Name: MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Aprenda o método de camada ultra fina para preparação de amostras em MALDI-MS, essencial para determinação precisa da massa de proteínas. Este protocolo demonstra técnicas de limpeza e aplicação da matriz.

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É muito importante usar luvas sem pó durante a preparação da camada fina. Limpeza da placa de amostra <ol><li> Use um aço inoxidável ou ouro placa amostra MALDI. </li><li> Lavar com MeOH e limpe delicadamente com um Kimwipe. Não esfregue ou esfregar a superfície com o Kimwipe, para evitar arranhar a superfície. </li><li> Lavar com H 2 O e limpe delicadamente com um Kimwipe. </li><li> Lavar com MeOH e limpe delicadamente com um Kimwipe. </li><li> Se necessário, repita MeOH / H 2 O ciclo de limpeza / MeOH, sempre terminando com MeOH. </li><li> Certifique-se que não há manchas fantasma ou resíduo restante no prato. Se houver manchas fantasma, lavar a placa com água deionizada, enquanto esfregando a superfície com a mão enluvada (Não esfregue com Kimwipes). Repita o MeOH / H 2 O ciclo de limpeza / MeOH. </li><li> Use a placa imediatamente após a lavagem. </li></ol> Preparação da solução fina camada de substrato <ol><li> Misture 1 parte de saturada 4 HCCA (2 partes ACN, 1 parte de água, e 0,1% TFA final) e 3 partes de isopropanol. Nota: A solução de substrato em camada fina é muito estável, e pode ser mantido em temperatura ambiente no escuro durante um ano. Também pode ser armazenado a 4 ° C. </li></ol> Fazendo a fina camada de substrato <ol><li> Aplicar 20 50μL da solução de camada fina de substrato sobre o centro-esquerda do prato, e espalhar com o lado de uma ponta da pipeta. Varredura em uma direção. </li><li> Como a seca solução, a evaporação do solvente orgânico muito rapidamente, deixando para trás gotas minúsculas de água na superfície da placa. Neste ponto, enrole seu dedo indicador com uma camada de Kimwipe e inicialmente suavemente blot a superfície da placa com ele. </li><li> Quando a superfície está livre de pingos de água, limpe toda a placa com uni-direcional movimentos arrebatadores usando um Kimwipe. Nota: Se a solução não se espalhe o suficiente ao longo da superfície da placa, o aumento da composição ACN e recriar a camada fina. Alguns parâmetros que podem afetar a propagação da solução incluem umidade do ambiente e da temperatura. Nota: Com placas de ouro, a camada geralmente aparece como um reflexo amarelado, dependendo da visão e ângulos de luz. Com chapas de aço, apenas a borda da camada é normalmente visível. </li><li> Limpe as bordas do prato com um Kimwipe fresco antes de o colocar no suporte da placa para evitar a contaminação da matriz de instrumento. </li></ol> Preparação da solução da matriz <ol><li> <a href="http://prowl.rockefeller.edu/protocols/saturated-4HCCA-solution.html">Saturado de 4 HCCA</a> em FWI (3 partes de ácido fórmico, 1 parte de água, 2 partes de isopropanol) é recomendada para análise de ambas as membranas e proteínas solúveis. Também pode ser usado em casos especiais para a análise de muito hidrofóbicas grandes peptídeos (M&gt; 4.000 u). Certifique-se que a solução matriz utilizada para detectar as proteínas não exceda ~ 50% de conteúdo orgânico, uma vez que irá dissolver completamente o substrato camada fina, derrotando as vantagens do método. </li></ol> Teste do substrato camada fina <ol><li> 0.5μL local da solução matriz na placa. Um precipitado esbranquiçado aparecerá na interface entre a camada fina ea gota. Quando esta camada cobre o fundo da gota inteiramente, geralmente dentro de 10-15 segundos, aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo. Se demorar mais de 30 segundos para o precipitado para formar, é uma indicação de que pode haver um problema com o substrato em camada fina e / ou a solução matriz. </li></ol> Aplicação de exemplo <ol><li> A concentração do analito nas soluções de partida deve ser no prazo de 10 e 1000μM. </li><li> Diluir a solução do analito em solução de matriz para uma concentração de analito final entre 0,2 e 2μM. Por exemplo, comece com 1μl de amostra e 9μl de solução matriz. Nota: Certifique-se que a matriz está perto de ser saturada na solução final, caso contrário você vai dissolver o substrato em camada fina. Nota: As concentrações do analito necessária para obter sinais decente são altamente dependentes da complexidade da solução e composição (por exemplo, contaminantes) e ionizability analito. Nota: Se uma única etapa de diluição não produz bons resultados, você deve tentar mais um passo de diluição. Embora contra-intuitiva, as soluções de analito altamente concentrada raramente produzem espectros bom. Nota: as proteínas da membrana geralmente requerem diluições maiores. </li><li> 0.5μl ponto de amostra / matriz mistura no prato. Um precipitado esbranquiçado formarão na interface entre a camada fina ea gota. Este precipitado é o cocrystallization da matriz e do analito. Quando esta camada cobre o fundo da gota inteiramente, usualiado dentro de 10-15 segundos, aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo. Se demorar mais de 30 segundos para o precipitado para formar, pode ser uma indicação de um contaminante presente, o que impede a cristalização, ou o seu analito é muito concentrado. </li></ol> Aplicação de calibração <ol><li> Prepare a mistura de calibração / matriz de uma forma semelhante, com uma concentração final de calibração entre 0,1-0.5μM. </li><li> Local 0.5μl mistura de calibração / matriz sobre a placa em estreita proximidade com os pontos da amostra. Esta proximidade física é usado em um procedimento de calibração pseudo-internas no qual a placa é movido a partir do ponto de amostra para o ponto de calibração durante a aquisição da amostra, para adicionar um disparos de laser alguns dos calibradores para o espectro. Esta abordagem garante uma calibragem maior precisão do que massa de calibração externo. </li></ol> Lavar passo <ol><li> Lave cada local, com aproximadamente 2μL de uma solução de TFA 0,1% gelada aquosa. Aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo. </li></ol> Aquisição de espectros de massa <ol><li> Agora você está pronto para adquirir espectros de massa. Se você usar a solução matriz FWI, você deve adquirir o seu espectro o mais rapidamente possível para impedir a modificação irreversível ao analito, tais como formylation. </li></ol>

<ol><li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+Increase+Contaminant+Tolerance+in+Protein+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+by+the+Fabrication+of+Thin+Protein-Doped+Polycrystalline+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li>
<li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust%2C+Detergent-Friendly+Method+for+Mass+Spectrometric+Analysis+of+Integral+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins.</a> Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li>
<li>Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).</li>
</ol>

É fundamental que todos os reagentes são de alta qualidade (por exemplo, HPLC). Luvas sem pó (látex ou nitrilo) Aço inoxidável ou ouro placa amostra MALDI Metanol (MeOH) Água Kimwipes alfa-ciano-4-hidroxicinâmicos ácido (4-HCCA) Trifluoroacético ácido (TFA) (concentração final em 0,1% em H 2 O) Acetonitrila (ACN) Ácido fórmico Isopropanol

maldi preparação da amostra: o método de camada ultra thin

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS) 1, 2. O método de camada ultra-fina envolve a produção de uma camada de substrato de cristais de matriz (alfa-ciano-4-hidroxicinâmicos ácido) na placa de amostra, que serve como um campo de semeadura para a cristalização de uma mistura subseqüentes matriz / analito. Vantagens do método de camada ultra-fina sobre abordagens outra amostra de deposição (gotículas secas, por exemplo) são de que ele fornece (i) maior tolerância às impurezas tais como sais e detergentes, (ii) uma melhor resolução, e (iii) maior uniformidade espacial. Este método é especialmente útil para a determinação da massa exata de proteínas. O protocolo foi inicialmente desenvolvido e otimizado para a análise das proteínas da membrana e utilizado com sucesso para analisar os canais de íons, transportadores metabólito, e receptores, contendo entre 2 e 12 domínios transmembrana 2. Desde a publicação original, também tem mostrado ser igualmente útil para a análise de proteínas solúveis. Na verdade, nós tê-lo usado para um grande número de proteínas tendo uma vasta gama de propriedades, incluindo aqueles com massas moleculares tão alto quanto 380 kDa 3. Hoje é o nosso método de escolha para a análise de massa molecular de todas as proteínas. O procedimento descrito produz consistentemente de alta qualidade espectros, e é sensível, robusto e fácil de implementar.

Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

Este vídeo demonstra a preparação de uma camada ultrafina de matriz/analito para a análise de peptídeos e proteínas por Dessorção a Laser Assistida por Matriz...

Bem-vindo ao tutorial do laboratório CHI sobre o método da camada ultrafina, que é particularmente útil para a determinação precisa da massa de proteínas. Devido à natureza sensível da espectrometria de massas, utilizamos apenas reagentes de grau HPLC, bem como luvas de látex ou nitrílica sem pó para limpar a placa. Enxágue alternadamente com metanol e água, e finalmente novamente com metanol.Entre cada enxágue, remova suavemente o solvente em excesso usando papel para lentes. Você pode repetir essas etapas de lavagem quantas vezes forem necessárias para obter uma placa limpa. Após limpa e seca, a placa deve ser usada imediatamente.Aplique e espalhe de 20 a 30 microlitros de solução de substrato em camada fina sobre a placa MALDI limpa. Aqui, utilizamos uma ponteira P dois 50 para espalhar uniformemente a solução, evitando riscar a placa. Conforme a camada fina seca, remova quaisquer gotículas de água remanescentes, se presentes, pressionando suavemente com um lenço de papel kim.Em seguida, passe suavemente a placa com um movimento contínuo usando um lenço de papel Kim para formar adequadamente a camada fina. Por fim, limpe as bordas da placa para evitar contaminar o espectrômetro de massas. É fundamental testar a camada fina antes de aplicar sua amostra.Se a mancha-teste demorar muito para secar, onde os cristais não são homogêneos, o problema pode estar na própria camada delgada ou na solução da matriz; limpe a placa, reaplique a camada delgada e refaça o teste. Ao aplicar as amostras na camada delgada, você não deve deixar que as manchas sequem completamente. Em vez disso, assim que a cristalização desacelerar e parar, remova o excesso de solvente.Usando um aspirador a vácuo, a presença de contaminantes como sais e detergentes, bem como alta concentração do analito, pode interferir na cristalização. Uma diluição adicional da amostra pode melhorar a cristalização. Localize as Ants em proximidade próxima à amostra. Isso permitirá uma calibração pseudo-interna, na qual a placa é movida do ponto da amostra para o ponto de calibração.Durante a aquisição da amostra, adicionar alguns disparos a laser do CAS ao espectro; essa abordagem garante uma calibração com maior precisão de massa do que a calibração externa isoladamente. É muito importante remover quaisquer contaminantes, como sal ou detergente, que possam interferir na ionização do analito. Para tanto, adicione gotas de ácido trifluoroacético a 0,1% em água grau HPLC, previamente resfriada em gelo, diretamente sobre os pontos.Remova a solução de lavagem utilizando um aspirador a vácuo conforme mostrado aqui. Este método produz espectros excelentes tanto para proteínas de membrana quanto solúveis.

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Biologia

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Aprenda o método de camada ultra fina para preparação de amostras em MALDI-MS, essencial para determinação precisa da massa de proteínas. Este protocolo demonstra técnicas de limpeza e aplicação da matriz.

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