Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

O sistema myth baseia-se no conceito de ubiquitina dividida, que se refere à capacidade da ubiquitina de ser estavelmente separada em duas metades: a terminal N-terminal UBI e a terminal C-terminal CUB, capazes de se recombinar em uma molécula pseudoubiquitina completa. Embora essa reconstituição seja espontânea ao utilizar a NUBI do tipo selvagem, a introdução de uma mutação de isoleucina 13 para glicina, produzindo um fragmento denominado NUBG, reduz drasticamente sua afinidade pela CUB, bloqueando assim a formação da pseudoubiquitina. Se as partes NUBG e CUB forem fundidas às proteínas A e B, respectivamente, e se essas proteínas forem capazes de interagir, então a molécula de pseudoubiquitina poderá ser novamente formada.

No mito, iscas de membrana integral são fundidas a um ataque consistindo do fragmento CUB ligado a um fator de transcrição artificial. Enquanto as presas são fundidas ao fragmento NUBG, uma interação entre a isca e a presa leva à reconstituição da pseudo ubiquitina, que por sua vez pode ser reconhecida por enzimas desubiquitinadas citosólicas ilustradas como tesouras. Essas enzimas clivam após o C-terminal do CUB, liberando o fator de transcrição, que então pode entrar no núcleo e ativar o sistema repórter, permitindo o isolamento seletivo e a identificação de células nas quais ocorrem interações entre BA e presas.

Olá, sou Janie Snyder do Laboratório Igor STAARs, nos departamentos de genética molecular e bioquímica da Universidade de Toronto. Hoje vou mostrar um procedimento para o teste de duplo híbrido em membrana, ou myth, que utilizamos em nosso laboratório para estudar as interações de proteínas de membrana integrais. Vamos começar.

Antes de realizar a análise MYTH, verifique se sua proteína isca possui a extremidade N e/ou C no citosol da célula. A marcação CUB-LexA-VP16 deve ser fundida à sua proteína nessa extremidade. Uma vez que as enzimas desubiquitinadas necessárias para a liberação do fator de transcrição estão localizadas no citosol, caso a topologia da sua proteína isca não seja conhecida, você pode gerar construtos marcados tanto na extremidade N quanto na C e utilizar o teste controle N-U-B-G-I descrito brevemente a seguir, para verificar se algum desses é adequado para uso no MYTH, indicando assim que uma determinada extremidade é citosólica.

Em seguida, decida qual das duas variantes principais do myth é adequada para o seu experimento. Para proteínas nativas de levedura, o myth integrado ou immy é o método de escolha. No immy, as leveduras são marcadas endogenamente com a etiqueta CUB Lex a VP 16, mantendo-as sob o controle de seus próprios promotores.

Isso é vantajoso porque o nível de expressão do tipo selvagem de Bates ajuda a eliminar problemas associados à superexpressão proteica, como um aumento no número de falsos positivos para proteínas de levedura não nativas. Pode-se utilizar o mito tradicional ou T mito, no qual iscas com as marcações CU B Lex A V VP 16 são superexpressas ectopicamente a partir de um plasmídeo. Neste protocolo, focaremos no T mito, já que esta forma de mito é mais amplamente aplicável. Com exceção da construção inicial da isca e do meio utilizado, ambas as formas de mito são realizadas de maneira essencialmente idêntica. A isca deve ser clonada em um vetor apropriado para marcação e expressão.

Atualmente, uma variedade de vetores T myth está disponível, como BV quatro, p, a, BV quatro e PCM BV quatro, os quais permitem a construção de Bates marcadas na extremidade C-terminal, Beit Cub Lexie, VP 16 sob o controle de um promotor TF um forte, A DH um forte e CYC um fraco, respectivamente. Uma vez que o efetor da equipe tenha sido selecionado, realiza-se a digestão por enzimas de restrição no plasmídeo no sítio de restrição apropriado. A clivagem deve ocorrer apenas nas imediações imediatas da marcação CU B Lxe VP 16, localizada a montante da marcação para marcação na extremidade C-terminal ou a jusante para marcação na extremidade N-terminal.

Por exemplo, ao usar o vetor PAM BV, SFI um é uma escolha ideal; após a digestão do plasmídeo, armazene-o a menos 20 graus Celsius até o momento do uso. O próximo passo é projetar os iniciadores para a amplificação e clonagem do gene de interesse. A extremidade cinco prima do seu iniciador direto deve corresponder a aproximadamente 35 a 40 nucleotídeos a montante do sítio de restrição. Já a extremidade três prima deve corresponder aos primeiros 18 a 20 nucleotídeos do gene alvo, que é um DRB dois que codifica o receptor beta dois e genérico.

No nosso exemplo, a extremidade cinco prima do iniciador reverso deve corresponder ao complemento reverso de aproximadamente 35 a 40 nucleotídeos a jusante do sítio de restrição. Com a extremidade três prima correspondendo ao complemento reverso dos últimos 18 a 20 nucleotídeos do gene alvo, omitindo o códon de parada se a marcação com a etiqueta VP16 do CU B Lex estiver sendo realizada na extremidade C, como ocorre no exemplo apresentado. Dependendo de se a marcação está sendo feita na extremidade N ou C, certifique-se de que os 35 a 40 nucleotídeos selecionados da sequência do plasmídeo utilizados no iniciador direto ou reverso resultem no clonagem do gene alvo em quadro com o CU B Lex e a etiqueta VP16. Uma vez que, no nosso exemplo, a extremidade C da proteína A DRB dois será marcada.

As 35 bases da sequência de A MBV no iniciador reverso foram selecionadas de modo que as sequências dos genes A DRB dois e CUB fiquem dentro do mesmo quadro de leitura; amplifique o gene de interesse por PCR utilizando os iniciadores selecionados. Os parâmetros da PCR dependerão da enzima específica e dos iniciadores utilizados, a fim de proporcionar um ambiente no qual a recombinação homóloga por reparo de lacuna possa ocorrer. O plasmídeo previamente digerido e o gene de interesse amplificado são transformados em uma linhagem de levedura apropriada utilizando um protocolo padrão de transformação de levedura, como o descrito por Geets e Woods.

Após o crescimento do fermento transformado na placa, escolha uma única colônia da linhagem e inócula-a em cinco mililitros de SD sem leucina. Incube o meio líquido a 30 graus Celsius durante a noite, após o cultivo ter crescido durante a noite e atingido a saturação. Centrifugue as células a 700 ×g por cinco minutos e remova o sobrenadante. Isole o DNA plasmidial isca do pellet celular utilizando qualquer kit de miniprep comercial.

Siga o protocolo padrão com uma modificação para garantir uma lise celular suficiente de levedura, utilizando um volume pequeno de 0,5 milimolar de esferas de vidro soda-lime adicionadas ao pellet após a ressuspensão inicial, e vortexie vigorosamente por cinco minutos. Em seguida, prossiga com o protocolo comercial normalmente. Transforme o DNA de levedura isolado em uma linhagem de E. coli quimicamente competente, adequada para propagação de plasmídeos, com eficiência de transformação de pelo menos 1 × 10⁷ células por micrograma de DNA.

Após colher o DNA plasmidial das bactérias E. coli transformadas, verifique a construção adequada do plasmídeo isca por meio de sequenciamento antes de utilizá-lo; as linhagens isca devem ser analisadas para garantir que as proteínas isca estejam corretamente localizadas na membrana de levedura. A localização é determinada por microscopia de fluorescência. A inclusão de uma molécula YFP na sequência da marcação da isca permitirá a visualização direta de células vivas e é comumente utilizada em iMY.

Alternativamente, uma abordagem padrão de imunofluorescência utilizando anticorpo contra os componentes Lex A ou VP 16 da etiqueta pode ser utilizada após a correta localização da isca ter sido estabelecida. É necessário garantir que a isca não ativa por si mesma o IE, ou seja, que não ativa o sistema repórter sozinha ou na presença de proteínas controle não interagentes; para assegurar que a isca não é autoativadora, empregamos o teste N-U-B-G-I. Neste teste.

A isca é transformada com uma proteína positiva interagente e uma proteína controle negativa não interagente, e então diferentes diluições de cada transformante são depositadas em meios seletivos apropriados. A isca deve crescer em meio seletivo na presença do controle positivo e não deve crescer na presença do controle negativo para ser adequada para uso no MYTH. Uma vez que a isca tenha sido validada, a linhagem repórter MYTH contendo a isca pode ser transformada com uma biblioteca de presas de interesse para triagem de interações proteína-proteína.

Para iniciar esta transformação em larga escala de levedura, inocular uma única colônia da linhagem repórter myth contendo sua isca em cinco mililitros de meio SD sem leucina e incubar durante a noite a 30 graus Celsius com agitação. Diluir a cultura da noite em 200 mililitros de meio SD sem leucina e incubar a 30 graus Celsius com agitação até atingir uma OD 600 entre 0,6 e 0,7. Quando a OD 600 alvo for atingida, dividir a cultura de 200 mililitros entre quatro tubos de centrífuga de rosca de 50 mililitros e colher as células por meio de centrifugação.

Após lavar os pellets com água estéril duplamente destilada e solução de acetato de lítio trissy DTA, suspendemos cada pellet em 600 microlitros de solução de acetato de lítio trissy DTA em cada um dos quatro tubos cónicos de 15 mililitros com tampa rosqueável. Adicione 2,5 mililitros de solução de PEG-acetato de lítio a 600 microlitros de células ressuspendidas, 100 microlitros de solução de DNA de esperma de salmão e sete microgramas de DNA da biblioteca de presas quatro. Vortex os tubos por um minuto para garantir uma mistura completa e, em seguida, incube em banho-maria a 30 graus Celsius por 45 minutos.

Misture brevemente a cada 15 minutos após a incubação de 45 minutos. Adicione 160 microlitros de dimetilsulfóxido ou DMSO a cada tubo e misture imediatamente invertendo os tubos. Incube em banho-maria a 42 graus Celsius por 20 minutos.

Quando o choque térmico estiver completo, recolha as células por centrifugação e ressuspenda. Suspenda cada um dos pellets em três mililitros de dois X-Y-P-A-D. Reúna todas as amostras em um único tubo de centrífuga de 50 mililitros com tampa de rosca.

Incube as células a 30 graus Celsius por 90 minutos para recuperação celular. Centrifugue as células e re-suspenda o pellet celular em 4,9 mililitros de cloreto de sódio estéril a 0,9% usando 100 microlitros das células re-suspendidas. Prepare diluições seriadas de dez vezes em cloreto de sódio estéril a 0,9%, variando de 10 x até 10.000 x, plaque 100 microlitros das diluições 100 x e 1.000 x em meio seletivo e incube a 30 graus Celsius por dois a três dias.

Essas placas servem como controle e são usadas para calcular igualmente a eficiência da transformação. Divida os 4,8 mililitros restantes das células re-suspensas e plaque em placas grandes de 150 milímetros, incubando a 30 °C por três a quatro dias. Uma vez que as colônias tenham crescido, re-suspenda colônias isoladas, cada uma representando células contendo um possível par isca-presa interagente, em 100 microlitros de cloreto de sódio 0,9% e plaque alíquotas de cinco microlitros em meio seletivo contendo XG, deixando crescer por dois a quatro dias apenas.

Colônias que exibem crescimento robusto e cor azul são selecionadas para análises adicionais. Após o isolamento e o sequenciamento dos plasmídeos das colônias de levedura positivas, compile e analise todos os dados de sequenciamento para montar sua lista preliminar de interatores. Para verificar novamente essas interações, utiliza-se o teste de dependência da isca.

Neste teste, todos os plasmídeos de presa expressando os interatores identificados são transformados novamente na linhagem original de isca, bem como na linhagem que carrega uma isca artificial controle consistindo de um único domínio transmembranar fundido ao CUB Lex, uma etiqueta VP16. Re-suspenda colônias isoladas dessas transformações em 100 microlitros de água estéril duplamente destilada e aplique volumes de cinco microlitros sobre o meio seletivo apropriado acrescido de X sc. Idealmente, múltiplos transformantes devem ser selecionados para cada presa, e tanto a isca original quanto a isca artificial devem ser aplicadas na mesma placa. Incube as placas por dois a quatro dias a 30 graus Celsius. Leveduras que carregam a isca artificial nas quais a presa provoca ativação do sistema repórter são consideradas promíscuas, e essa presa específica é removida da lista de interatores.

Elogios que causam crescimento e coloração azul em leveduras com a isca de interesse, mas não com a isca artificial. Confirme uma interação específica. Se, no entanto, leveduras portadoras da presa e da sua isca de interesse não crescerem.

Esta presa é removida da lista de interatores. Os elogios restantes constituem a lista completa de interatores identificados na tela de mito. Após a conclusão do procedimento de mito, você terá um mapa de interação.

Isso representa uma coleção de interações candidatas que o pesquisador deve analisar mais a fundo por meio de estudos específicos determinados caso a caso. Para avaliar a significância biológica de cada uma, acabamos de mostrar como realizar o ensaio de duplo híbrido em membrana ou procedimento myth para identificar parceiros interagentes de uma proteína de interesse. Ao realizar o procedimento myth, é importante verificar se a sua proteína de interesse possui sua extremidade N ou C localizada no citoplasma da célula e planejar sua estratégia de marcação de acordo.

Além disso, é importante avaliar cuidadosamente se suas linhagens isca expressam adequadamente a isca e se a isca está corretamente localizada. Além disso, é essencial realizar o teste de Controle NUB GI, pois ele é útil para ajudar a estabelecer as condições de triagem. Por fim, certifique-se de verificar independentemente todas as interações que você detectar utilizando o myth.

Seguir estes passos simples deve garantir que você obtenha os melhores resultados possíveis do procedimento myth. Bem, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.