Este vídeo demonstra o protocolo para imunoprecipitação DNA metilado (MEDIP). MEDIP é um procedimento dois dias que, seletivamente, extratos de fragmentos de DNA metilado partir de uma amostra do DNA genômico utilizando anticorpos com especificidade para 5-metilcitosina (anti-5 mC).
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Artigo de método
Imunoprecipitação DNA metilado
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A identificação de padrões de metilação do DNA é um procedimento comum no estudo da epigenética, como a metilação é conhecido por ter efeitos significativos sobre a expressão gênica, e está envolvida com desenvolvimento normal, bem como doença
Protocolo
EXTRAÇÃO DE DNA E PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
DNA de uma variedade de diferentes amostras (células cultivadas fresca, congelada, bem como tecidos fixados em formalina incluído em parafina) podem ser usados para MEDIP. É importante o uso de DNA altamente purificado, sem proteínas associadas, tais como histonas. Também é importante para remover RNA, tanto quanto possível a partir da amostra, como ele pode interferir tanto com a quantificação de DNA e ligação aos anticorpos. A quantidade de DNA usado para MEDIP pode variar de 200 ng de 1 mg, dependendo da quantidade de DNA disponíveis. Para demonstrar este protocolo, 1 mg de DNA será usado. O segu....
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Discussão
Há uma consciência crescente do papel significativo desempenha na doença de metilação do DNA, portanto, o desenvolvimento de ensaios para medir esta modificação estão se tornando cada vez mais importante 3, 12, 13. A técnica MEDIP é um instrumento favorável para triagem, tanto do genoma inteiro-o e locus específico de nível 6, 7. Esta técnica oferece uma visão rápida dos níveis de metilação do DNA usando quantidades limitadas de partida DNA e permite comparações fáceis entre diferentes fontes. Apli.......
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Agradecimentos
Queremos agradecer aos membros do Brown e laboratórios Lam pela sua participação na crítica a este vídeo e artigo. Este trabalho foi financiado por fundos do Canadian Institutes for Health Research eo Michael Smith Fundação para a Pesquisa em Saúde.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Sonicador Biorupter | Ferramenta | Diagenode | UCD-200 TM | |
| Tubos de microcentrífuga SafeSeal de 1,7 ml | Outro | Sorenson BioScience | 11510 | |
| Espetrofotômetro ND 3300 | Ferramenta | NanoDrop | ||
| Anticorpo Primário: Anti-5’-metilcitosina mouse mAb | Reagente | Calbiochem | 162 33 D3 | |
| Anticorpo Secundário: Dynabeads M-280 Ovelha anti-mouse IgG | Reagente | Invitrogen | 112-01D | |
| Grade Magnética para Tubos | Ferramenta | Invitrogen | CS15000 | |
| Mini LabRoller | Ferramenta | Labnet International | H5500 | |
| Tampão de IP | 10 mM NaPO4 pH 7,0, 140 mM NaCl, 0,05% Triton X-100. Armazenado à temperatura ambiente | |||
| Tampão de Digestão | 10 mM Tris pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5% SDS, 50 mM NaCl |
Referências
- Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends Genet. 24, 231-237 (2008).
- Lu, Q., et al. Epigenetics, disease, and therapeutic interventions. Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).
- Zilbe....
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Reimpressões e permissões
