocolo

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Procedimento:

1 º dia

1. Homogeneizar 50-500 mg de tecido de matéria congelada post-mortem cinza com Douncing Buffer.

! ATENÇÃO - tecidos humanos devem ser manuseados com cuidado sob condições rígidas de segurança. Que deve ser manuseado em padrões NBS-2 ou superior de segurança.

  1. Tomar previamente dissecados, cérebro post-mortem de -80 ° C, Dounce-los em volume cerebral 5X de tampão Douncing, e colocar em tubo de microcentrífuga 2,0 mL. Matched amostra e pares de controle são processados ​​simultaneamente.

2. Microco....

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Discussão

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O protocolo apresentado aqui é particularmente útil para os pesquisadores interessados ​​em assinaturas de metilação das histonas e / ou DNA do cérebro humano, porque essas marcas cromatina pode ser menos propenso a artefatos pós-morte, em comparação com outros tipos de modificações, incluindo (histonas) acetilação e fosforilação 1, 2. O cérebro pós-morte é passível de estudo da mono-nucleosomal preparados; o DNA permanece em grande parte ligado à histonas do núcleo, pelo menos em amostras com intervalos de autólise representante.......

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Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Saúde Mental (5R01MH071476).

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Materiais

Soluções:

  • nChIP buffer Douncing: 10 mM Tris, 4 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2 ajustar o pH para 7,5
  • 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl ajustar o pH para 7,5
  • Buffer de baixo teor de sal de lavagem: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
  • Tampão de lavagem de sal elevado: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl
  • Tampão de lítio Cloreto: 1% IGEPAL-CA 630, 1% de ácido deoxicólico, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M LiCl
  • TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
  • Tampão eluição: NaHCO 3 0,1 M, SDS 1%
  • Proteinase K tampão de digestão (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, NaCl 2M ajustar o pH para 8,0
  • 3 acetato de sódio M: 24,61 g de acetato de sódio anidro (MW = 82,03) em 100 mL de água destilada autoclavada. Ajustar o pH de 5,2 utilizando ácido acético concentrados.

Referências

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  1. Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain. J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.
  2. Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. Prefrontal dysfunction in sc....

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Etiquetas

Imunoprecipita o de CromatinaDigest o com Nuclease Microc cicaProtocolo de ChIP NativoAn lise de Metila o de HistonasPesquisa Cerebral Post mortemMecanismos Epigen ticosDigest o com Proteinase KExtra o com Fenol CloroformioAn lise por qPCR

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