Um Ensaio Chromatin para tecido do cérebro humano

Resumo

Até recentemente, estudos de expressão no cérebro humano eram limitados a quantificação de RNA ou proteína. Com as técnicas de imunoprecipitação de cromatina descritas neste documento, será possível mapear a metilação da histona e outros reguladores epigenética da expressão gênica no cérebro pós-morte.

Resumo

Crônica doenças neuropsiquiátricas como a esquizofrenia, doença bipolar e autismo são pensados ​​para resultar de uma combinação de fatores genéticos e ambientais que podem resultar em alterações epigenéticas da expressão gênica e outra patologia molecular. Tradicionalmente, no entanto, estudos de expressão no cérebro pós-morte foram confinados a quantificação de mRNA ou da proteína. As limitações encontradas na investigação pós-morte do cérebro, como variabilidades no tempo autólise e integridades tecidos também são susceptíveis de impacto a todos os estudos de estruturas de maior cromatina ordem. No entanto, a organização nucleosomal de DNA genômico, incluindo DNA: núcleo da histona vinculativo - parece ser em grande parte preservados em amostras representativas prestados pelos bancos cérebro diferentes. Portanto, é possível estudar o padrão de metilação e outras modificações covalentes das histonas no núcleo definido loci genômicos no cérebro pós-morte. Aqui, apresentamos uma versão simplificada nativa imunoprecipitação da cromatina protocolo (NChIP) para amostras congeladas (nunca fixo) cérebro humano. Começando com micrococcal digestão nuclease de homogeneizados de cérebro, NChIP seguido por qPCR pode ser concluída dentro de três dias. A metodologia apresentada aqui deve ser útil para elucidar os mecanismos epigenéticos de expressão gênica em normais e doentes cérebro humano.

Protocolo

Procedimento:

1 ^º dia

1. Homogeneizar 50-500 mg de tecido de matéria congelada post-mortem cinza com Douncing Buffer.

! ATENÇÃO - tecidos humanos devem ser manuseados com cuidado sob condições rígidas de segurança. Que deve ser manuseado em padrões NBS-2 ou superior de segurança.

1. Tomar previamente dissecados, cérebro post-mortem de -80 ° C, Dounce-los em volume cerebral 5X de tampão Douncing, e colocar em tubo de microcentrífuga 2,0 mL. Matched amostra e pares de controle são processados ​​simultaneamente.

2. Micrococcal Nuclease (MN) Digestão

1. Adicionar 5U/mL de Micrococcal nuclease para a amostra e misturar na solução pipetando cima e para baixo antes de colocar no gelo.
   * ETAPA CRÍTICA - É importante fazer este passo rapidamente desde MN tem a capacidade de atuar em até 4 ° C.
2. Incubar as amostras durante 7 minutos a 37 ° C.
3. Após a incubação 7 minutos, adicione EDTA 0,5 M a uma concentração de 10mM para parar a atividade MNase.

3. Hypotonisation

1. Colocar as amostras em um tubo falcon 15 mL. Adicionar o volume de amostra de 0,2 mM 10X EDTA, 1 / 2000 volume de amostra de benzamidine 0,2 M e volume de amostra 1 / 1000 de phenylmethanesulphonylfluoride 0,1 M (PMSF). Os dois últimos compostos são usados ​​como inibidores da protease.
   * ETAPA CRÍTICA - É importante manter as amostras em gelo durante todos estes passos.
2. Incubar amostra por 1 hora, enquanto vórtex a cada 10 minutos.
3. No final da incubação hora de duração, adicionar volume de amostra 1 / 2000 da 3M TDT, outro inibidor da protease.
4. Amostra de vórtice, uma vez mais e centrifugar a 3175 RCF por 10 minutos a 4 ° C.
   * ETAPA OPCIONAL - Precleansing com proteína G Agarose.
   1. Tome sobrenadante e colocar em novo tubo falcon 15 mL.
   2. Adicionar 500 mL da proteína G Agarose.
   3. Girar em temperatura ambiente por 30 min.
   4. Centrifugar a 4000 rpm por 10 min a 4 ° C.
5. Distribuir sobrenadante para que 500 mL são usados ​​como controle de entrada (contendo DNA genômico apenas), eo restante é dividido em dois tubos contendo 1600 mL de amostra de cada um - que são de cromatina imunoprecipitação (CHIP) amostras.
6. O controle de entrada é colocada a -80 ° CO / N até à sua utilização.
7. Para as amostras de chip - adicionar o volume de 10XFSB 01:10 e 4μg de anticorpos, em seguida, as amostras vortex e gire-a 4 ° C durante a noite.
   ! ATENÇÃO - Quantidade e diluição de anticorpos pode exigir de otimização.

2 º ^Dia

! CUIDADO! - Begin 2 º ^dia lavando a proteína G Agarose que será usado para isolar DNA nucleosomal. Desde contas agarose são muito sensíveis, é necessário cortar as cabeças das dicas sempre pipetagem qualquer solução contendo esferas de agarose.

1. Sondagem Beads Proteína G Agarose para DNA

1. Adicionar 1,6 mL para 245 mL 1XFSB proteína G-agarose (suficiente para 4 tubos) em um tubo de microcentrífuga de 2 mL (loop).
2. Separar a solução em dois tubos de 2 mL e encha cada uma com até 1,6 mL com 1X FSB.
3. Girar em RT por 30 segundos e centrifugar a 0,1 RCF por 30 seg.
4. Retire o sobrenadante usando um vácuo.
5. Adicionar 1,6 mL 1X FSB mais uma vez. Gire as amostras por 30 segundos e depois centrifugar a 0,1 RCF por 30 seg.
6. Remover o sobrenadante, mais uma vez, e combinar os dois tubos com 1,5 mL 1XFSB.
7. Adicionar 15 mL de DNA do esperma sonicado Salmon (10mg/mL).
   ! ATENÇÃO - Esta etapa deve, em princípio, reduzir a ligação não específica da immunoprecipitate às esferas. No entanto, isso também pode levar a falsos positivos para algumas das seqüências (humano) de DNA.
8. Girar em RT por 30 min, em seguida, centrifugar a 0,1 RCF por 30 seg.
9. Remover o sobrenadante. Adicionar 200 mL de 1XFSB.
10. Adicionar 90 mL de contas agarose em cada amostra ChIP. Gire a 4 ° C por 1 hora.
11. Adicione 1 ml de 1XFSB em grânulos restantes agarose para servir como controle negativo e gire a 4 ° C por 1 hora.
12. Após a incubação hora de duração, centrifugar as amostras e controle negativo em 0,1 RCF por 30 seg. Desprezar o sobrenadante.

2. Lavar as Beads

! CUIDADO! - Buffers de lavar roupa deve ser mantida a 4 ° C até o uso, e devem ser usados ​​apenas se estão a menos de um mês de idade.

1. Adicionar 1 mL de cada solução de lavagem para as contas e rodar por 3 min à temperatura ambiente.
2. Centrífuga de 0,1 RCF por 30 seg.
3. Descarte de vácuo utilizando sobrenadante.

* Cada solução de lavagem

- Tampão de lavagem Low sal

- Tampão de lavagem de alta sal

- Solução de cloreto de lítio - apenas giram a RT por 1 minuto!

- Tampão TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8)

3. Eluição

* ETAPA CRÍTICA - Faça tampão de eluição frescos para cada experimento no dia em que está a ser utilizado.

1. Adicionar 250 mL de tampão de eluição preparada para cada amostra.
2. Rodar por 15 min à temperatura ambiente, então centrifugue a 0,4 RCF por 1 min.
3. Salve o sobrenadante em um tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (Loop).
4. Adicionar 250 mL de tampão de eluição de cada amostra e vortex à mão por alguns segundos. Então, amostras vortex por 15 minutos em um mulitvortexer.
5. Centrifugar a 16 RCF rpm por 4 minutos e guarde o sobrenadante em 2,0 mL mesmo tubo (Loop).

4. Proteína Digest

1. Adicionar 10 ml de EDTA 0,5 M, 25 mL 0,8 M Tris-HCl, pH 6,5, 10 mg / ml Proteinase K (1 / 200 da amostra) para cada amostra ChIP.
2. Para cada controle de entrada, adicionar tampão de lise para a digestão proteinase K (1 / 10 de tampão da amostra) e proteinase K 10mg/ml (1 / 200 de tampão da amostra).
3. Entrada e incubar amostras de chip em 52 ° C por pelo menos 3 horas.

5. Fenol / clorofórmio extração

! ATENÇÃO - Experiment exigindo fenol / clorofórmio deve ser realizada sob o capô. Use luvas de borracha nitrílica ao manusear fenol / clorofórmio.

1. Após a incubação de 3 horas, nós adicionamos os 500 mL de fenol-clorofórmio para cada amostra.
2. Vortex todas as amostras durante vários segundos, em seguida, centrifugar a 13 rpm RCF por 5 min.
3. Neste ponto, duas fases estarão presentes e nós estamos interessados ​​no conteúdo da fase de topo. Retire a fase superior e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
4. Adicionar uma mistura de 2μL de glicogênio e 50μL de acetato de sódio 3M para cada amostra, juntamente com 1,375 mL de etanol 100%.
5. Vortex vigorosamente todas as amostras. Colocá-los em -80 ° C durante a noite.

3 ^º dia

1. Remover amostras forma -80 ° C e colocá-los no gelo para eles a descongelar.
2. Centrifugar a 15 RCF por 10 minutos a 4 ° C.
3. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento no fundo do tubo.
4. Adicionar 1 mL de etanol 75% frio para cada amostra, em seguida, inverter-los 4-6 vezes.
5. Centrifugar a 18 RCF por 5 min a 4 ° C.
6. Remover o sobrenadante, uma vez mais e permitir que as pelotas para o ar seco.
7. Dissolver pellets secos em 50 mL de 4mm Tris-HCl, PH8 e armazenar a -80 ° C até à sua utilização.

Discussão

O protocolo apresentado aqui é particularmente útil para os pesquisadores interessados ​​em assinaturas de metilação das histonas e / ou DNA do cérebro humano, porque essas marcas cromatina pode ser menos propenso a artefatos pós-morte, em comparação com outros tipos de modificações, incluindo (histonas) acetilação e fosforilação ^{1, 2.} O cérebro pós-morte é passível de estudo da mono-nucleosomal preparados; o DNA permanece em grande parte ligado à histonas do núcleo, pelo menos em amostras com intervalos de autólise representante...

Materiais

Soluções:

• nChIP buffer Douncing: 10 mM Tris, 4 mM MgCl _2, 1 mM CaCl ₂ ajustar o pH para 7,5
• 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl ajustar o pH para 7,5
• Buffer de baixo teor de sal de lavagem: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
• Tampão de lavagem de sal elevado: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl
• Tampão de lítio Cloreto: 1% IGEPAL-CA 630, 1% de ácido deoxicólico, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M LiCl
• TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
• Tampão eluição: NaHCO ₃ 0,1 M, SDS 1%
• Proteinase K tampão de digestão (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, NaCl 2M ajustar o pH para 8,0
• 3 acetato de sódio M: 24,61 g de acetato de sódio anidro (MW = 82,03) em 100 mL de água destilada autoclavada. Ajustar o pH de 5,2 utilizando ácido acético concentrados.