Técnicas Baseadas em Imunoprecipitação: Purificação de Proteínas Endógenas Usando Esferas de Agarose

1. Imunoprecipitação usando contas de agarose de proteína agarose

Preparação de lysato celular

1. Centrifugar 10⁸ timócitos em uma microcentrifuuagem a 13.000 rpm por 3 min e remover o supernatante.
   Nota: O número celular variará dependendo dos níveis de expressão da proteína desejada e do tipo celular escolhido.
2. Suspenda-as as células em RIPA tampão de 500 μL com PMSF.
3. Interrompa as células usando alguns pulsos rápidos com um vórtice e, em seguida, aspire o lysate algumas vezes com uma agulha de 25 G presa a uma seringa.
   Nota: Evite criar bolhas. Use uma agulha maior, como uma agulha 21G para tipos de células maiores.
4. Incubar a célula no gelo por 10 minutos.
5. Centrifugar o lysate a 13.000 rpm por 15 min a 4°C.
6. Transfira o supernatante para um tubo de microcentrifuuge fresco e rotulado.

Pré-compensação

7. Adicione 20 contas de proteína A/G PLUS de proteína agarose e 1 μg de um anticorpo de controle de isótipo (aqui, o anticorpo de controle de isótipo do mouse IgG1 é usado), ao liseto.
   Nota: A escolha do anticorpo isótipo utilizado dependerá do anticorpo específico da proteína usado mais tarde na etapa de puxar para baixo.
8. Incubar a mistura de lise em uma rotadora centrífuga na sala fria (4°C) por 30 min.
9. Centrifugar a amostra a 3200 rpm para 30 s a 4°C.
10. Transfira o supernatante pré-limpo para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL fresco. Descarte a pelota.

Determinação da concentração de proteínas

11. Determine a concentração proteica do lise celular realizando um Ensaio bradford.
12. Aliquot 1000 μL Bradford Reagent em 7 tubos de microcentrífusão.
13. Adicione as seguintes quantidades de padrão de proteína BSA (2 mg/mL) em 6 tubos (Tabela 1).

Número do tubo	Volume BSA (μL) (2 mg/mL)	Concentração de proteínas (μg/μL)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

Tabela 1: Quantidades padrão de proteína BSA

14. No^tubo 7, adicione 1 μL do lise pré-limpo.
    Nota: Para garantir que a concentração da amostra esteja dentro da faixa de detecção de ensaios, prepare e analise uma diluição de 1:2 ou 1:5lysate também.
15. Coloque 200 μL de cada um dos 7 tubos em poços individuais de uma placa de fundo plano, 96-bem repetindo cada amostra em triplicado.
16. Leia placa em um leitor de placas a 595 nm.
17. Gere a curva padrão no excel e calcule a concentração proteica do lysate pré-limpo.

Demolir

18. Rotule dois tubos frescos de microcentrifuuge de 1,5 mL, um como "controle" e outro como "teste", que neste exemplo é c-myc.
19. Coloque 500 μg de lise pré-limpa em cada um desses tubos.
    Nota: A quantidade de proteína utilizada aqui dependerá da quantidade da proteína desejada para ser purificada.
20. Levante o volume total de cada tubo até 500 μL usando tampão de lise.
21. Adicione 2 μg de anticorpo anti-c-myc ao tubo de grupo de ensaio e 2 μg mouse IgG1 anticorpo de controle de isótipo ao grupo controle.
    Nota: A quantidade de anticorpos dependerá da eficáciado anticorpo e da quantidade da proteína alvo.
22. Incubar os tubos em uma rotadora na sala fria (4°C) por 2h.
23. Adicione 20 contas de proteína A/G PLUS agarose a 20 μL agarose a cada tubo.
    Nota: É aconselhável usar pontas de pipeta com a extremidade cortada para evitar danos às contas.
24. Incubar em uma rotadora em sala fria (4°C) durante a noite.
    Nota: Dependendo da proteína alvo e da eficácia do anticorpo, esta etapa pode variar de 1h a durante a noite.
25. Centrifugar os tubos a 3200 rpm para 30 s 4°C para puxar para baixo as contas.
26. Aspire o supernatante de cada tubo.
    Nota: A proteína alvo está agora ligada às contas.
27. Lave as contas duas vezes usando o PBS de 500 μL 1X Dulbecco.
28. Centrifugar os tubos a 3200 rpm para 30 s 4°C.
    Nota: Para uma lavagem mais rigorosa, use buffers mais rigorosos, como o RIPA.
29. Aspire o tampão de cada tubo. Usando pontas de carregamento de gel, remova qualquer tampão que sobrou das contas e mantenha as contas no gelo para estotar a proteína.
    Nota: Neste exemplo, a proteína é eluida em buffer de execução SDS-PAGE fervendo as contas, para análise de manchas ocidentais. Esta abordagem é adequada para verificar resultados ip ou para examinar interações proteína-proteína. Para outras aplicações a jusante, como a purificação de proteínas para análise estrutural ou enzimática, sistemas mais sofisticados, como tags de epítope (sinalização ou etiqueta de mamão) são usados para evitar a elução do anticorpo com a proteína de interesse.

2. Verificação ip através da análise de manchas ocidentais

Eletroforese SDS-PAGE:

1. Suspender de nova resolução em 20 μL de corante de carregamento SDS-PAGE contendo β-mercapto-ethonol.
2. Ferva as amostras a 95 °C por 5 minutos.
3. Centrifugar as contas a 13.000 rpm para 10 s em temperatura ambiente.
4. Utilizando pontas de carregamento de gel, encobante cuidadosamente as amostras obtidas das contas e carregue-as em poços de gel SDS-PAGE de 4-15% gradiente.
5. Além das amostras, carregue uma pista com uma escada de proteína, bem como uma pista com o lysate pré-limpo para servir como controle de carga.
6. Corra a 100 V até que a frente de corante atinja a parte inferior do gel (~1h).

Análise de manchas ocidentais:

7. Faça sanduíche de mancha ocidental, garantindo que a membrana PVDF esteja entre gel e cátodo vermelho.
8. Transferência para 1 h a 100 V.
9. Coloque a membrana em tampão de bloqueio de 5 mL à temperatura ambiente por 1h em um roqueiro em um ajuste baixo, para bloquear os locais de ligação proteica não específico.
   Nota: Os volumes de tampão de bloqueio, anticorpo primário, anticorpos secundários e lavagens podem precisar ser aumentados para manchas de tamanho maior.
10. Incubar a mancha com anticorpo anti-c-myc de 5 mL no tampão de bloqueio durante a noite a 4°C no roqueiro em um ajuste baixo.
    Nota: O anticorpo aqui utilizado deve ser diferente do usado na etapa de puxar para baixo.
11. Lave a mancha 3-6 vezes usando 5 mL TBST com cada lavagem sendo 5 min à temperatura ambiente em um roqueiro em um ajuste baixo.
12. Incubar a mancha com anticorpo secundário de corrente anti-coelho com marca HRP no buffer de bloqueio, por 1 h à temperatura ambiente no roqueiro em um ajuste baixo.
    Nota: A escolha do anticorpo secundário dependerá do anticorpo primário usado para a mancha ocidental. Além disso, uma cadeia leve específica secundária é usada no protocolo porque a proteína alvo está próxima em peso molecular à cadeia pesada do anticorpo. Se a proteína alvo estiver perto de 50kDa, use uma cadeia de luz específica secundária. Se a proteína alvo estiver próxima de 25kDa, use e cadeia pesada específica secundária.
13. Lave a mancha 3-6 vezes usando 5 mL TBST com cada lavagem sendo 5 min à temperatura ambiente em um roqueiro em um ajuste baixo.
14. Remova o líquido da mancha e dab borda da mancha em lenços de laboratório para remover o excesso de líquido.
15. Borra de cobertura com 1x reagente de detecção de chemiluminescente' e incubar por 1 min.
    Nota: As etapas a seguir devem ser feitas em rápida sucessão, pois o reagente de detecção é sensível à luz e ao tempo.
16. Borda dab de mancha em lenços de laboratório para remover o reagente de detecção em excesso.
17. Coloque a mancha na superfície de imagem da bandeja Imager.
    Nota: Manchas de chemiluminescentes também podem ser visualizadas usando filme.
18. Imagem usando o 'Programa Chemiluminescent' para capturar vários pontos de tempo de 10 s a 5 min.
    Nota: O tempo ideal pode mudar com base na quantidade de proteína e na qualidade do anticorpo.
19. Escolhai uma imagem com visibilidade de banda ideal e, em seguida, exporte essa imagem.
20. Antes de mover a mancha, tire uma foto da mancha usando o imager, para capturar a localização da escada. Então, exporte essa imagem também.
21. Usando um software de preparação de slides (como o PowerPoint), alinhe as bandas e as imagens da escada para formar uma única imagem.