Rotulagem seletiva de proteínas de superfície celular usando Dyes CyDye DIGE Fluor Minimal

Resumo

Um método simples e específica foi demonstrada para marcação fluorescente e detecção aprimorada de proteínas de superfície das células sem uma etapa de fracionamento. Abundância diferencial de proteínas de superfície celular foi analisada através de eletroforese bidimensional (2-D) e Ettan ™ tecnologia DIGE.

Resumo

Proteínas de superfície são fundamentais para a capacidade da célula para reagir ao seu ambiente e interagir com as células vizinhas. Eles são conhecidos por serem indutores de quase todos os de sinalização intracelular. Além disso, eles desempenham um papel importante na adaptação ambiental e tratamento de drogas, e muitas vezes são envolvidos na patogênese da doença e patologia (1). Interações proteína-proteína são intrínsecos a vias de sinalização, e para ter mais conhecimento nesses processos biológicos complexos, métodos sensíveis e confiáveis ​​são necessárias para estudar as proteínas de superfície celular. Eletroforese bidimensional (2-D) é amplamente utilizado para detecção de biomarcadores e outros alvos em amostras de proteínas complexas para estudar mudanças diferencial. Proteínas da superfície celular, em parte devido à sua baixa abundância (1 2% de proteínas celulares), são difíceis de detectar, em um gel 2-D sem fracionamento ou algum outro tipo de enriquecimento. Eles também são muitas vezes mal representado em 2-D gels devido à sua natureza hidrofóbica e alto peso molecular (2). Neste estudo, apresentamos um novo protocolo para células intactas usando corantes CyDye DIGE Fluor mínima para a rotulagem específica e detecção deste importante grupo de proteínas. Os resultados mostraram rotulagem específica de um grande número de proteínas de superfície celular com rotulagem mínima de proteínas intracelulares. Este protocolo é rápido, simples de usar, e os três corantes CyDye DIGE Fluor mínima (Cy 2, 3 e Cy Cy 5) pode ser usado para rotular as proteínas da superfície celular. Esses recursos permitem a multiplexação usando o 2-D Eletroforese Gel Fluorescence Difference (2-D DIGE) com tecnologia Ettan DIGE e análise das mudanças da proteína expressão usando DeCyder 2-D Software Análise Diferencial. O nível de proteínas da superfície celular foi seguido durante a inanição de soro de células CHO para vários comprimentos de tempo (ver Tabela 1). Pequenas mudanças em abundância foram detectados com alta precisão, e os resultados são apoiados por métodos estatísticos definidos.

Protocolo

Cultura de células

1. Cultivar células de ovário de hamster chinês (CHO-K1), utilizando os procedimentos padrão de cultura de células em F-12 com meio Ham Glutamax I contendo 10% de soro fetal bovino, 50 U / ml de penicilina, e 50 mcg / ml de sulfato de estreptomicina (Invitrogen).
2. Trocar o meio de cultura sem soro para meios de comunicação. Proteínas rótulo superfície da célula foram em momentos diferentes com CyDye DIGE Fluor Cy3 ou Cy5 corantes mínimo (ver secção Labeling superfície celular, abaixo).
3. Piscina números iguais de células de cada momento e etiqueta com CyDye DIGE Fluor Cy2. Usá-los como um padrão interno para cada gel 2-D.
4. A maioria dos experimentos podem ser realizados com células CHO-K1, mas fibroblastos de rato embrião (L1 3T3) e linfoblastos rato ascite linfoma (EL4) também pode ser usada (dados não mostrados).
5. Crescer os dois últimos tipos de células em DMEM com Glutamax II, mas, caso contrário, use condições idênticas usada para as células CHO-K1.

Rotulagem superfície celular

1. Cuidadosamente separar células aderentes não enzimaticamente, contando e dividindo-se alíquotas de 5-10 células x106. Para células cultivadas em suspensão, omita o passo destacando.
2. Centrifugar a suspensões de células em cerca de 800 xg por 5 minutos. Remover o sobrenadante contendo o meio.
3. Lavar as pelotas por resuspendion em solução 1 ml de gelo frio Hank salina balanceada (HBSS) pH 8.5. Centrifugado a 800 xg, a 4 ° C por 2 minutos.
4. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 200 mL de buffer rotulagem gelada (HBSS pH 8.5, 1 M uréia).
5. Rótulo as células intactas com 600 pmol CyDye corantes DIGE Fluor mínimo por 20 minutos no gelo no escuro.
6. Saciar a reação pela adição de 20 l 10 mM de lisina. Incubar por 10 minutos.
7. Lavar a superfície marcada com células duas vezes por ressuspensão em 500 mL pH HBSS 7,4, seguido por centrifugação a 800 xg, a 4 ° C por 2 minutos.

Lise celular e fracionamento

1. Lisar a superfície marcada com células em 150 mL tampão de lise fria (7 uréia M, 2 M tiouréia, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH 5 mM de acetato de magnésio 8,5). Deixe na geladeira por pelo menos 1 h com vórtex ocasionais.
2. Centrifugar a lisados ​​em 10 000 xg, a 4 ° C por 5 minutos. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Esta amostra é a amostra não fracionada contendo todas as proteínas celulares.
3. Em paralelo, lave pellets de células, como acima, então fracionar (usando um kit de fracionamento de membrana, Pierce) em membrana e frações citosólica antes de 2-D eletroforese em gel. A fração de membrana contém proteínas da membrana interna e da superfície celular.
4. Para efeito de comparação, seguem o padrão Ettan procedimento DIGE ^3, e lise, rótulo, e, finalmente, fracionar as células. Determinar a concentração de proteína nas amostras utilizando a 2 - D Quant Kit (GE Healthcare).

2-D electrophoresis

1. Reidratar géis DryStrip Immobiline, pH 3-11NL (24 cm) usando bandeja DryStrip Immobiline Reswelling, 24 cm em 450 mL de solução DeStreak Reidratação (0,5% IPG Buffer) durante a noite.
2. Aplicar o CyDye marcado amostras (correspondente a 50 mg de proteína total) para Immobiline DryStrip carregando géis copo anódica no coletor e realizar focalização isoelétrica (IEF), utilizando Ettan IPGphor II Sistema IEF acordo com as instruções.
3. Depois IEF, equilibrar as tiras em duas etapas e coloque em cima de grandes dimensões (26 x 20 cm) géis de poliacrilamida 12,5% (SDS-PAGE). Sobreposição com agarose 0,5% (em tampão de corrida contendo azul de bromofenol). Executar 2-D electrophoresis usando Ettan DALTtwelve Sistema Vertical Grande a 5 W / gel por 30 min, e depois de 15 W / gel até que a frente de corante atinge o fundo do gel.

De imagem e análise de dados

1. Depois de completar 2-D electrophoresis, digitalizar os géis para Cy2, Cy3 ou Cy5 usando um Typhoon 9410 Imager modo variável.
2. Compare os mapas no local a partir de frações de membrana, frações citosólica e não-fracionada amostras usando DeCyder 2-D Software Análise Diferencial ^4.

Pós-coloração

1. Depois de imagem, prata manchar o gel de acordo com procedimento padrão ^5.

Identificação de proteínas

1. Crescer, colheita, lavagem e lisar quantidades preparativa (aproximadamente 1 mg de proteína total de 10 x106 células CHO) de células, como descrito acima para uma amostra não-fracionada. Use uma amostra Cy5 superfície da célula marcada (veja acima) como um pico, e aplicado em conjunto com os montantes unlabelled preparativa de proteínas.
2. Realização de eletroforese 2-D, como descrito acima, mas desta vez, aplly 600 mg de células unlabeled lisado em conjunto com 50 mg de superfície celular rotulados pico anódica por aplicação copo. Use os marcadores de referência para permitir escolher ponto correto, e coloque aentre as placas de vidro antes de lançar gel acordo com as recomendações ^3.
3. Digitalizar o gel em Cy5 canal para obter as células Cy5 mapa de locais de superfície, seguido por coloração de proteínas totais utilizando proteína total Deep Purple mancha ^3.
4. Partida em conjunto os dois mapas no local usando o DeCyder 2-D de software e criar uma lista de seleção para todos os pontos correspondentes às cinco Cy proteínas de superfície celular rotulados. Escolha proteínas da superfície celular usando a estação de tratamento de Ettan spot, extrair as fichas gel, e usando o digestor trypsinate Ettan. Identificar utilizando MALDI-TOF espectrometria de massa.

Tabela 1. Ettan Um experimento DIGE foi realizada utilizando amostras de soro de células esgotados rotuladas de acordo com o protocolo de rotulagem da superfície celular da proteína na figura 1.

Amostra	Tempo de esgotamento do soro	Rotulados com CyDye	Número de gel
1	-	Cy 3, 2 Cy	1
2	30 minutos	Cy 5, 2 Cy	1
3	2 horas	Cy 3, 2 Cy	2
4	4 horas	Cy 5, 2 Cy	2
5	16 horas	Cy 5, 2 Cy	3

Discussão

Concentração de proteína

Uma visão geral dos dois fluxos de trabalho rotulagem é mostrado na Figura 1. Uma vez que as células ainda estão intactas quando rotuladas de acordo com o protocolo de rotulagem de proteína da superfície celular, apenas as proteínas de superfície das células são expostas ao corante. No padrão Ettan DIGE protocolo, as células são lisadas antes de rotulagem e proteínas tanto dentro como fora da célula são rotulados (Fig. 1). A quantidade relativa de corante à proteína no...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit CyDye DIGE, 2 nmol	Reagente	GE Healthcare	28-9345-30
Kit 2-D Quant	Reagente	GE Healthcare	80-6484-51
Tampão IPG pH 3-11NL	Reagente	GE Healthcare	17-6004-40
Fita Seca Immobiline pH 3-11NL, 24 cm	Reagente	GE Healthcare	17-6003-77
IPGbox	Ferramenta	GE Healthcare	28-9334-65
Kit IPGbox	Ferramenta	GE Healthcare	28-9334-92
Solução de Reidratação DeStreak	Reagente	GE Healthcare	17-6003-19
Fluido de Cobertura para Fita Seca Immobiline	Reagente	GE Healthcare	17-1335-01
Unidade Ettan IPGphor 3 IEF	Instrumento	GE Healthcare	11-0033-64
Manifold Ettan IPGphor	Componente de instrumento	GE Healthcare	80-6498-38
Formador de Gel Ettan DALTtwelve	Ferramenta	GE Healthcare	80-6467-22
Unidade de Separação Ettan DALTtwelve e Fonte de Alimentação/Unidade de Controle	Instrumento	GE Healthcare	80-6466-46	Unidade 230 V: 80-6466-27
Imager de Modo Variável Typhoon 9410	Instrumento	GE Healthcare	63-0055-81
Coletor de Manchas Ettan	Instrumento	GE Healthcare	18-1145-28
Digestor Ettan	Instrumento	GE Healthcare	18-1142-68
Dispensador Ettan	Instrumento	GE Healthcare	18-1142-67
Ettan MALDI-TOF	Instrumento	GE Healthcare	18-1142-33
Software de Análise Diferencial Bidimensional DeCyder	Outro	GE Healthcare	28-4012-01
Software de Análise ImageQuant	Outro	GE Healthcare	28-9236-62
Ureia	Reagente	GE Healthcare	17-1319-01
CHAPS	Reagente	GE Healthcare	17-1314-01
Ditiotreitol (DTT) PlusOne	Reagente	GE Healthcare	17-1318-01
Bromofenol Azul	Reagente	GE Healthcare	17-1329-01
Tris	Reagente	GE Healthcare	17-1321-01
Dodecilsulfato de Sódio (SDS)	Reagente	GE Healthcare	17-1313-01
Glicerol 87% PlusOne	Reagente	GE Healthcare	17-1325-01
ReadySol IEF 40% T, 3% C PlusOne	Reagente	GE Healthcare	17-1310-01
TEMED PlusOne	Reagente	GE Healthcare	17-1312-01
Persulfato de Amônio PlusOne	Reagente	GE Healthcare	17-1311-01
Glicina PlusOne	Reagente	GE Healthcare	17-1323-01
Preparação de Amostra 2-D para proteínas de membrana	Reagente	Pierce, Thermo Scientific	89864
Sulfato de estreptomicina	Reagente	Invitrogen	15140-122