Não-radioativo In situ Protocolo de hibridação Aplicável para a Noruega Spruce e uma variedade de espécies de plantas
17 de abril de 2009
Nós descrevemos um DIG modificado In situ Protocolo de hibridização, que é rápido e aplicável em uma ampla gama de espécies de plantas, incluindo a Noruega abeto. Com apenas alguns ajustes, incluindo alteradas RNase tratamento e concentração proteinase K, o protocolo pode ser utilizado em estudos de diferentes tecidos e espécies.
Protocolo de hibridização in situ não radioativa aplicável para a espruce-da-noruega e uma variedade de espécies vegetais. Carre Etal. Olá, meu nome é AM GaN, e estamos trabalhando na Universidade OBS e na Universidade Sueca de Ciências Agrárias em Uppsala, Suécia.
Estabelecemos um protocolo de visitação de insetos que funciona em várias espécies vegetais diferentes. Hoje vamos mostrar a você alguns passos exigentes. Neste protocolo, vamos demonstrar a inclusão, o corte em seções e as diferentes etapas do experimento real de visitação de insetos.
Vamos para o laboratório Um, fixação e inclusão, etapas de nove a onze do protocolo. Etapa nove, pré-aqueça as placas de Petri e as formas a 60 graus Celsius. Etapa dez, aqueça um par de pinças e distribua os tecidos uniformemente em uma placa.
Adicione mais parafina para cobrir os tecidos. Passo 11: deixe a parafina endurecer em temperatura ambiente. Dois passos sexuais 12 a 19 no protocolo.
Ligue as placas aquecedoras e tenha parafina histológica derretida disponível. Retire as amostras da câmara fria. Passo 13: use um bisturi para cortar cuidadosamente um bloco de tecido em parafina.
Modele a peça para facilitar o corte. Na etapa 14, aqueça o bloco frio e a sola para fundi-los juntos. Deixe o preparado endurecer a quatro graus centígrados.
Etapa 15, corte o bloco de parafina em seções com espessura de seis a oito micrômetros. Usando um micrótomo, as seções são ligadas em uma fita longa. Corte a fita e transfira-a para um papel.
Neste ponto, é possível inspecionar as seções individuais sob um microscópio estereoscópico para selecionar as seções de interesse. Será fácil realizar uma inspeção com tecidos ou corados com eosina. Passo 17: adicione água Milli Q livre de RNA sobre as lâminas.
Corte a fita em pedaços menores e coloque-os sobre as lâminas. Transfira as lâminas para a placa aquecedora. Passo 17, deixe as fitas achatarem em uma placa a 42 graus centígrados por um a dois minutos.
Remova a água utilizando Kim oil. Passo 19, incubar as lâminas a 42 graus centígrados durante a noite para que os tecidos aderem às lâminas para hibridização in situ 4.1 na seção in-situ. Passos de pré-tratamento de 36 a 48 no protocolo.
Passo 36: desidratação de seções na camada de histologia. Os lâminas são dispostos de forma uniforme e colocados em uma grade para facilitar o movimento entre diferentes recipientes, desidratando as seções. Em uma série de etanol, adicione anidrido acético sob agitação vigorosa.
Passo 45, preparação para o tratamento com anidrido acético 4,2 na hibridização in situ. Passos 49 a 52 em um protocolo. Passo 51, envelhecimento de lâminas pro um mais.
A solução é viscosa. Tente evitar bolhas. Incube as lâminas em uma câmara úmida.
4.3 início. Após hibridização, etapas 53 a 72 do protocolo. Etapa 62, incubar as lâminas com o bloqueador burer em um recipiente plástico.
Passo 63, adicione quantidade suficiente de solução bloqueadora apenas para cobrir as lâminas. Os anticorpos são adicionados às lâminas utilizando o envelhecimento. O envelhecimento funciona apenas com lâminas prob bon plus. Para lâminas de design semelhante, Passo 65, permita que as forças capilares puxem para cima a solução de anticorpo anti-dig.
Este passo é repetido. Passo 70, como antes, em sanduíche e aspire a solução azul western. Observe que a solução azul western é aspirada duas vezes, assim como fizemos para a solução de anticorpo anti-dig.
E na etapa 65, etapa 71, incubar as lâminas no escuro por um a cinco dias. À temperatura ambiente, o monitoramento dos sinais de hibridização pode ser realizado em um microscópio estereoscópico. Enquanto as lâminas ainda estiverem em sanduíche, deve ser possível observar manchas roxas a acastanhadas.
Este é o aspecto dos Resultados obtidos no experimento com a estação CW. É possível observar o sinal aqui como uma coloração roxa ou acastanhada.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo modificado de hibridização in situ com DIG que é eficiente e adaptável a diversas espécies vegetais, incluindo o abeto-de-noruega. O protocolo incorpora ajustes específicos, como alterações no tratamento com RNase e na concentração de proteinase K, para aumentar sua aplicabilidade em diferentes tecidos e espécies.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia vegetal
- Biologia molecular
- Técnicas de hibridização in situ
Antecedentes
- A hibridização in situ é uma técnica valiosa para o estudo da expressão gênica em tecidos.
- Métodos tradicionais podem ser demorados e específicos para espécies.
- Modificações em protocolos existentes podem melhorar a eficiência e a versatilidade.
- Este estudo concentra-se em um protocolo adequado para uma variedade de espécies vegetais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo de hibridização in situ mais rápido e adaptável.
- Demonstrar a aplicabilidade do protocolo para o espruce-da-noruega e outras espécies de plantas.
- Fornecer etapas procedimentais detalhadas para pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Inclusão e seccionamento de tecidos vegetais.
- Passos de pré-tratamento e hibridização para análise in situ.
- Uso de reagentes e condições específicas para otimizar os resultados.
- Monitoramento dos sinais de hibridização ao microscópio.
Resultados Principais
- O protocolo modificado facilita com sucesso a hibridização in situ em múltiplas espécies vegetais.
- Ajustes no tratamento com RNase e na concentração de proteinase K melhoram a compatibilidade com os tecidos.
- Foi obtida uma visualização nítida dos sinais de hibridização.
- O protocolo é eficiente e reprodutível para diversas aplicações.
Conclusões
- O protocolo modificado de hibridização in situ com DIG é uma ferramenta valiosa para a pesquisa em plantas.
- Permite a análise rápida e eficaz da expressão gênica em diversos tecidos vegetais.
- Estudos futuros podem se basear neste protocolo para aplicações mais amplas na biologia vegetal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a análise de expressão gênica espacial com alta resolução em sistemas vegetais, apoiando a validação de alvos na fase inicial de descoberta ao confirmar padrões de expressão específicos de tecidos. Ele reduz a dependência de radioisótopos e de extensas otimizações específicas por espécie, melhorando a reprodutibilidade e a escalabilidade para estudos comparativos entre espécies. O método oferece valor mecanicista de mitigação de riscos para triagem fenotípica e descoberta de biomarcadores translacionais em pipelines de biofármacos baseados em plantas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Confirma a localização específica de mRNA em tecidos para investigar hipóteses terapêuticas e esclarecer a função gênica em vias de desenvolvimento reprodutivo.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da visualização direta da expressão gênica em órgãos reprodutivos masculinos em modelos de gimnospermas e angiospermas.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança preditiva ao demonstrar padrões conservados de expressão de genes homólogos (por exemplo, homólogos de AP3) em estruturas florais de Arabidopsis, Brassica e pinheiro-norueguês.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaio: Prepara seções padronizadas de tecido para ensaios de hibridização em etapas subsequentes, com detecção de sinal consistente utilizando sondas marcadas com DIG.
- Reprodutibilidade: Elimina o tratamento com RNase e ajusta a concentração de proteinase K para aumentar a intensidade do sinal e reduzir a variabilidade entre espécies.
- Escalabilidade: Facilita a aplicação em alto rendimento em diversas espécies vegetais com mínimos ajustes no protocolo, permitindo a reutilização da plataforma em genômica comparativa.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Demonstra aplicabilidade de angiospermas modelo para gimnospermas, apoiando a extrapolação de descobertas para sistemas lenhosos perenes relevantes para a produção de biomassa e biopolímeros.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Reduz a ambiguidade na atribuição de função gênica ao vincular homologia de sequência à expressão espacial em estruturas desenvolvimentais conservadas.
- Alinhamento de Biomarcadores: Permite a correlação espacial da expressão gênica com características fenotípicas em tecidos reprodutivos, apoiando a descoberta de biomarcadores na agricultura molecular de plantas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase de biologia de descoberta, permitindo a identificação de alvos orientada por hipóteses antes da triagem de compostos líderes em sistemas de expressão baseados em plantas.
- Biologia Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao validar a expressão espacial de genes candidatos em tecidos específicos e estágios de desenvolvimento.
- Triagem: Gera leituras espaciais quantitativas que orientam o desenho de ensaios para monitoramento de efeitos de compostos em tecidos transgênicos ou tratados.
- Análises: Produz sinais cromogênicos detectáveis (de roxo a acastanhado) passíveis de imagem e análise comparativa entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona padrões de expressão gênica com fenótipos de desenvolvimento em órgãos reprodutivos, apoiando decisões de avanço em pipelines de validação de características.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado e adaptável para análise de expressão gênica interestecidual, reduzindo esforços redundantes de otimização.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos por meio da detecção direta e com resolução espacial de mRNA, sem riscos radioativos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade ao eliminar o tratamento com RNase e padronizar o uso da proteinase K, reduzindo as taxas de falha do protocolo.
- Valor Estratégico: Acelera decisões de avanço ou interrupção na seleção de alvos ao fornecer dados inequívocos de expressão no início da fase de descoberta.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em padrões de expressão conservados entre espécies, melhorando as taxas de sucesso em aplicações posteriores.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em histologia, inclusão de tecidos e corte de materiais vegetais.
- Depende do acesso a micrótomos, fornos de hibridização e sistemas de detecção cromogênicos.
- Necessita padronização da concentração de proteinase K com base na densidade do tecido e no teor de fenóis.
- Envolve adaptação dos tempos e temperaturas de incubação para diferentes espécies e comprimentos de sonda.
- Limitado pela autofluorescência do tecido e pela penetração de compostos em amostras altamente lignificadas ou ricas em metabólitos secundários.
