Rotulagem seletiva de proteínas de superfície celular usando Dyes CyDye DIGE Fluor Minimal

Summary

Um método simples e específica foi demonstrada para marcação fluorescente e detecção aprimorada de proteínas de superfície das células sem uma etapa de fracionamento. Abundância diferencial de proteínas de superfície celular foi analisada através de eletroforese bidimensional (2-D) e Ettan ™ tecnologia DIGE.

Abstract

Proteínas de superfície são fundamentais para a capacidade da célula para reagir ao seu ambiente e interagir com as células vizinhas. Eles são conhecidos por serem indutores de quase todos os de sinalização intracelular. Além disso, eles desempenham um papel importante na adaptação ambiental e tratamento de drogas, e muitas vezes são envolvidos na patogênese da doença e patologia (1). Interações proteína-proteína são intrínsecos a vias de sinalização, e para ter mais conhecimento nesses processos biológicos complexos, métodos sensíveis e confiáveis ​​são necessárias para estudar as proteínas de superfície celular. Eletroforese bidimensional (2-D) é amplamente utilizado para detecção de biomarcadores e outros alvos em amostras de proteínas complexas para estudar mudanças diferencial. Proteínas da superfície celular, em parte devido à sua baixa abundância (1 2% de proteínas celulares), são difíceis de detectar, em um gel 2-D sem fracionamento ou algum outro tipo de enriquecimento. Eles também são muitas vezes mal representado em 2-D gels devido à sua natureza hidrofóbica e alto peso molecular (2). Neste estudo, apresentamos um novo protocolo para células intactas usando corantes CyDye DIGE Fluor mínima para a rotulagem específica e detecção deste importante grupo de proteínas. Os resultados mostraram rotulagem específica de um grande número de proteínas de superfície celular com rotulagem mínima de proteínas intracelulares. Este protocolo é rápido, simples de usar, e os três corantes CyDye DIGE Fluor mínima (Cy 2, 3 e Cy Cy 5) pode ser usado para rotular as proteínas da superfície celular. Esses recursos permitem a multiplexação usando o 2-D Eletroforese Gel Fluorescence Difference (2-D DIGE) com tecnologia Ettan DIGE e análise das mudanças da proteína expressão usando DeCyder 2-D Software Análise Diferencial. O nível de proteínas da superfície celular foi seguido durante a inanição de soro de células CHO para vários comprimentos de tempo (ver Tabela 1). Pequenas mudanças em abundância foram detectados com alta precisão, e os resultados são apoiados por métodos estatísticos definidos.

Protocol

Cultura de células

1. Cultivar células de ovário de hamster chinês (CHO-K1), utilizando os procedimentos padrão de cultura de células em F-12 com meio Ham Glutamax I contendo 10% de soro fetal bovino, 50 U / ml de penicilina, e 50 mcg / ml de sulfato de estreptomicina (Invitrogen).
2. Trocar o meio de cultura sem soro para meios de comunicação. Proteínas rótulo superfície da célula foram em momentos diferentes com CyDye DIGE Fluor Cy3 ou Cy5 corantes mínimo (ver secção Labeling superfície celular, abaixo).
3. Piscina números iguais de células de cada momento e etiqueta com CyDye DIGE Fluor Cy2. Usá-los como um padrão interno para cada g....

Discussion

Concentração de proteína

Uma visão geral dos dois fluxos de trabalho rotulagem é mostrado na Figura 1. Uma vez que as células ainda estão intactas quando rotuladas de acordo com o protocolo de rotulagem de proteína da superfície celular, apenas as proteínas de superfície das células são expostas ao corante. No padrão Ettan DIGE protocolo, as células são lisadas antes de rotulagem e proteínas tanto dentro como fora da célula são rotulados (Fig. 1). A quantidade relativa de corante à proteína no.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit CyDye DIGE, Reagente de 2 nmol		GE Healthcare	28-9345-30
Kit Quant 2-D	Reagente	GE Healthcare	80-6484-51
Tampão IPG pH 3-11NL	Reagente	GE Healthcare	17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, Reagente de 24 cm		GE Healthcare	17-6003-77
Ferramenta IPGbox		GE Healthcare	28-9334-65
Kit IPGbox	Ferramenta	GE Healthcare	28-9334-92
Solução de reidratação DeStreak	Reagente	GE Healthcare	17-6003-19
Immobiline DryStrip Cover Fluid	Reagent	GE Healthcare	17-1335-01
Ettan IPGphor 3 IEF Unit	Instrument	GE Healthcare	11-0033-64
Ettan IPGphor Manifold	Componente do Instrumento	GE Healthcare	80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster		Tool GE Healthcare	80-6467-22
Ettan DALTtwelve Unidade de Separação e Fonte de Alimentação/Unidade de Controle		Instrumento GE Healthcare	80-6466-46	230 V unidade: 80-6466-27
Typhoon 9410 Imager de Modo Variável	Instrumento	GE Healthcare	63-0055-81
Instrumento Ettan Spot Picker	GE	Healthcare	18-1145-28
Instrumento Digestor Ettan		GE Healthcare	18-1142-68
Ettan Spotter	Instrument	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrument	GE Healthcare	18-1142-33
Software de Análise Diferencial DeCyder 2-D	Outro	GE Healthcare	28-4012-01
ImageQuant	Outros	GE Healthcare	28-9236-62
Reagente de Ureia		GE Healthcare	17-1319-01
Reagente CHAPS		GE Healthcare	17-1314-01
PlusOne Reagente de ditiotreitol (DTT)		GE Healthcare	17-1318-01
Reagente	azul de bromofenol	GE Healthcare	17-1329-01
Reagente	Tris	GE Healthcare	17-1321-01
Dodecilsulfato de sódio (SDS)	Reagente	GE Healthcare	17-1313-01
PlusOne Glicerol 87%	Reagente	GE Healthcare	17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C	Reagente	GE Healthcare	17-1310-01
PlusOne TEMED	Reagente	GE Healthcare	17-1312-01
PlusOne Persulfato de Amônio	Reagente	GE Healthcare	17-1311-01
PlusOne Reagente de Glicina		GE Healthcare	17-1323-01
Preparação de amostras 2-D para proteínas de membrana	Reagente	Pierce, Thermo Scientific	89864
Reagente	de sulfato de estreptomicina	Invitrogen	15140-122