Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome
15 de junho de 2010
Este artigo descreve um protocolo para a extração de traduzir os ribossomos das células eucarióticas. Uma vez extraído, ribossomos são separados em monosomes e polirribossomos por fracionamento gradiente de sacarose para permitir diferentes populações ribossomal a ser analisado. Como tal, este método é o padrão ouro para examinar a regulamentação da tradução.
O objetivo geral deste procedimento é separar e comparar as frações monozona e poli-ribossomo dos lisados celulares. Isso é feito primeiro cultivando as células de interesse. A segunda etapa do procedimento é preparar o lisado celular.
A terceira etapa do procedimento é centrifugar o lisado através de um gradiente de sacarose. A etapa final do procedimento é fracionar o gradiente e visualizar as diferentes populações ribossômicas por meio de um traço UV. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram mudanças na tradução sob diferentes condições experimentais por meio da análise do perfil de polirribossomos.
Olá, sou Anthony Esposito, do laboratório do Dr. Terry Goss Kinsey no departamento de Genética Molecular, microbiologia e imunologia da UMD e da J Robert Wood Johnson Medical School. E eu sou Marcus Lewis. Também do McKinsey Lab aqui na R-W-J-M-S.
Hoje vamos mostrar um procedimento para análise de polirribossomos. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar alterações e síntese de proteínas que surgem de mutações ou fatores ambientais. Então vamos começar. Sacarose.
Os gradientes devem ser preparados um dia antes do uso para permitir que os gradientes se tornem contínuos. Misture os volumes apropriados de soluções estoque de sacarose 7% e 47% para fazer 48 mililitros de cada uma das seguintes concentrações de sacarose, 7% 17% 27% 37% e 47% Adicione um molar DTT a cada solução de sacarose até uma concentração final de um milimolar. Para despejar os gradientes, conecte uma pipeta de macarrão a uma seringa de 20 mililitros, prendendo e selando com filme para.
Adicione sete mililitros de 7% de sacarose ao fundo de um tubo de centrífuga ultra aamer poli de uma polegada por 3,5 polegadas. Em seguida, adicione sete mililitros de solução de sacarose a 17% sob a solução a 7%, colocando lentamente a ponta da pipeta de macarrão perto do fundo da pipeta de tubo. Deve levar pelo menos 20 segundos para despejar cada camada.
Repita com sete mililitros cada uma das soluções de sacarose a 27%, 37% e 47% quando o gradiente estiver furado. Você deve observar linhas claras entre as camadas, indicando que ocorreu uma mistura mínima. Armazene todos os gradientes de quatro graus Celsius durante a noite, juntamente com os rotores, garrafas e tubos que serão usados para coletar amostras.
Para preparar extratos de células de levedura, comece cultivando cem 25 mililitros de cultura de levedura para um OD 600 de 0,8 para um. Adicionar a ciclourea à cultura até uma concentração final de 100 microgramas por mililitro e continuar agitando a 30 graus Celsius por 15 minutos. Após 15 minutos, despeje a cultura em uma garrafa de centrífuga de 250 mililitros e encha com gelo.
Mantenha tudo no gelo a partir deste ponto centrifugue a 8.000 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius. Resus, suspenda o pellet em 10 mililitros de gelo, lise fria, tampão e transfira para tubos de polipropileno de 15 mililitros. Centrifugue a 5.900 vezes a gravidade por três minutos de quatro graus Celsius Resus.
Suspenda o pellet em 0,5 mililitros de tampão de lise. Transfira a suspensão para um tubo de micro fuge de 1,5 mililitro e, em seguida, adicione 0,5 mililitros de esferas de vidro lavadas com ácido cozido resfriado. Vortex as células por quatro intervalos de 32, chamando o tubo no gelo por 30 segundos entre cada intervalo.
Em seguida, adicione mais 0,5 mililitros de tampão de lise na centrífuga de tubo de 1,5 mililitro a 5.000 vezes. Gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue na velocidade máxima por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Por fim, transfira o supinato para um novo tubo micro centri de 1,5 mililitro. O extrato pode ser armazenado a 80 graus Celsius negativos para transferir o lisado para o gradiente de sacarose. Coloque a ponta da pipeta contra a parede do tubo perto da superfície do gradiente e coloque suavemente o lisado sobre o gradiente.
Para um gradiente de 35 mililitros, 500 microlitros de lisado são normalmente carregados. Usando uma pinça, abaixe cuidadosamente o gradiente na caçamba de um rotor de caçamba oscilante. Centrifugue os gradientes a 100.000 vezes a gravidade por quatro horas a quatro graus Celsius.
Aproximadamente 30 minutos antes da conclusão da centrifugação de quatro horas. Encaixe a agulha no perfurador de tubos e fixe a caneta no monitor de fluorescência de absorbância online. Ligue a alimentação do monitor de absorbância para permitir que uma linha de base estável seja alcançada antes de analisar as amostras.
A aquisição eletrônica do perfil PolyZone pode ser facilmente obtida em tempo real conectando uma unidade de aquisição de dados DI 1 48 U. Para o registrador gráfico, encha a bomba da seringa com 50 mililitros de nozes florin usando a configuração rápida de fluxo reverso. Certifique-se de que não haja bolhas de ar presentes.
Conecte a mangueira da seringa ao perfurador de tubo. E ligue brevemente o fluxo de Flo inerte a seis mililitros por minuto na direção para frente. Para limpar a mangueira de quaisquer bolhas de ar, coloque uma série de tubos sob a mangueira no final da célula de fluxo para coletar o escoamento da amostra.
Prepare um balde de gelo com um poço pré-formado para segurar o tubo da centrífuga contendo o gradiente de sacarose. Quando a centrifugação de quatro horas estiver concluída, remova cuidadosamente os tubos da centrífuga do rotor da centrífuga e coloque-os no gelo. Tomando cuidado para não perturbar os gradientes.
Para analisar extratos celulares, coloque o tubo gradiente no perfurador de tubos e conecte a parte superior do tubo à saída e prenda. Levante o estágio inferior para o tubo da centrífuga de modo que a agulha perfure o fundo do tubo. Inicie o fluxo de alerta Florin na direção para frente a seis mililitros por minuto.
Assim que a flauta começar a fluir para o tubo, monitore o movimento da agulha no monitor de absorbância UV online. Assim que a agulha começar a se mover, ative o movimento do gráfico para uma configuração de velocidade de 60. Quando o final do perfil de polirribossomo for atingido, desligue o fluxo de Flo inerte para o tubo da centrífuga e interrompa o movimento do gráfico no monitor de fluorescência de absorbância.
Retraia o Flo inerte do tubo de centrífuga para a seringa, iniciando o fluxo na direção inversa em um ritmo rápido, certificando-se de não puxar sacarose do tubo para a seringa. Desaparafuse o tubo de centrífuga do perfurador de tubos, abaixe a agulha e remova o tubo. Um traço representativo de um extrato de ribossomo preparado a partir de levedura na presença de cicloheide é mostrado aqui.
Estão indicados picos de absorvância de UV contendo polirribossomas e ribossomas A TS 60 s e 40 s. Acabamos de mostrar como realizar a análise de polirribossomos ao fazer este procedimento. É importante lembrar de trabalhar rapidamente, mantendo as amostras frias e os RNAs livres.
Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte em seus experimentos.
Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para extrair ribossomos em tradução de células eucarióticas, permitindo a análise de diferentes populações ribossomais. O método envolve a separação de ribossomos em monossomos e polirribossomos por meio da fracionamento em gradiente de sacarose, essencial para o estudo da regulação da tradução.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Genética
Antecedentes
- Compreender a função do ribossomo é essencial para estudar a síntese de proteínas.
- O perfilhamento de polirribossomos fornece informações sobre a regulação da tradução.
- As técnicas de extração de ribossomos são fundamentais na pesquisa em biologia molecular.
- Fatores ambientais e mutações podem alterar a síntese de proteínas.
Objetivo do Estudo
- Separar e comparar frações de monorribossomos e politribossomos de lisados celulares.
- Visualizar diferentes populações ribossomais por meio de rastreamento com UV.
- Analisar alterações na tradução sob diversas condições experimentais.
Métodos Utilizados
- Cultivo de células eucarióticas e preparação de lisados celulares.
- Centrifugação através de um gradiente de sacarose.
- Fractionamento do gradiente para isolar populações ribossomais.
- Visualização de perfis ribossomais utilizando monitoramento da absorção de UV.
Resultados Principais
- Separação bem-sucedida de monossomos e politribossomos.
- Visualização clara das populações ribossomais por meio de rastreamento com UV.
- Análise da regulação da tradução sob diferentes condições.
- Informações sobre o impacto de mutações na síntese proteica.
Conclusões
- O protocolo é um padrão ouro para o estudo da regulação da tradução.
- Ele permite aos pesquisadores analisar de forma eficaz a dinâmica ribossomal.
- Os achados contribuem para a compreensão dos mecanismos moleculares da tradução.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise de perfil de polirribossomos permite que equipes de biofármacos investiguem mecanismos de controle da tradução e detectem defeitos na síntese proteica em pontos críticos de descoberta. Este método fornece informações quantitativas sobre a tradução global e específica por transcrito, apoiando a confiança preditiva na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas. Sua adaptabilidade a diversos sistemas eucarióticos garante relevância ampla para portfólios de pesquisa básica e translacional em estágios iniciais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a avaliação direta da regulação traducional sob perturbações genéticas ou ambientais.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao distinguir defeitos na iniciação versus alongamento/terminação.
- Facilita a validação funcional de alvos ao quantificar alterações nas razões polirribossomo-mônossomo.
- Oferece uma plataforma para avaliar o impacto de intervenções candidatas na síntese proteica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece leituras quantitativas validadas do engajamento ribossomal para padronização de ensaios.
- Permite a fracionamento reprodutível e detecção baseada em UV de populações ribossomais.
- Prepara extratos biológicos adequados para fluxos de trabalho de análise de mRNA ou proteínas em etapas subsequentes.
- Permite a triagem de compostos que modulam a maquinaria de tradução ou vias regulatórias.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a descoberta de biomarcadores tradutivos com insights mecanicistas sobre a regulação da síntese proteica.
- Garante a continuidade de modelos celulares a sistemas pré-clínicos, adaptando protocolos entre espécies eucarióticas.
- Informa decisões de avanço com ajuste de risco ao revelar defeitos tradutivos associados a modelos de doenças.
- Fornece contexto mecanicista para fenótipos observados em estudos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O perfilamento de polirribossomos integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a investigação orientada por hipóteses da tradução, apoiando tanto a validação de alvos quanto a identificação de compostos promissores.
- Biologia da Descoberta: Quantifica a produção traducional e esclarece mecanismos regulatórios específicos de vias.
- Triagem: Oferece fracionamento robusto e quantitativo e saídas de absorbância UV prontas para ensaios.
- Análises: Fornece medição quantitativa em tempo real de populações ribossomais para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta modelos celulares e pré-clínicos ao permitir adaptação de protocolos e alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável para diversos estudos translacionais e mecanicistas em diferentes programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em estudos de controle traducional.
- Valor Operacional: Padroniza os fluxos de trabalho de extração, fracionamento e detecção para garantir reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção ao revelar gargalos traducionais e apoiar a triagem eficiente de portfólios em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e modelos com base na fidelidade traducional.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em biologia de ribossomos e técnicas de fracionamento em gradiente.
- Exige acesso a ultracentrifugação e instrumentação de absorbância UV.
- Necessita padronização rigorosa entre equipes para resultados reprodutíveis.
- Adaptável a sistemas de levedura e mamíferos com modificações no protocolo conforme necessário.
- A integridade da amostra e condições livres de RNase são essenciais para resultados confiáveis.
