5.9: Técnicas Baseadas em Imunoprecipitação: Purificação de Proteínas Endógenas Usando Esferas de Agarose

1. Imunoprecipitação usando contas de agarose de proteína agarose

Preparação de lysato celular

1. Centrifugar 10⁸ timócitos em uma microcentrifuuagem a 13.000 rpm por 3 min e remover o supernatante.
   Nota: O número celular variará dependendo dos níveis de expressão da proteína desejada e do tipo celular escolhido.
2. Suspenda-as as células em RIPA tampão de 500 μL com PMSF.
3. Interrompa as células usando alguns pulsos rápidos com um vórtice e, em seguida, aspire o lysate algumas vezes com uma agulha de 25 G presa a uma seringa.
   Nota: Evite criar bolhas. Use uma agulha maior, como uma agulha 21G para tipos de células maiores.
4. Incubar a célula no gelo por 10 minutos.
5. Centrifugar o lysate a 13.000 rpm por 15 min a 4°C.
6. Transfira o supernatante para um tubo de microcentrifuuge fresco e rotulado.

Pré-compensação

7. Adicione 20 contas de proteína A/G PLUS de proteína agarose e 1 μg de um anticorpo de controle de isótipo (aqui, o anticorpo de controle de isótipo do mouse IgG1 é usado), ao liseto.
   Nota: A escolha do anticorpo isótipo utilizado dependerá do anticorpo específico da proteína usado mais tarde na etapa de puxar para baixo.
8. Incubar a mistura de lise em uma rotadora centrífuga na sala fria (4°C) por 30 min.
9. Centrifugar a amostra a 3200 rpm para 30 s a 4°C.
10. Transfira o supernatante pré-limpo para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL fresco. Descarte a pelota.

Determinação da concentração de proteínas

11. Determine a concentração proteica do lise celular realizando um Ensaio bradford.
12. Aliquot 1000 μL Bradford Reagent em 7 tubos de microcentrífusão.
13. Adicione as seguintes quantidades de padrão de proteína BSA (2 mg/mL) em 6 tubos (Tabela 1).

Tabela 1: Quantidades padrão de proteína BSA

14. No^tubo 7, adicione 1 μL do lise pré-limpo.
    Nota: Para garantir que a concentração da amostra esteja dentro da faixa de detecção de ensaios, prepare e analise uma diluição de 1:2 ou 1:5lysate também.
15. Coloque 200 μL de cada um dos 7 tubos em poços individuais de uma placa de fundo plano, 96-bem repetindo cada amostra em triplicado.
16. Leia placa em um leitor de placas a 595 nm.
17. Gere a curva padrão no excel e calcule a concentração proteica do lysate pré-limpo.

Demolir

18. Rotule dois tubos frescos de microcentrifuuge de 1,5 mL, um como "controle" e outro como "teste", que neste exemplo é c-myc.
19. Coloque 500 μg de lise pré-limpa em cada um desses tubos.
    Nota: A quantidade de proteína utilizada aqui dependerá da quantidade da proteína desejada para ser purificada.
20. Levante o volume total de cada tubo até 500 μL usando tampão de lise.
21. Adicione 2 μg de anticorpo anti-c-myc ao tubo de grupo de ensaio e 2 μg mouse IgG1 anticorpo de controle de isótipo ao grupo controle.
    Nota: A quantidade de anticorpos dependerá da eficáciado anticorpo e da quantidade da proteína alvo.
22. Incubar os tubos em uma rotadora na sala fria (4°C) por 2h.
23. Adicione 20 contas de proteína A/G PLUS agarose a 20 μL agarose a cada tubo.
    Nota: É aconselhável usar pontas de pipeta com a extremidade cortada para evitar danos às contas.
24. Incubar em uma rotadora em sala fria (4°C) durante a noite.
    Nota: Dependendo da proteína alvo e da eficácia do anticorpo, esta etapa pode variar de 1h a durante a noite.
25. Centrifugar os tubos a 3200 rpm para 30 s 4°C para puxar para baixo as contas.
26. Aspire o supernatante de cada tubo.
    Nota: A proteína alvo está agora ligada às contas.
27. Lave as contas duas vezes usando o PBS de 500 μL 1X Dulbecco.
28. Centrifugar os tubos a 3200 rpm para 30 s 4°C.
    Nota: Para uma lavagem mais rigorosa, use buffers mais rigorosos, como o RIPA.
29. Aspire o tampão de cada tubo. Usando pontas de carregamento de gel, remova qualquer tampão que sobrou das contas e mantenha as contas no gelo para estotar a proteína.
    Nota: Neste exemplo, a proteína é eluida em buffer de execução SDS-PAGE fervendo as contas, para análise de manchas ocidentais. Esta abordagem é adequada para verificar resultados ip ou para examinar interações proteína-proteína. Para outras aplicações a jusante, como a purificação de proteínas para análise estrutural ou enzimática, sistemas mais sofisticados, como tags de epítope (sinalização ou etiqueta de mamão) são usados para evitar a elução do anticorpo com a proteína de interesse.

2. Verificação ip através da análise de manchas ocidentais

Eletroforese SDS-PAGE:

1. Suspender de nova resolução em 20 μL de corante de carregamento SDS-PAGE contendo β-mercapto-ethonol.
2. Ferva as amostras a 95 °C por 5 minutos.
3. Centrifugar as contas a 13.000 rpm para 10 s em temperatura ambiente.
4. Utilizando pontas de carregamento de gel, encobante cuidadosamente as amostras obtidas das contas e carregue-as em poços de gel SDS-PAGE de 4-15% gradiente.
5. Além das amostras, carregue uma pista com uma escada de proteína, bem como uma pista com o lysate pré-limpo para servir como controle de carga.
6. Corra a 100 V até que a frente de corante atinja a parte inferior do gel (~1h).

Análise de manchas ocidentais:

7. Faça sanduíche de mancha ocidental, garantindo que a membrana PVDF esteja entre gel e cátodo vermelho.
8. Transferência para 1 h a 100 V.
9. Coloque a membrana em tampão de bloqueio de 5 mL à temperatura ambiente por 1h em um roqueiro em um ajuste baixo, para bloquear os locais de ligação proteica não específico.
   Nota: Os volumes de tampão de bloqueio, anticorpo primário, anticorpos secundários e lavagens podem precisar ser aumentados para manchas de tamanho maior.
10. Incubar a mancha com anticorpo anti-c-myc de 5 mL no tampão de bloqueio durante a noite a 4°C no roqueiro em um ajuste baixo.
    Nota: O anticorpo aqui utilizado deve ser diferente do usado na etapa de puxar para baixo.
11. Lave a mancha 3-6 vezes usando 5 mL TBST com cada lavagem sendo 5 min à temperatura ambiente em um roqueiro em um ajuste baixo.
12. Incubar a mancha com anticorpo secundário de corrente anti-coelho com marca HRP no buffer de bloqueio, por 1 h à temperatura ambiente no roqueiro em um ajuste baixo.
    Nota: A escolha do anticorpo secundário dependerá do anticorpo primário usado para a mancha ocidental. Além disso, uma cadeia leve específica secundária é usada no protocolo porque a proteína alvo está próxima em peso molecular à cadeia pesada do anticorpo. Se a proteína alvo estiver perto de 50kDa, use uma cadeia de luz específica secundária. Se a proteína alvo estiver próxima de 25kDa, use e cadeia pesada específica secundária.
13. Lave a mancha 3-6 vezes usando 5 mL TBST com cada lavagem sendo 5 min à temperatura ambiente em um roqueiro em um ajuste baixo.
14. Remova o líquido da mancha e dab borda da mancha em lenços de laboratório para remover o excesso de líquido.
15. Borra de cobertura com 1x reagente de detecção de chemiluminescente' e incubar por 1 min.
    Nota: As etapas a seguir devem ser feitas em rápida sucessão, pois o reagente de detecção é sensível à luz e ao tempo.
16. Borda dab de mancha em lenços de laboratório para remover o reagente de detecção em excesso.
17. Coloque a mancha na superfície de imagem da bandeja Imager.
    Nota: Manchas de chemiluminescentes também podem ser visualizadas usando filme.
18. Imagem usando o 'Programa Chemiluminescent' para capturar vários pontos de tempo de 10 s a 5 min.
    Nota: O tempo ideal pode mudar com base na quantidade de proteína e na qualidade do anticorpo.
19. Escolhai uma imagem com visibilidade de banda ideal e, em seguida, exporte essa imagem.
20. Antes de mover a mancha, tire uma foto da mancha usando o imager, para capturar a localização da escada. Então, exporte essa imagem também.
21. Usando um software de preparação de slides (como o PowerPoint), alinhe as bandas e as imagens da escada para formar uma única imagem.

A imunoprecipitação, ou IP, é uma técnica amplamente utilizada para isolar uma proteína de interesse de um lisado celular ou tecidual ou de um fluido corporal para caracterização de proteínas ou para investigar interações proteína-proteína.

O processo começa com um anticorpo, que tem alta afinidade e especificidade para a proteína alvo. Este anticorpo é misturado com a amostra, permitindo a formação de complexos anticorpo-alvo. Qualquer proteína ligada à proteína-alvo também fica indiretamente ligada ao anticorpo no processo. Em seguida, a solução é incubada com grânulos de agarose, conjugados a uma proteína bacteriana, que tem forte afinidade pela região constante dos anticorpos. A proteína bacteriana se liga ao anticorpo e conecta os complexos anticorpo-alvo às contas. Em seguida, a solução é centrifugada para precipitar as contas, extraindo assim todo o complexo contendo o anticorpo de ligação, a proteína alvo e quaisquer proteínas que interajam. Finalmente, as proteínas ligadas são extraídas das esferas e liberadas umas das outras e são usadas para análise posterior por técnicas como Western blotting.

Várias variações de diferentes partes dessa técnica são comumente usadas, como pré-limpeza, uso de tags peptídicas ou esferas magnéticas ou análise de outros parceiros de ligação não proteica. O IP pode ser precedido por uma etapa de pré-limpeza, para remover proteínas de ligação a anticorpos não específicas na amostra e minimizar o fundo. Isso envolve primeiro incubar a amostra com anticorpos de controle de isotipo, permitindo que eles se liguem a essas proteínas e, em seguida, usar grânulos de agarose para precipitar os complexos. A amostra está então pronta para prosseguir para o IP real.

As etiquetas peptídicas são úteis se um anticorpo específico não estiver disponível para IP. Aqui, a proteína-alvo pode ser geneticamente modificada para conter uma etiqueta de epítopo de peptídeo e um anticorpo contra a etiqueta é capaz de retirar a proteína de interesse. Grânulos magnéticos são freqüentemente usados em vez de agarose para precipitar o alvo. Após a ligação ao complexo anticorpo-alvo, o tubo de amostra é colocado em um campo magnético forte, que extrai as esferas da solução. Isso elimina a necessidade de centrifugação e melhora a velocidade e a conveniência.

A imunoprecipitação também é usada para estudar proteínas de ligação ao DNA ou RNA e é conhecida como imunoprecipitação da cromatina e imunoprecipitação de RNA, respectivamente. Essas variações são úteis para solucionar problemas e adaptar o método para diferentes aplicações experimentais. Neste vídeo, você observará como pré-limpar um lisado celular e realizar imunoprecipitação para extrair uma proteína de interesse, seguida de análise de Western blot para validar o experimento.

Para começar, coloque as células pré-coletadas em uma microcentrífuga e gire a 13 mil rpm por três minutos. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 500 microlitros de tampão de lise RIPA com PMSF. Agora, interrompa as células usando alguns pulsos rápidos com um vórtice e, em seguida, aspire o lisado algumas vezes com uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa, tomando cuidado para evitar a criação de bolhas. Coloque as células no gelo por 15 minutos. Depois de incubar as amostras no gelo, centrifugue o lisado por 15 minutos a quatro graus Celsius.

Rotule um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante para o tubo recém-rotulado e descarte o pellet. Em seguida, pré-limpe o lisado de contaminantes que se ligam não especificamente aos grânulos de agarose ou ao anticorpo primário, adicionando 20 microlitros dos grânulos de proteína A / G PLUS-agarose e um micrograma de um anticorpo de controle de isotipo ao lisado, que neste exemplo é um controle de isotipo IgG1 de camundongo. Incube o tubo em um rotador em uma câmara fria por 30 minutos. Depois de girar o lisado na câmara fria por 30 minutos, centrifugue a amostra a 3200 rpm por 30 segundos a quatro graus Celsius. Remova o tubo da centrífuga e transfira o sobrenadante pré-limpo para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulado. Descarte o pellet.

Agora, determine a concentração de proteína do lisado celular realizando um ensaio de Bradford. Rótulo sete 1. Tubos de microcentrífuga de 5 mililitros de um a seis e amostra e alíquota de 1000 microlitros do reagente de Bradford em cada tubo. Seis dos tubos serão usados para fazer uma curva padrão, adicionando várias quantidades de quantidades conhecidas de BSA a cada tubo. Os valores a serem adicionados estão listados nesta tabela. No sétimo tubo de amostra, adicionar um microlitro do lisado pré-limpo. Coloque 200 microlitros de cada um dos sete tubos em poços individuais de uma placa de fundo plano de 96 poços, repetindo cada amostra em triplicado para que haja três colunas de sete amostras. Leia a placa em um leitor de placas, usando um comprimento de onda de 595 nanômetros. Depois de criar uma curva padrão no Excel, calcule a concentração de proteína do lisado pré-limpo.

Em seguida, rotule dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro - um como controle e outro como teste, que neste exemplo, será o anticorpo c-myc. Coloque 500 microgramas do lisado pré-limpo em cada um desses tubos e, em seguida, aumente o volume total de cada tubo para 500 microlitros usando tampão de lise. Em seguida, adicione dois microgramas do anticorpo anti-c-myc ao tubo do grupo de teste. Para o controlo, adicionar dois microgramas do anticorpo de controlo do isotipo IgG1 do ratinho. Uma vez que os anticorpos são adicionados aos tubos, coloque as amostras em um rotador em uma câmara fria e incube por duas horas. Agora, adicione as contas de agarose. Para fazer isso, recomenda-se cortar a ponta de uma ponta de pipeta e, em seguida, usando esta ponta modificada, adicionar 200 microlitros de esferas de proteína A/G PLUS-agarose a cada tubo. Incube os tubos em um rotador na câmara fria durante a noite.

Após a incubação, remova os tubos do rotador e gire os lisados na microcentrífuga para puxar os grânulos para baixo. Após a rotação estar completa, remova os tubos da centrífuga e aspire o sobrenadante de cada tubo. Em seguida, lave as contas usando 500 microlitros de PBS 1X Dulbecco. Coloque os tubos em uma microcentrífuga e gire para baixo por 30 segundos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o sobrenadante. Repita as etapas de lavagem e centrifugação mais uma vez para um total de duas vezes. Remova os tubos da microcentrífuga e aspire o tampão de cada tubo. Usando pontas de carregamento de gel, remova qualquer tampão restante das contas, mantendo as contas no gelo para eluir a proteína ligada.

Neste exemplo, a proteína é eluída no tampão de execução SDS-PAGE por ebulição para análise de Western blot. Para fazer isso, ressuspenda os grânulos em 20 microlitros de corante de carregamento SDS-PAGE contendo beta-mercaptoetanol, ou BME. Ferva as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos para dissociar os imunocomplexos das contas. Em seguida, centrifugue os grânulos na velocidade máxima por 10 segundos em temperatura ambiente. Remova os tubos da microcentrífuga e segure-os em um rack em temperatura ambiente. Usando pontas de carregamento de gel, pipete cuidadosamente as amostras dos grânulos e carregue-as em poços de um gel SDS-PAGE com gradiente de 4 a 15%. Além das amostras, carregue uma pista com uma escada de proteína, bem como uma pista com o lisado pré-limpo para servir como controle de carga. Assim que o gel estiver carregado, execute o gel a 100 volts.

Depois que a frente do corante atingir o fundo do gel, o que deve levar aproximadamente uma hora, pare o gel e faça um sanduíche de Western blot, garantindo que a membrana de PVDF esteja entre o gel e o cátodo. Coloque o sanduíche Western blot no aparelho de transferência e transfira as proteínas do gel para a membrana por uma hora a 100 volts. Após a conclusão da transferência, coloque a membrana em cinco mililitros de bloco para evitar que os anticorpos se liguem de forma não específica à membrana. Balance em uma configuração baixa por uma hora em temperatura ambiente. Quando o temporizador soar, remova o buffer de bloqueio. Adicione cinco mililitros do tampão de bloqueio com o anticorpo de detecção à membrana. Aqui, um anticorpo anti-c-myc, diferente do usado para o pulldown, é usado.

Incube a mancha durante a noite, a quatro graus Celsius em um balancim em uma configuração baixa. Após a incubação, remova o anticorpo e o tampão de bloqueio. Lave a mancha, usando cinco mililitros de TBST por cinco minutos em temperatura ambiente, em um balancim em temperatura baixa. Esta etapa de lavagem deve ser repetida duas a cinco vezes para um total de três a seis lavagens, usando TBST fresco para cada lavagem. Adicione cinco mililitros de um a 1000 anticorpos secundários e tampão de bloqueio ao blot. Nesse caso, o anticorpo secundário é a cadeia leve anti-coelho marcada com HRP. Incube a mancha em um balancim em uma configuração baixa para um ou em temperatura ambiente. Em seguida, remova o tampão e lave o borrão com cinco mililitros de TBST. Incube esta lavagem em uma cadeira de balanço em uma configuração baixa por cinco minutos em temperatura ambiente. Repita esta lavagem para um total de seis a 12 lavagens, cada uma com cinco mililitros de TBST. Remova a lavagem final despejando primeiro o líquido da mancha. Em seguida, usando uma pinça, passe a borda da mancha em um lenço de laboratório para remover o excesso de líquido e, em seguida, coloque a mancha em um recipiente novo. Em seguida, cubra a mancha com 1X Reagente de Detecção Quimioluminescente e incube por um minuto.

Trabalhando rapidamente, aplique a borda da mancha em um lenço de laboratório para remover qualquer excesso de reagente de detecção e, em seguida, coloque a mancha na superfície de imagem da bandeja do Imager. Imagem usando o programa Quimioluminescente para capturar vários pontos de tempo de 10 a 30 segundos. Depois que a mancha for criada, escolha uma imagem com visibilidade de banda ideal e exporte essa imagem. Antes de mover o borrão, use o Gerador de imagens para tirar uma foto do borrão para capturar a localização da escada. Em seguida, exporte essa imagem também. Por fim, usando um software de preparação de slides, como o PowerPoint, alinhe as bandas e as imagens da escada para formar uma imagem.

Esta imagem mostra o resultado do Western blot para imunoprecipitação da proteína c-myc de células timócitos. Da esquerda para a direita, as pistas representam o controle do isotipo, o IP c-myc e a entrada de lisado pré-liberada. A pista na extrema direita é uma imagem mesclada da escada de peso molecular. A banda forte, em torno de 25 kilodaltons é da cadeia leve e a de 50 kilodaltons é da cadeia pesada do anticorpo de ligação e não são específicas para o IP ou as amostras. C-myc corre cerca de 67 kilodaltons em Western blots e geralmente é visível logo abaixo da faixa de escada de 75 kilodalton. Nesta mancha, a banda c-myc é visível na segunda pista, mas ausente na primeira faixa, indicando que o anticorpo IP puxou com sucesso o c-myc. Não há banda visível na faixa de lisado pré-limpa, sugerindo que essa proteína tem baixos níveis de expressão endógena.