Name: SDS-PAGE/Immunoblot Detecção de multímeros Aâ no tecido cortical Humanos homogeneizados utilizando antígeno Epitope-Retrieval (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-23T04:53:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Aprenda a detectar multímeros de peptídeos Aβ em tecido cortical humano usando SDS-PAGE e imunoblot com recuperação de epítopo. Este método permite estudar mecanismos da doença de Alzheimer.

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Muito obrigado a Elaine Pranski e Suwyn Carolyn para assistência técnica excelente e Harry LeVine III, Paul M. Murphy, e Marla Orientar para conversas importantes. O financiamento foi fornecido pela RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, a Fundação Woodruff e da Emory University Research Committee.

Parte 1: Preparação dos homogeneizados de tecido esclarecidas <ol><li> Dounce homogeneizar o tecido cortical unfixed no volume 4 vezes de gelada tampão (0,1 M tampão fosfato [Ca + + - e Mg + + livre] mais 2x coquetel inibidor de protease [Santa Cruz]) com aproximadamente 30 golpes mesmo pilão (ie tampão adicionar 400μl a 100 mg de tecido). </li><li> Homogeneizados rodada por 5 minutos a 3.000 g (4 ° C). Remova cuidadosamente sobrenadante clarificado e alíquotas loja de extractos a -80 ° C até o uso. </li><li> Determinar a concentração de proteína total (mg / mL) para homogenatos esclareceu usando um ácido bicinchoninic (BCA) de ensaio, de acordo com as instruções do fabricante (ThermoFisher). </li></ol> Parte 2: SDS-PAGE Preparação da amostra <ol><li> Com um 10 bem, 10-20% tricine gel (Invitrogen), o volume máximo que pode ser carregado por poço é de aproximadamente 25μl. Volume total inclui tampão de amostra 2x SDS e agente redutor de 10x, de modo que o volume máximo de homogenato esclareceu que pode ser carregado por bem é 10μl. Esclareceu 20% (w / v) homogeneizados cortical deve ter uma concentração de proteína total superior a 5 mg / mL, permitindo a proteína total 50μg por poço. Amostras com menos de 5mg/ml proteína exigirá carregar menos proteína total por bem. No entanto, os níveis de proteína são ideais para a detecção de Aâ monomérica e agregados (50-60μg de proteína total é o ideal). Sempre carregue a mesma quantidade de proteína total por poço. </li><li> Para cada gel, carregar pelo menos um bem com 10μl de um marcador de peso molecular, tais como SeeBlue Plus2 (Invitrogen). Como um controle positivo, corrida de 10 100ng de Aβ40 sintéticos ou Aβ42 peptídeo (diluído em 1xPBS) em outro poço. </li><li> Prepare misturas de reação sobre o gelo, usando recém-descongelado, homogeneizados esclarecidas. Tubos de vórtice por 5-10 segundos, o calor em banho seco a 100 ° C por 5 minutos, em seguida, gire rapidamente todas as amostras para remover a condensação na tampa. </li></ol> Parte 3: SDS-PAGE de eletroforese em gel <ol><li> Carregar amostras agitadas em um gel tricine 10-20% na Gelbox XCell Bloqueio Celular Mini-Sure, usando tricine tampão SDS execução, de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen), </li><li> Executar gel a uma tensão constante de 125V por cerca de 90 minutos. Vamos executar amostras até que a banda marcador 4KDa é de cerca de 1 cm do fundo do gel. </li></ol> Parte 4: Proteínas de Transferência Géis para Membranas <ol><li> Remova cuidadosamente géis de caixa de plástico e montar o sanduíche de transferência dentro do Módulo II XCell Blot, de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Pré-molhada blotting almofadas e membranas de nitrocelulose com tampão de transferência de 0,2 Hm Tris-Glicina (20% metanol), e retire as bolhas de almofadas blotting ou o sanduíche de papel / filtro de membrana. </li><li> No Gelbox XCell, encha a câmara interna com tampão de transferência e encha a câmara externa com DIH 2 O (exposição ao metanol pode desgastar o plástico gelbox ao longo do tempo). </li><li> Executar a transferência por 2-3 horas em uma amperagem constante de 25mA. </li><li> Quando a transferência estiver completa, desconstruir o sanduíche e coloque o gel em DIH 2 O e as membranas em 1xPBS, tanto em pratos de plástico quadrado petri (ou outro recipiente adequado). </li><li> Para visualizar a eficiência da transferência de proteína, gel pode ser marcadas com SafeStain Simply Blue (Invitrogen), e as membranas com mancha vermelha Ponceau S (Sigma Aldrich), ambos de acordo com as instruções do fabricante. Esta coloração não irá interferir com immunoblotting. Se a coloração revela ineficiente transferência de proteína, modificar o tempo de transferência na Etapa 3. </li></ol> Parte 5. Antígeno-epítopo de recuperação e Immunoblotting <ol><li> Recuperação antigênica é um passo importante para revelar a epítopos Aâ na membrana para a ligação de anticorpos durante immunoblotting. Qualquer vapor, microondas ou banho de água que mantém uma temperatura constante de 100 ° C será suficiente. Para recuperação antigênica em um navio a vapor, calor selar a membrana em uma bolsa de plástico resistente Kapak preenchido com 1xPBS, à temperatura ambiente. Lay a bolsa apartamento em um navio a vapor pré-aquecido, uma vez que a bolsa começa a se expandir, incubar por mais 15 minutos. Permitir que a membrana para esfriar lentamente antes de removê-lo da bolsa, para evitar enrugamento excessivo. </li><li> À temperatura ambiente, remova cuidadosamente a membrana da bolsa vapor e enxaguar a membrana por 5 minutos em 1xPBS, seguido de um enxágüe de 5 minutos em TBS-T (Tris-Buffered pH, solução salina 8,0 com 0,05% Tween-20 [Sigma] ), em um agitador orbital. Incubar a membrana em solução de bloqueio (leite desnatado 2,5% em TBS-T) por uma hora, agitando. Sem enxaguar, transferência de membrana para um prato ou bolsa de plástico contendo o anticorpo primário diluído em solução de bloqueio (6E10 em 1:1.000 [1μg/ml] 1:5.000 [0.2μg/ml] diluição, Covance) bolha, evitandos. Incubar no agitador orbital em temperatura ambiente por uma hora e depois de 24-48 horas sacudindo a 4 ° C (mais de incubação pode dar um melhor sinal). </li><li> Lavar a membrana por 30 minutos em TBS-T (uma rápida lavagem seguido por 3 x 10 lavagens minuto). </li><li> Incubar a membrana no HRP-conjugado anticorpo secundário (Amersham ECL ovelhas anti-mouse, GE Healthcare), diluído 1:10000 em solução de bloqueio, por 90 minutos no agitador à temperatura ambiente. </li><li> Lavar a membrana por 30 minutos em TBS-T (uma rápida lavagem seguido por 3 x 10 lavagens minuto). </li><li> No agitador, incubar a membrana em recém-made SuperSignal reagente eletroquimioluminescência Pico West (ThermoFisher) por 5 minutos, limpe o excesso de reagente em papel que não solte fiapos do filtro e colocar a membrana em um cassete de filme, entre protetores da folha de plástico. Seque o reagente SuperSignal adicionais com poeira Kimwipes se necessário. </li><li> Expor a Kodak filme MR Biomax para intervalos de 30 segundos até 30 minutos e se desenvolver em um desenvolvedor de filme. Após 5 minutos, as faixas de monômero Aâ provavelmente será saturada. </li><li> Membranas pode ser despojado (após lavagem em TBS-T) por agitação em Restore Plus stripping tampão por 30 minutos em temperatura ambiente e reprobed com anticorpos adicionais se desejar. </li></ol> Parte 6: Representante Immunoblot: <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1a.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1b.jpg" alt="Figura 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1b"> <img src="/files/ftp_upload/1916/1916fig1c.jpg" alt="Figura 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1c"> Figuras 1a-c. Homogeneizados Esclarecido contendo 50μg de proteína total de 7 seres humanos são analisados ​​para a presença de Aâ multimérica e APP. Immunoblotting com anticorpo 6E10 revela Aâ monômeros, dímeros, trímeros, tetrâmeros e APP (faixa superior) em todos os casos de Alzheimer, bem como abundantes maior multímeros de peso molecular Aâ em 2 casos AD. Sintéticos Aβ40 confirma a identidade do menor bandas de peso molecular. AD: doença de Alzheimer, DLB: demência com corpos de Lewy, ND: Nondemented humano (a) exposição do filme de 30 minutos, (b) a exposição de filmes de 5 minutos, (c) 30 a exposição segundo filme..

<ol><li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297, 353-356 (2002).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).</li>
<li>Walker, L. C., LeVine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebral+proteopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">The cerebral proteopathies.</a> Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+amyloid%2C+and+Alzheimer%27s+disease%3A+a+perspective+in+honor%5BTitle%5D)+AND+%22of+Carl+Cotman.+Neurochem.+Res%22%5BJournal%5D)">Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor.</a> of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).</li>
<li>Walsh, D. M., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta+oligomers+-+a+decade+of+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Abeta oligomers - a decade of discovery.</a> J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).</li>
<li>Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+immunoblot+sensitivity+by+heating+of+hydrated+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters.</a> Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).</li>
<li>Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+hetergeneous+A4+peptides+in+human+cerebrospinal+fuid+and+blood+by+a+newly+developed+sensitive+Western+blot+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay.</a> J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).</li>
</ol>

Apesar da importância da agregação Aâ na patogênese da doença de Alzheimer 1,4,5, poucos estudos têm descrito ou quantificado a distribuição de diversos multímeros Aâ humana em amostras de tecido cortical 2. Comumente usado técnicas de imunohistoquímica não permitem a discriminação de distintas espécies Aâ multimérica no tecido cortical fixo. Em unfixed homogeneizados de tecido cortical, multímeros Aâ podem ser separados e bioquimicamente avaliada através de eletroforese em gel e métodos baseados e...

<table><tbody><tr><td>Comprimidos de Coquetel Completo de Inibidores de Protease</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-29130</td><td>1 comprimido em 25 ml de tampão</td></tr><tr><td>Kit de ensaio proteico BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Marca CE do Kit XCell SureLock Mini-Cell e Módulo de Western Blot XCell II</td><td>Invitrogen</td><td>EI0002</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>Agente Redutor para Amostras NuPAGE (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Padrão Pré-colorido</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine Gel 10-20%, 1,0 mm, 10 poços</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625BOX</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de nitrocelulose, 0,2 &amp;mu;tamanho de poro em m</td><td>Invitrogen</td><td>LC2000</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tris-Glicina Tampão de Transferência (25X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>Não interferirá na imunomarcação</td></tr><tr><td>Solução corante vermelho ATX Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09276</td><td>Não interferirá na imunomarcação</td></tr><tr><td>Sacos plásticos amostrais com selo térmico Kapak</td><td>Fisher Scientific</td><td>0181225AA</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonal murino 6E10 contra A&amp;#946;(1-16)</td><td>Covance</td><td>SIG-39320</td><td>Diluir de 1:1.000 até 1:5.000 para WB</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>ECL IgG de Camundongo, Conjugado com HRP, Completo&amp;#946; (de ovelha)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>Diluir na proporção de 1:10.000</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrato Quimiluminescente</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>34077</td><td></td></tr><tr><td>Filme Kodak Biomax MR</td><td>Carestream Health</td><td>870 1302</td><td></td></tr></tbody></table>

sds-page/immunoblot detecção de multímeros aâ no tecido cortical humanos homogeneizados utilizando antígeno epitope-retrieval

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

O dobramento anômala e polimerização da β-amilóide (Aâ) peptídeo é pensado para iniciar a cascata neurodegenerativa na patogênese da doença de Alzheimer<sup&gt; 1</sup&gt;. Aâ é predominantemente um 40 - ou 42 peptídeo de ácido-amino que está propenso a auto-agregação em β folhas ricas em fibrilas amilóides que são encontrados nos núcleos das placas senis cerebral na doença de Alzheimer. A evidência crescente sugere que o baixo peso molecular, multímeros Aâ solúveis são mais tóxicos que fibrilar amilóide Aâ<sup&gt; 2</sup&gt;. A identificação e quantificação de baixo e alto peso molecular de espécies Aâ multimérica no tecido cerebral é um objectivo essencial na pesquisa da doença de Alzheimer, e os métodos utilizados também podem ser aplicados para a identificação e caracterização de multímeros tóxicos em outras proteopathies<sup&gt; 3</sup&gt;. Naturalmente multímeros Aâ pode ser detectada por SDS-eletroforese em gel de poliacrilamida seguido por immunoblotting com Aâ anticorpos específicos. No entanto, a separação e detecção de Aâ multimérica requer o uso de altamente concentrado homogeneizados cortical e recuperação antigênica em pequenas membranas de poros do tamanho de nitrocelulose. Aqui nós descrevemos uma técnica para a preparação de esclarecer humanos homogeneizados cortical, a separação de proteínas por SDS-PAGE, e antígeno-epítopo de recuperação / Western blotting com anticorpo 6E10 para a região N-terminal do peptídeo Aâ. Usando este protocolo, que consistentemente detectar Aâ monômeros, dímeros, trímeros, tetrâmeros, e multímeros de peso molecular maior no tecido cortical dos seres humanos com a patologia de Alzheimer.

Nós descrevemos uma técnica para a preparação de esclarecer humanos homogeneizados cortical, separação de proteínas por SDS-PAGE, recuperação antigênica e immunoblotting com um anticorpo para o peptídeo Aâ. Usando este protocolo, que consistentemente detectar Aâ monomérica e multimérica no tecido cortical dos seres humanos com a patologia de Alzheimer.

SDS-PAGE/Immunoblot Detecção de multímeros Aâ no tecido cortical Humanos homogeneizados utilizando antígeno Epitope-Retrieval

Acredita-se que o enovelamento e a polimerização anômalos do peptídeo $\beta$-amiloide (A$\beta$) iniciem a cascata neurodegenerativa na doença de Alzheimer...

Este protocolo permite a detecção de uma beta maltase em tecido cortical humano. Primeiro, o tecido homogeneizado é sonicado com sonda e clarificado por centrifugação de baixa velocidade. Em seguida, amostras reduzidas são fervidas em tampão SDS e carregadas em um poliacrilamida.As proteínas do gel são transferidas para uma membrana de nitrocelulose e a membrana é aquecida a vapor em solução salina tamponada com fosfato. Finalmente, em um agitador orbital, a membrana é incubada durante a noite com anticorpo primário, seguido de anticorpo secundário conjugado à HRP e, em seguida, com reagente de luminol e peróxido antes da exposição ao filme de raio X. Olá, sou Rebecca Rosen do laboratório de Larry Walker, do Departamento de Neurociência do Centro Nacional de Pesquisa Primata Yerkes na Universidade Emory.Hoje vamos mostrar como detectar multímeros de Abeta e homogeneidade cortical utilizando eletroforese em gel de SDS e imunoblotagem com recuperação de antígeno induzida por calor. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os níveis e a distribuição de multímeros distintos de Abeta em tecidos corticais não fixados de humanos com doença de Alzheimer e primatas não

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A adição de palmitato reversível às proteínas é um importante regulador do tráfico intracelular de proteínas. Isto é de particular interesse, onde os neurónios em muitas proteínas sinápticas são palmitoilada. Nós utilizamos um método simples bioquímica para detectar proteínas palmitoilados em neurónios em cultura, que podem ser adaptadas para vários tipos de células e tecidos.

Detecção de palmitoylation proteína em neurônios cultivados por imunoprecipitação e Acil-Biotina Exchange (ABE)

Um protocolo de extração de proteínas comum utilizando tampão uréia / tiouréia / SDS para tecido cerebral humano e camundongos permite indentification de proteínas por 2D-DIGE e sua posterior caracterização por mini-immunoblotting 2DE. Este método permite a obtenção de resultados mais reprodutíveis e confiáveis ​​a partir de biópsias humanos e modelos experimentais.

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de alfa-sinucleína (α-syn) cada vez mais insolúvel/agregada do tecido cerebral humano post-mortem. Através da utilização de tampões com aumento da força do detergente e técnicas de ultracentrifugação de alta velocidade, as propriedades variáveis da agregação de α-syn em tecidos doentes e não doentes podem ser examinadas.

Extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de Brains parkinsonianos

Apresentamos um protocolo para identificar porções proteicas contendo antígenos para anticorpos IgM humanos e de camundongos com cadeias leves kappa (Vκ) específicas. Este protocolo não se limita aos anticorpos da classe IgM, mas se aplica a todos os isotipos de imunoglobulinas que visam seu antígeno com afinidade suficientemente alta durante as imunoprecipitações.

A ligação do anticorpo especificidade para Kappa (VK) Humanos (IgM) Anticorpos contendo Cadeia Luz: Acid polissiálico (PSA) Anexado a MACN como um estudo de caso

Um método para estabilizar e separando complexos de proteína nativa a partir de lisado de tecido não modificado utilizando uma proteína de reticulação reactivo com amina ligado a uma electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional novo sistema (PAGE) é apresentada.

Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos

Aqui, os autores apresentam um protocolo simples e eficiente para definir um epítopo antigênico linear usando um anticorpo monoclonal purificado e varredura peptídica por meio de hibridização dot-blot. O epítopo identificado pode então ser usado em aplicações terapêuticas e diagnósticas.

Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

Um protocolo de fracionamento abreviado para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte é descrito.

Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

Este protocolo descreve como preparar oligómeros Aβ de um peptídeo sintético em vitro e para avaliar a quantidade relativa de oligómero Aβ por um ponto de análise a mancha.

A11-positivo β-amiloide Oligomer preparação e avaliação utilizando Dot mancha análise

Este trabalho descreve a síntese e caracterização de um Homo-PROTAC bifuncional, com base em pomalidomida, como uma nova abordagem para induzir a ubiquitinação e a degradação do E3 ubiquitina ligase Cereblon (CRBN), alvo de análogos da talidomida.

Inativação química da E3 ubiquitina ligase Cereblon por Homo-PROTACs à base de Pomalidomida

As interações proteína-proteína são importantes para elucidar a função das proteínas-alvo, e a co-imunoprecipitação (co-IP) pode facilmente confirmar os IBPs. Transfectamos transitoriamente um plasmídeo que codifica uma proteína marcada com epítopo em células HEK-293 e desenvolvemos um método de imunoprecipitação para confirmar facilmente a ligação de duas proteínas-alvo.

Imunoprecipitação com um gel de afinidade anti-epítopo para estudar interações proteína-proteína

Aqui, descrevemos um sistema de levedura reconstituindo a γ-secretase humana. Este sistema permite a identificação e o estudo de mutações que afetam a atividade e a triagem de inibidores da γ-secretase (GSIs). Utilizando as propriedades de perda de função dos mutantes familiares da doença de Alzheimer, é possível rastrear moduladores de γ-secretase (GSMs).

Saccharomyces cerevisiae Modelos da doença de Alzheimer para rastrear genes, mutações e produtos químicos que afetam a produção de beta-amilóide pela γ-secretase

Aprenda a detectar multímeros de peptídeos Aβ em tecido cortical humano usando SDS-PAGE e imunoblot com recuperação de epítopo. Este método permite estudar mecanismos da doença de Alzheimer.

SDS-PAGE/Immunoblot Detecção de multímeros Aâ no tecido cortical Humanos homogeneizados utilizando antígeno Epitope-Retrieval

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