SDS-PAGE/Immunoblot Detecção de multímeros Aâ no tecido cortical Humanos homogeneizados utilizando antígeno Epitope-Retrieval

Este protocolo permite a detecção de uma beta maltase em tecido cortical humano. Primeiro, o tecido homogeneizado é sonicado com sonda e clarificado por centrifugação de baixa velocidade. Em seguida, amostras reduzidas são fervidas em tampão SDS e carregadas em um poliacrilamida.

As proteínas do gel são transferidas para uma membrana de nitrocelulose e a membrana é aquecida a vapor em solução salina tamponada com fosfato. Finalmente, em um agitador orbital, a membrana é incubada durante a noite com anticorpo primário, seguido de anticorpo secundário conjugado à HRP e, em seguida, com reagente de luminol e peróxido antes da exposição ao filme de raio X. Olá, sou Rebecca Rosen do laboratório de Larry Walker, do Departamento de Neurociência do Centro Nacional de Pesquisa Primata Yerkes na Universidade Emory.

Hoje vamos mostrar como detectar multímeros de Abeta e homogeneidade cortical utilizando eletroforese em gel de SDS e imunoblotagem com recuperação de antígeno induzida por calor. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os níveis e a distribuição de multímeros distintos de Abeta em tecidos corticais não fixados de humanos com doença de Alzheimer e primatas não humanos idosos. Então, vamos começar.

Inicie com cerca de cem miligramas de tecido cortical não fixado e homogeneíze para baixo em aproximadamente 400 microlitros de tampão gelado com cerca de 30 movimentos completos do pistilo. Para uma concentração de 20% peso por volume, a proporção entre massa do tecido e volume do tampão deve ser de um miligrama para quatro microlitros. Após a homogeneização, transfira os homogeneizados para um tubo de polipropileno de quatro mililitros e sonique com sonda três vezes por cinco segundos no nível de potência cinco.

Após a sonicação, transfira os homogenatos para tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro e centrifugue por cinco minutos a 3000 ×g. Remova cuidadosamente os sobrenadantes clarificados e armazene alíquotas de 50 microlitros desses extratos a menos 80 graus Celsius até o uso. Em seguida, determine a concentração total de proteína em alíquotas recém-descongeladas dos homogenatos clarificados utilizando um ensaio bioácido ou BCA, conforme as instruções do fabricante. Os homogenatos corticais clarificados a 20% devem apresentar concentração de proteína superior a cinco microgramas por microlitro e, portanto, podem ser diluídos na proporção de 1 para 10 para se adequar à faixa do leitor de placas. Para o ensaio BCA, prepare reações amostrais desnaturantes com as mesmas alíquotas dos homogenatos clarificados.

Utilize aproximadamente 50 a 60 microgramas de proteína total e ajuste o volume dos homogenatos corticais de forma correspondente, de modo que cada um contenha a mesma quantidade total de proteína. Prepare as amostras para um volume total de 25 microlitros para cada gel de 10 a 20% trice a ser executado. Para cada gel, prepare um controle positivo contendo de 10 a cem nanogramas do peptídeo sintético a beta 40 ou a beta 42 diluído em 1 X PBS até 10 microlitros, com 12,5 microlitros de tampão amostral 2 X SDS e 2,5 microlitros de agente redutor 10 X.

Após preparar todas as amostras, incluindo um controle beta, vórtex por cinco a 10 segundos e aqueça em banho seco a 100 graus Celsius por cinco minutos; em seguida, gire rapidamente todos os tubos para remover a condensação na tampa. Carregue as amostras em um gel imerso em tampão de corrida SDS trice em uma câmara eletroforética, carregando pelo menos uma poça com 10 microlitros de um marcador de peso molecular não diluído. Execute o gel a uma voltagem constante de 125 volts por cerca de 90 minutos ou até que o marcador de quatro kilo Dalton esteja a aproximadamente um centímetro da base do gel.

Remova cuidadosamente os géis das caixas plásticas e monte o sanduíche de transferência de acordo com as instruções do fabricante. Umedeça previamente os suportes de transferência e aponte para membranas de nitrocelulose micrométricas com tampão de tris-glicina. Transfira o tampão e remova todas as bolhas dos suportes de transferência ou do sanduíche formado pelo papel filtro e a membrana.

Encha a câmara interna do aparelho de transferência com tampão de transferência e a câmara externa com água destilada. Realize a transferência por duas a três horas com uma amperagem constante de 25 miliampères. Quando a transferência estiver completa, desmonte o "sanduíche" e coloque os géis em um recipiente contendo água destilada e as membranas em um recipiente contendo um XPBS para todas as etapas do protocolo.

Certifique-se de que os géis e membranas estejam completamente cobertos com fluido para evitar secagem. Para visualizar a eficiência da transferência proteica, cora os géis com corante azul seguro não diluído por cerca de uma hora de tempo de incubação e as membranas com corante vermelho PON S 1x por cerca de cinco minutos. Tempo de incubação de acordo com as instruções do fabricante; essa coloração não interferirá na imunodetecção.

Se a coloração revelar transferência ineficiente de proteínas, modifique o tempo de transferência na etapa três para recuperação de antígenos. Em um vaporizador, aqueça e feche hermeticamente a membrana em um saco plástico CapEx de alta resistência contendo cerca de 50 mililitros de um XPBS à temperatura ambiente. Coloque o saco em posição plana em um vaporizador pré-aquecido a 100 graus Celsius; uma vez que o saco comece a expandir, incube por mais 15 minutos antes de retirá-lo do vaporizador.

Deixe a membrana esfriar lentamente antes de removê-la do envelope para evitar excesso de rugas à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente a membrana do envelope e lave-a por cinco minutos com um XPBS em agitador orbital, seguido por uma lavagem de cinco minutos em TBST em agitador orbital. Em seguida, incube a membrana em solução bloqueadora por uma hora em agitador orbital sem lavagem prévia; transfira a membrana para uma placa contendo o anticorpo primário seis E 10, que é específico para a região terminal A beta, diluído de um para 1000 a um para 5.000 em solução bloqueadora.

Incube em um agitador orbital à temperatura ambiente por uma hora e, em seguida, de 24 a 48 horas com agitação a quatro graus Celsius. Após uma rápida lavagem, lave a membrana por 30 minutos. Em TBST, prossiga com três lavagens de 10 minutos cada em um agitador orbital.

Incube a membrana em anticorpo secundário conjugado à HRP diluído na proporção de um para 10.000 na solução bloqueadora durante 90 minutos em agitador, à temperatura ambiente. Neste protocolo, utilizamos anticorpo anti-US de ovelha. Novamente, enxágue a membrana por 30 minutos em TBST, iniciando com uma lavagem rápida e seguindo com três lavagens de 10 minutos cada em agitador orbital.

Após a última lavagem, incubar a membrana em reagentes super signal West Pico ECL recém-preparados e não diluídos por cinco minutos. Na agitadora em alta rotação, remover a membrana e eliminar o reagente em excesso. Utilizando papel filtro livre de fiapos ou lenços descartáveis, colocar a membrana em uma cassete de filme entre protetores plásticos e remover o reagente super signal adicional com lenços Kim livres de poeira.

Se necessário, exponha o filme Kodak Biomax MR a intervalos de 30 segundos, até 30 minutos, e desenvolva em revelador para filme. Após cinco minutos, as bandas do monômero de A beta provavelmente estarão saturadas neste experimento. Homogenatos clarificados contendo 50 microgramas de proteína total de sete indivíduos humanos foram analisados quanto à presença de beta amiloide multimérica ou A beta e proteína precursora da amiloide ou APP, a proteína transmembranar da qual o peptídeo A beta é clivado.

Aqui apresentamos imagens representativas de um experimento de western blot de A beta a PP com exposições de 30 minutos e cinco minutos. Uma exposição de 30 minutos permite visualizar as bandas muito mais fracas dos dímeros, trímeros, tetrâmeros e de pesos moleculares mais altos ou bandas de ligantes de Abeta, mas superexpõe as outras faixas com tempo de exposição de cinco minutos. A mesma banda de tetrâmero está presente, porém fraca, e permite que as outras faixas sejam claramente visualizadas.

Homogenatos corticais de indivíduos com doença de Alzheimer ou DA são observados nas pistas um a três, um indivíduo humano diagnosticado com demência por corpos de Lewy ou DCL e doença de Alzheimer é visto na pista quatro, casos de demência por corpos de Lewy são observados nas pistas cinco e seis e um caso controle humano idoso não demenciado. Na pista sete, a imunoblotagem com o anticorpo seis C 10 revelou monômeros, dímeros, trímeros, tetrâmeros de beta e um PP em todos os casos de Alzheimer, bem como abundantes formas de peso molecular mais alto de agregados de beta em dois casos de DA, o que é indicativo da heterogeneidade da beta-oligomerização entre indivíduos humanos sintéticos.

Uma beta 40 na faixa direita confirma a identidade das bandas de peso molecular mais baixo. Acabamos de mostrar a você um experimento de Western blot em gel SDS-PAGE para identificar multímeros de beta em homogeneizados de tecido não fixado provenientes de cérebros humanos com doenças neurodegenerativas. Ao realizar este procedimento, é importante preparar um homogeneizado cortical altamente concentrado para separação por eletroforese em gel, a fim de revelar multímeros de Abeta de baixa abundância.

É igualmente importante realizar a recuperação de epítopos de antígeno induzida por calor antes da imunodetecção com um anticorpo contra o peptídeo Abeta. A recuperação de antígenos ajuda a revelar epítopos de Abeta obscurecidos para uma ligação ideal do anticorpo durante a imunodetecção. Qualquer vaporizador, micro-ondas ou banho-maria que mantenha 100 graus Celsius será suficiente.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.