Labeling fluorescentes de Drosophila Estruturas Coração

Olá, sou Nikita Ari, do Laboratório de Ralph Boer, no programa de Desenvolvimento e Envelhecimento do Instituto Burnham de Pesquisa Médica. Eu sou Gil ler também do laboratório inferior. Hoje vamos mostrar procedimentos para a marcação fluorescente de estruturas cardíacas Laval e pré-solares adultas.

Utilizamos este procedimento em laboratório para preparar os tubos cardíacos para análise morfológica e estrutural via microscopia confocal ou fluorescente a fim de marcar fluorescentemente estruturas cardíacas em drosófilas adultas. Primeiro, faça um único corte entre o tórax e o abdômen em um adulto semi-intacto para separar os segmentos do corpo. Em seguida, apare as bordas ventrais salientes da cutícula adulta.

Em seguida, transfira e rotule amostras de larvas adultas ou dissecadas com anticorpos primários e secundários. Após a rotulagem, monte espécimes adultos lavados segurando as bordas da cutícula e colocando-as com o coração voltado para baixo em uma gota de escudo vetorial em uma lamínula, inverta a lamínula em uma gota de meio ladeada por duas lamínulas em uma lâmina para formar uma ponte. Com os corações agora suspensos na vertical para montar corações larvais.

Transfira as amostras para uma lâmina com os lados ventrais voltados para baixo, monte duas lamínulas de cada lado da lâmina. Finalmente, forme uma ponte com uma terceira lamínula, colocando-a primeiro na lamínula perto das extremidades posteriores das larvas. Os corações agora estão prontos para a imagem.

Antes de iniciar este procedimento, prepare o seguinte tampão relaxante A DH contendo A DH conforme descrito em outro protocolo de vídeo desta série com fixador EGTA 10 milimolar composto de formaldeído a 4% em um X-P-B-S-P-B-S, TX e anticorpos primários adequadamente diluídos e anticorpos secundários marcados com fluorescência. Em PBS TX, dissecar drosófila adulta e larva para expor os tubos cardíacos seguindo a preparação do coração de drosófila semi-intacta mostrada nos protocolos de vídeo visualizando o coração batendo em drosófila e protocolo de dissecção de larvas de drosófila NMJ. Mas com modificações, use um HD oxigenado durante a dissecção da larva e desloque os pinos posteriores ligeiramente da larva da linha média ventral.

Corte ao longo da linha média ventral. Não remova nenhum tecido antes da fixação nas etapas a seguir. Inicie o procedimento de rotulagem verificando ao microscópio se todos os corações estão se contraindo e relaxando ritmicamente em A DH oxigenado. Em seguida, substitua rapidamente um DH por um tampão relaxante e reexamine cada tubo cardíaco para garantir que as contrações sejam inibidas.

Prossiga para consertar os corações substituindo o amortecedor relaxante por fixador. Incube em temperatura ambiente por 20 minutos com agitação suave. Observe que, para preparações larvais, a agitação não é necessária em nenhuma etapa e pode até ser prejudicial à integridade do tecido cardíaco.

Ao final de 20 minutos, remova o fixador e lave as amostras três vezes por 10 minutos de cada vez com P-B-S-T-X. À temperatura ambiente com agitação contínua para adultos, faça um único corte entre o abdômen e o tórax com cuidado e limpeza. Separe os dois segmentos do corpo para garantir danos mínimos à região anterior do coração.

Tenha cuidado para não cortar a seção abdominal anterior onde está a câmara cônica do coração. Examine a amostra ao microscópio para garantir que um corte limpo foi feito. Em seguida, apare cuidadosamente todas as bordas ventrais salientes da cutícula abdominal, de modo que o que resta seja mais elíptico e menos redondo.

Para corações larvais usando pinças finas, remova cuidadosamente o corpo gorduroso. Execute isso com extremo cuidado. Como o coração larval é especialmente frágil e tem muito pouco apoio de outros músculos ou tecido conjuntivo, não remova os ramos traqueais, pois isso pode danificar o coração.

Em seguida, incubar com o anticorpo primário, que é diluído em PVS TX e dispensado a 50 microlitros por poço de uma placa de 96 poços. Para moscas adultas, segure a cutícula dorsal aparada pelas bordas sem tocar no tubo cardíaco localizado centralmente e transfira para a placa. Não colocar mais de 12 amostras por alvéolo e incubar à temperatura ambiente durante duas horas com agitação contínua.

Segure os espécimes larvais pela borda usando uma pinça e transfira para o PBST preenchido. Bem, novamente, não agite os espécimes larvais no final da incubação. Remova a solução primária de anticorpos.

Lave os corações três vezes por 10 minutos de cada vez com 100 microlitros P-B-S-T-X em temperatura ambiente após a última lavagem a 100 microlitros do anticorpo secundário em PBS tx suplementado com Alexa 5 9 4 Phin. Mantenha as amostras cobertas para evitar o branqueamento com flúor quatro a partir de agora e incube por uma hora em temperatura ambiente. Remova a solução de anticorpo secundário e lave os corações três vezes por 10 minutos de cada vez com 100 microlitros de P-B-S-T-X em temperatura ambiente.

Por fim, remova o TRITTON X 100 enxaguando os corações em 100 microlitros de PBS por 10 minutos. As amostras podem ser armazenadas no escuro a quatro graus Celsius por vários dias antes da montagem. Primeiro, prepare o slide para montagem.

Aplique três uniformemente espaçados. Gotas de 10 microlitros de meio de montagem de escudo vetorial em um microscópio. Deslize coloque duas lamínulas de 18 por 18 milímetros nas gotas externas, mantendo as lamínulas com cerca de 10 a 15 milímetros de distância.

Além disso, coloque 20 microlitros de escudo vetorial no centro de uma terceira lamínula. Em seguida, segure a mosca adulta dissecada pelas bordas extremas da cutícula. Para removê-lo cuidadosamente da solução de lavagem PVS, coloque-o suavemente com o lado do coração voltado para baixo na gota do meio de montagem na terceira lamínula, não mais do que cinco corações por gota na lamínula.

Depois de colocar os corações na gota, que está na lamínula, verifique ao microscópio para garantir que todos os corações estejam voltados para baixo. Agora inverta cuidadosamente a lamínula com os corações e coloque-a rapidamente na lâmina segurando o par de lamínulas de modo que a gota da lamínula invertida contendo os tubos cardíacos se funda com a gotícula do escudo vetorial que repousa no espaço entre as lamínulas. Emparelhe desta forma, as três lamínulas formam uma ponte.

Os corações serão suspensos entre a lamínula do meio e o microscópio. Deslize sob a ponte e verifique sob um microscópio para garantir que os corações das moscas adultas estejam voltados para cima usando esmalte. Fixe as lamínulas nas bordas.

Os corações agora estão prontos para serem fotografados por microscopia fluorescente ou confocal. Para montar corações larvais, coloque uma gota de cerca de 20 microlitros de escudo BTA em uma lâmina de microscópio usando uma pinça fina. Segure as larvas nas bordas da cutícula e transfira-as cuidadosamente para a gota.

Oriente as larvas com o lado dorsal para baixo usando agulhas de tungstênio. Coloque até duas larvas em uma lâmina. Em seguida, arraste cada amostra para fora do meio de montagem e alinhe as larvas em paralelo.

Coloque uma lamínula de cada lado dos corações alinhados usando uma pinça. Coloque uma terceira lamínula em cima primeiro, colocando um lado na lamínula frontal e abaixando-a até a lamínula traseira. Formando assim uma ponte.

As forças capilares causarão um fluxo de escudo vetorial de trás para frente, o que ajuda no alinhamento adequado do coração larval. Por fim, fixe todas as lamínulas nas bordas com esmalte e preencha cuidadosamente o espaço entre as lamínulas com 20 a 30 microlitros de vedação de proteção vetorial com esmalte e armazene a quatro graus Celsius para armazenamento de curto prazo ou a menos 20 graus Celsius por um longo período de tempo. Quando executado corretamente, todos os componentes e tecidos associados do vaso dorsal devem permanecer intactos e ser facilmente visualizados.

A fluorescência de fundo deve ser mínima para adultos. A camada muscular longitudinal ventral cora muito bem e produz um sinal substancial. Os cardiomiócitos circulares subjacentes, no entanto, tendem a não produzir um sinal tão intenso quanto o que vem da camada ventral sobrejacente.

Os miócitos da câmara cônica anterior do coração adulto contêm uma quantidade substancial de material contrátil e, conseqüentemente, essa região aparece como a mais robusta em relação ao restante do tubo cardíaco. A imagem do coração larval mostra um arranjo miofibrilar em espiral. Semelhante ao dos cardiomiócitos contráteis adultos, acabamos de mostrar seu protocolo de preparação e coloração de corações ovulares para microscopia fluorescente e confocal.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de limitar qualquer manuseio desnecessário. Isso garantirá uma melhor estrutura cardíaca intacta e preservada. Este protocolo serve apenas como ponto de partida.

Como acontece com qualquer outra imuno-histoquímica, diferentes anticorpos requerem condições diferentes e precisam ser otimizados individualmente. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com sua coloração.