Name: Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprenda a separar monossomos e polirribossomos de lisados celulares eucarióticos usando gradiente de sacarose e traçado UV. Este método permite analisar regulação da tradução e dinâmica ribossomal em diferentes condições experimentais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores gostariam de agradecer a John Woolford para a base inicial deste método, TGK é suportado pelo NIH e GM057483 AI076245 e RPC é apoiada por GM77073.

1. Preparação de gradientes de sacarose 7-47% <ol><li> Prepare gradientes de sacarose um dia antes do uso para permitir gradientes para tornar-se contínuo. Tornar estéril 7% e soluções de sacarose 47% contendo 50 mM NH 4 Cl, 50 mM Tris pH 7,0 Acetato e MgCl 2 12mm e armazenar a 4 ° C 1. </li><li> Por 6 gradientes misturar os 7% e as soluções estoque 47% de sacarose para fazer 48 mL de cada uma das seguintes concentrações de sacarose. Adicionar TDT (1M estoque) para cada solução de sacarose a uma concentração final de 1mM. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Concentração Final </td><td> Sacarose 7% </td><td> 47% de sacarose </td></tr><tr><td> 7% </td><td> 48 mL </td><td> 0 </td></tr><tr><td> 17% </td><td> 36 mL </td><td> 12 mL </td></tr><tr><td> 27% </td><td> 24 mL </td><td> 24 mL </td></tr><tr><td> 37% </td><td> 12 mL </td><td> 36 mL </td></tr><tr><td> 47% </td><td> 0 </td><td> 48 mL </td></tr></tbody></table></li><li> , A fim de derramar os gradientes, anexar uma pipeta Pasteur a uma seringa de 20 mL de segurança e vedação com Parafilm ou usar uma agulha longa. Adicionar 7 ml de sacarose 7% para o fundo de um tubo de 1 x 3,5 ultracentrífuga "polyallomer. Em seguida adicione 7 mL da solução de sacarose 17% sob a solução de 7%, colocando a ponta da pipeta Pasteur perto fundo do tubo e pipetar não mais do que 0,3 mL / sec Repetir. com 7 mL cada de 27%, 37% e soluções de sacarose 47%. Você deve observar linhas claras entre as camadas, indicando que a mistura mínima ocorreu. loja gradientes a 4 ° C durante a noite junto com os rotores, garrafas e tubos que serão utilizados na colheita de amostras. </li></ol> 2. Preparação do extrato de levedura <ol><li> Crescer 125 mL de cultura de levedura para um OD 600 de 0,8-1,0. Adicionar cicloheximida para a cultura a uma concentração final de 100 mcg / mL e continuar apertando a 30 ° C por 15 min. </li><li> Enquanto isso, prepare tampão de lise contendo 80 mcg / mL cicloheximida, 200 heparina mcg / mL, DEPC 0,2%, e 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 30mm MgCl 2. Mantenha tudo no gelo a partir deste ponto. </li><li> Despeje a cultura em um frasco de centrífuga de 250 mL e encha com gelo. Centrifugar a 8000 xg (7.250 rpm em um rotor SLA-1500) por 5 min a 4 ° C. Lave o pellet uma vez com 10 mL de tampão de lise de gelo frio e transferência para tubos de 15 mL de polipropileno. Centrifugar a 5900 xg (~ 6.000 rpm em um rotor SLA-600TC) por 3 min a 4 ° C. Ressuspender o sedimento em 0,5 mL de transferência de tampão de lise, para tubo de 1,5 ml e adicionar 0,5 mL de refrigerados, cozido contas ácido lavado vidro. Vortex as células para quatro intervalos de 30 segundos, resfriando o tubo em gelo durante 30 segundos entre cada intervalo. Adicionar uma outra de 0,5 mL de tampão de lise no tubo de 1,5 mL. Centrifugar a velocidade máxima em microcentrífuga (14.000 rpm em uma microcentrífuga Eppendorf 5417R) por 10 min a 4 ° C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Retire 10 ml para um tubo separado para determinar a OD 260 / OD 280 ratio (veja o passo 3.1). Extratos armazenar a -80 ° C. </li></ol> 3. Preparação de extratos de células de mamíferos <ol><li> Para células aderentes, crescer em 100 prato mm a confluência ~ 70%. Você vai precisar de um prato de 100 mm por 11 gradiente ml (rendimento típico é ~ 20 OD 260 unidades). Escala a quantidade linearmente para tamanhos gradiente maior ou menor. Para as células não aderentes, cerca de 1 x 10 7 células são necessárias por 11 ml de gradiente. </li><li> Antes de lise, adicione cicloheximida a 100 mcg / mL. Incubar a 37 ° C por 15 min. Transferência de placas de gelo e lave as células duas vezes em PBS gelado. Todos os passos futuros deve ser realizado em 0-4 ° C. </li><li> Remover todos os vestígios de PBS por aspiração (vamos placas de drenagem em uma cama em ângulo de gelo) e adicionar 1 mL tampão de lise, raspar e transferência para pré-refrigerados tubo de 1,5 mL. Componentes do tampão de lise terá de ser otimizado para o tipo de célula e as condições de crescimento. Um buffer bom começo seria de 20 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 15 mM MgCl 2, 200 mM KCl, 1% Triton X-100 (v / v), 100 mcg / mL cicloheximida, 2 mM DTT e 1 mg / heparina mL. As variáveis-chave são as concentrações de magnésio e cloreto de potássio, bem como a inclusão ou exclusão de detergentes não-iônicos para melhorar a extração do citoesqueleto ou membrana polissomos ligados. Lisar células, passando por 27 gauge agulha da seringa ou duas vezes por golpes de homogeneização 10/05 Dounce usando Tipo B pilão. A seringa ou homogeneizador deve ser pré-refrigerado antes de usar. </li><li> Giram a 14.000 xg por 5 min em microcentrífuga refrigerada. Transferência lisado fresco para o gradiente de sacarose (para células de mamíferos esta é feita em tampão de lise falta Triton X-100 e heparina, mas de outra forma, como descrito em 1.2 e 1.3) ou congelar flash em nitrogênio líquido para uso posterior. </li></ol> 4. Centrifugação de gradientes <ol><li> Descongelar lisados ​​polyribosome no gelo. Determinar a concentração de ácido nucléico na lisado, adicionando a amostra de 10 mL reservados a 1 mL de água e leitura do OD 260 / 280 OD relação com um espectrofotômetro. Rendimento típico de uma cultura de leveduras cultivadas como descrito é de 50 unidades de OD. </li><li> Com uma pipeta com a ponta colocado contra a parede do tubo perto da superfície do gradiente, gentilmente camada de 25 OD 260 unidades do lisado no topo do gradiente. Para um gradiente de 35 mL 500 mL de lisado é normalmente carregado. Lise pode ser usado para garantir a todos os gradientes são carregados com um volume igual. Menor quantidade de material resultam em melhor resolução. Utilizando uma pinça, cuidadosamente inferior os gradientes em baldes de um rotor de caçamba móvel. </li><li> Centrifugar os gradientes de 100.000 xg (23.000 rpm em um 630 Surespin rotor) por 4 horas a 4 ° C. Este protocolo pode ser adaptado para gradientes de menor volume. </li></ol> 5. Recolha de dados e frações <ol><li> Cerca de 30 min antes da conclusão do spin hr 4 anexar a agulha para a piercer tubo Modelo 184. Anexar a caneta para o modelo on-line Isco UA-5 Absorbância / Monitor de fluorescência. Poder sobre a absorbância monitor para permitir uma linha de base estável para ser alcançado antes de amostras. Aquisição eletrônica do perfil polysome pode ser facilmente obtido anexando um DI-148U unidade de aquisição de dados (DATAQ Instruments) para o registrador gráfico. Os perfis podem ser coletados em tempo real e guardado para mais tarde anotação usando o software que acompanha WinDaq. </li><li> Encha a bomba de seringa com 50 ml de Fluorinert usando o fluxo reverso, a definição rápida. Certifique-se que não há bolhas de ar. Ligue a mangueira da seringa para o piercer tubo e brevemente ligar o fluxo de Fluorinert a 3 mL / min para a frente para limpar a mangueira de bolhas de ar. </li><li> Coloque um copo de resíduos ou de uma série de tubos de coleta de frações se sob a mangueira no final da célula de fluxo para coletar amostra de fugir. </li><li> Remova cuidadosamente os tubos polyallomer centrífuga contendo o gradiente de sacarose de rotor de centrífuga e colocá-los no gelo (pré-forma os poços no gelo com um tubo vazio para evitar gradientes de perturbação). </li><li> Para analisar extratos de células, coloque o tubo de gradiente na piercer tubo. Conecte o topo do tubo à saída e seguro. Elevar o estágio inferior para o tubo de centrifugação, para que a agulha perfura o fundo do tubo. Uma vez que a agulha se projetava através do fundo do tubo de centrifugação, comece o fluxo de Fluorinert na direção para frente na 6mL/min. </li><li> Uma vez que o Fluorinert começou fluir para dentro do tubo, monitorar o movimento da agulha no monitor absorbância online. Uma vez que a agulha começa a se mover, girar sobre o movimento gráfico para um ajuste de velocidade de 60. O monitor irá gravar o OD 254 começando com o material livre seguido por subunidade ribossômica 40S detecção e continuando até aos complexos polyribosome. Se você está coletando frações de RNA ou análise de proteínas, tipicamente 0,2 min frações são tomadas (1 mL). Para a análise de RNA, as frações devem ser coletadas diretamente em tubos contendo Trizol (Invitrogen), fenol ou SDS / proteinase K, dependendo do método preferido de extração. </li><li> Quando o fim do perfil polyribosome foi alcançado, desligue o fluxo de Fluorinert para o tubo de centrifugação e parar o movimento gráfico da absorbância / monitor de fluorescência. </li><li> Retrair o Fluorinert do tubo de centrifugação para a seringa, começando o fluxo no sentido inverso a uma taxa rápida tomando cuidado para não chamar a sacarose do tubo para dentro da seringa. Tubo de desapertar a centrífuga do piercer tubo, menor a agulha, e retire o tubo. </li><li> Repita os passos 5,5 por 5,8 para cada gradiente de sacarose. </li><li> Quando todos os gradientes de sacarose foram analisados, recolher o Fluorinert da mangueira para dentro da seringa. Retire cada parte do fraccionamento (piercer tubo e célula de fluxo), incluindo a mangueira de resíduos localizados na parte superior e enxaguar bem com água. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1948/1948fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Trace Representante do extrato ribossomo preparados a partir de cepa de levedura BY4741 (mat um his3 Δ Δ 0 1 leu2 met15 Δ 0 Δ ura3 0) na presença de cicloheximida. O extrato foi fracionado ribossomal utilizando um gradiente de sacarose 7 47% e analisados ​​utilizando um aparelho de bomba de seringa conectada a um detector UV. Picos contendo polirribossomos e 80S, 60S e 40S ribossomos são indicados.

<ol><li>Baim, S. B., Pietras, D. F., Eustice, D. C., Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutation+allowing+an+mRNA+secondary+structure+diminishes+translation+of+Saccharomyces+cerevisiae+iso-1-cytochrome+C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mutation allowing an mRNA secondary structure diminishes translation of Saccharomyces cerevisiae iso-1-cytochrome C.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 1839-1846 (1985).</li>
<li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRS1+to+DRS7%2C+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Biol. 13, 7901-7912 (1993).</li>
<li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+%28eEF%29+1A+and+eEF3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> J Biol Chem. 278, 6985-6991 (2003).</li>
<li>Serikawa, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Proteomics. 2, 191-204 (2003).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li>
<li>Valasek, L., Szamecz, B., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+stabilization+of+preinitiation+complexes+by+formaldehyde+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">In vivo stabilization of preinitiation complexes by formaldehyde cross-linking.</a> Methods Enzymol. 429, 163-183 (2007).</li>
<li>Fletcher, J. E., Copeland, P. R., Driscoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+distribution+of+phospholipid+hydroperoxide+glutathione+peroxidase+mRNA%3A+evidence+for+a+block+in+elongation+at+the+UGA%2Fselenocysteine+codon%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">Polysome distribution of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase mRNA: evidence for a block in elongation at the UGA/selenocysteine codon.</a> Rna. 6, 1573-1584 (2000).</li>
<li>Ruan, H. J., Brown, C. Y., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuan%2C+HJ+%22Analysis+of+mRNA+formation+and+function%22">Analysis of mRNA formation and function</a>. Richter, J. D. , Academic Press. 305-321 (1997).</li>
<li>Martin, G. W. 3rd, Berry, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenocysteine+codons+decrease+polysome+association+on+endogenous+selenoprotein+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Selenocysteine codons decrease polysome association on endogenous selenoprotein mRNAs.</a> Genes Cells. 6, 121-129 (2001).</li>
<li>Lee, Y. Y., Cevallos, R. C., Jan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+upstream+open+reading+frame+regulates+translation+of+GADD34+during+cellular+stresses+that+induce+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An upstream open reading frame regulates translation of GADD34 during cellular stresses that induce eIF2alpha phosphorylation.</a> J Biol Chem. 284, 6661-6673 (2009).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As informações obtidas a partir do perfil polyribosome pode fornecer informações valiosas sobre o estado de translação da célula. Além disso, o status do conjunto de subunidades ribossômicas se pode ser determinado 2. Por exemplo, a presença de halfmers ou 80 e picos maiores, com um ombro ligeira à direita do perfil indica uma subunidade 40S ligado aguardando subunidade 60S aderir. Realizar o experimento, na ausência de qualquer cicloheximida adicionado ou outros inibidores de alongamento permite a análise da taxa de fugir, o que indica se ou não de alongamento é alterado 3. As frações em si são uma rica fonte de reagentes para a determinação posterior da associação de um mRNA específico ou proteína ribossomal com subpopulações borrando Norte ou Oeste do frações. O grupo total de mRNAs associados ribossomos ativo pode ser determinado através de um microarray associados 4 ou análise de seqüenciamento de profundidade 5. As associações de proteína também pode ser estabilizada pela adição adequada de um cruzamento que liga reagente 6. Polyribosome análise de células de mamíferos Vale destacar também como um protocolo distinto em termos de dificuldades aparentes em estabelecer as condições necessárias para obter polissomos estável. Os sistemas tampão relatados na literatura são muito variáveis ​​7-10, assim pode haver uma exigência para a célula tipo específico de otimização do tampão de lise, ou é igualmente plausível que o sistema de buffer não é tão importante quanto a atenção ansiosos para trabalhar com lisados ​​frescos mantidos em baixas temperaturas. Ao nosso conhecimento uma avaliação sistemática dos parâmetros que afetam a formação polysome mamíferos não tem sido relatada.

<table><tbody><tr><td>tubo de ultracentrifugação polyallomer</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>326823</td><td>1 x 3,5 pol. (25x89 mm)</td></tr><tr><td>Fluorinert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9755</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7698</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>BY4741</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1048</td><td>Outras linhagens funcionam igualmente bem</td></tr></tbody></table>

análise de perfil eucarióticas polyribosome

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Síntese de proteínas é um processo complexo celular que é regulado em vários níveis. Por exemplo, a tradução global pode ser inibido na fase de iniciação ou a fase de alongamento por uma variedade de estresses celulares, tais como a fome aminoácido ou a retirada do fator de crescimento. Alternativamente, tradução de mRNAs individuais podem ser regulados por Localização mRNA ou a presença de microRNAs cognato. Estudos de síntese de proteína freqüentemente utilizam análise polyribosome para lançar luz sobre os mecanismos de regulação de tradução ou defeitos na síntese de proteínas. Neste ensaio, mRNA / ribossomo complexos são isolados a partir de células eucarióticas. Um gradiente de densidade de sacarose separa mRNAs obrigado a ribossomos vários conhecidos como polirribossomos de mRNAs vinculado a um único ribossomo ou monosome. Fracionamento dos gradientes permite isolar e quantificar as diferentes populações ribossomal e seus mRNAs associados ou proteínas. Diferenças na proporção de polirribossomos para monosomes sob condições definidas podem ser indicativos de defeitos em qualquer de iniciação de tradução ou alongamento / terminação. Exame dos mRNAs presentes nas frações polyribosome podem revelar se a coorte de mRNAs individuais sendo traduzido muda com condições experimentais. Além disso, a montagem ribossomo pode ser monitorada pela análise das pequenas e grandes picos subunidade ribossômica que também são separados pelo gradiente. Neste vídeo, apresentamos um método para a preparação de extratos bruto ribossomal de células de levedura, a separação do extrato por gradiente de sacarose e interpretação dos resultados. Este procedimento é facilmente adaptável para células de mamíferos.

Este artigo descreve um protocolo para a extração de traduzir os ribossomos das células eucarióticas. Uma vez extraído, ribossomos são separados em monosomes e polirribossomos por fracionamento gradiente de sacarose para permitir diferentes populações ribossomal a ser analisado. Como tal, este método é o padrão ouro para examinar a regulamentação da tradução.

Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome

A síntese proteica é um processo celular complexo que é regulado em múltiplos níveis. Por exemplo, a tradução global pode ser inibida na fase de iniciação...

O objetivo geral deste procedimento é separar e comparar as frações de monozona e polirribossomos provenientes de lisados celulares. Isso é realizado primeiramente cultivando as células de interesse. O segundo passo do procedimento é preparar o lisado celular.O terceiro passo do procedimento é centrifugar o lisado através de um gradiente de sacarose. O passo final do procedimento é fracionar o gradiente e visualizar as diferentes populações ribossomais por meio de um traçado de UV. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram alterações na tradução sob diferentes condições experimentais por meio da análise do perfil de polirribossomos.Olá, sou Anthony Esposito do laboratório da Dra. Terry Goss Kinsey do departamento de Genética Molecular, Microbiologia e Imunologia na UMD e na Escola de Medicina J Robert Wood Johnson. E eu sou Marcus Lewis, também do Laboratório McKinsey aqui na RWJMS.Hoje vamos mostrar um procedimento para análise de polirribossomos. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar alterações na síntese de proteínas que surgem de mutações ou fatores ambientais. Então, vamos começar. Sacarose.Os gradientes devem ser preparados um dia antes do uso para permitir que se tornem contínuos. Misture os volumes apropriados das soluções estoque de sacarose a 7% e 47% para obter 48 mililitros de cada uma das seguintes concentrações de sacarose: 7%, 17%, 27%, 37% e 47%. Adicione DTT 1 M a cada solução de sacarose até uma concentração final de 1 milimolar. Para despejar os gradientes, acople uma pipeta de pasta a uma seringa de 20 mililitros, fixando e selando com filme parafilm.Adicione sete mililitros de sacarose a 7% na parte inferior de um tubo de ultracentrífuga de poliamida de uma polegada por 3,5 polegadas. Em seguida, adicione sete mililitros de solução de sacarose a 17% abaixo da solução a 7%, colocando a ponta da pipeta Pasteur próximo ao fundo do tubo e pipetando lentamente. Deve-se levar não menos de 20 segundos para despejar cada camada.Repita com sete mililitros de soluções de sacarose a 27%, 37% e 47% quando o gradiente tiver sido formado. Você deverá observar linhas nítidas entre as camadas, indicando que ocorreu mistura mínima. Armazene todos os gradientes a quatro graus Celsius durante a noite, juntamente com os rotores, frascos e tubos que serão utilizados para colher as amostras.Para preparar extratos de células de levedura, comece cultivando centenas de 25 mililitros de cultura de levedura até uma OD 600 de 0,8 a 1,0. Adicione ciclo-heximida à cultura até uma concentração final de 100 microgramas por mililitro e continue agitando a 30 graus Celsius por 15 minutos. Após 15 minutos, despeje a cultura em um frasco de centrífuga de 250 mililitros e preencha com gelo.Mantenha tudo em gelo a partir deste ponto; centrifugue a 8.000 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Resuspenda o pellet em 10 mililitros de tampão de lise gelado e transfira para tubos de polipropileno de 15 mililitros. Centrifugue a 5.900 × g durante três minutos a quatro graus Celsius. Resuspenda.Suspenda o pellet em 0,5 mililitros de tampão de lise. Transfira a suspensão para um tubo microfuga de 1,5 mililitro e adicione então 0,5 mililitros de esferas de vidro acidificadas e aquecidas previamente. Vortexe as células por quatro intervalos de 30 segundos, resfriando o tubo em gelo por 30 segundos entre cada intervalo.Em seguida, adicione mais 0,5 mililitros de tampão de lise ao tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 5.000 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e centrifugue na velocidade máxima durante 10 minutos a quatro graus Celsius.Por fim, transfira o sobrenadante para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro. O extrato pode ser armazenado a menos 80 graus Celsius para transferir o lisado para o gradiente de sacarose. Coloque a ponta da pipeta contra a parede do tubo próximo à superfície do gradiente e sobreponha suavemente o lisado sobre o gradiente.Para um gradiente de 35 mililitros, geralmente são carregados 500 microlitros de lisado. Usando pinças, abaixe cuidadosamente o gradiente no compartimento de um rotor de rotor oscilante. Centrifugue os gradientes a 100.000 ×g por quatro horas a quatro graus Celsius.Aproximadamente 30 minutos antes da conclusão da centrifugação de quatro horas. Conecte a agulha ao perfurador do tubo e conecte a caneta ao monitor online de absorbância e fluorescência. Ligue a alimentação do monitor de absorbância para permitir que uma linha de base estável seja alcançada antes da análise das amostras.A aquisição eletrônica do perfil PolyZone pode ser facilmente obtida em tempo real conectando uma unidade de aquisição de dados DI 1 48 U. Ao gravador de gráficos, encha a bomba de seringa com 50 mililitros de florin nuts usando a configuração rápida de fluxo reverso. Certifique-se de que não haja bolhas de ar presentes.Conecte a mangueira da seringa ao perfurador de tubos. E ligue brevemente o fluxo de Flo inerte na direção direta a seis mililitros por minuto. Para remover bolhas de ar da mangueira, coloque uma série de tubos sob a mangueira na extremidade da célula de fluxo para coletar o escoamento da amostra.Prepare um balde de gelo com um orifício pré-formado para acomodar o tubo de centrífuga contendo o gradiente de sacarose. Quando a centrifugação de quatro horas estiver concluída, remova cuidadosamente os tubos de centrífuga do rotor da centrífuga e coloque-os sobre gelo, tomando cuidado para não perturbar os gradientes.Para analisar extratos celulares, coloque o tubo de gradiente no furador de tubos e conecte a parte superior do tubo à saída e fixe. Eleve o estágio inferior até o tubo de centrífuga para que a agulha perfure a base do tubo. Inicie o fluxo de Florin alert no sentido direto a seis mililitros por minuto.Uma vez que o fluxo tenha começado a entrar no tubo, monitore o movimento da agulha no monitor online de absorbância UV. Quando a agulha começar a se mover, ligue o movimento do gráfico para uma velocidade de 60. Quando o final do perfil de polirribossomo for alcançado, desligue o fluxo de Flo inert para o tubo de centrífuga e pare o movimento do gráfico no monitor de absorbância e fluorescência.Retire o Flo inerte do tubo de centrífuga para dentro da seringa iniciando o fluxo em direção reversa em uma taxa rápida, tomando cuidado para não aspirar a sacarose do tubo para dentro da seringa. Desrosqueie o tubo de centrífuga do perfurador de tubos, abaixe a agulha e remova o tubo. Um traçado representativo de um extrato de ribossomos preparado a partir de levedura na presença de ciclo-heptano é mostrado aqui.Os picos de absorvância UV contendo polirribossomos e ribossomos A TS 60 s e 40 s são indicados. Acabamos de mostrar como realizar a análise de polirribossomos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de trabalhar rapidamente, mantendo as amostras frias e os RNAs livres de degradação.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte em seus experimentos.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui, descrevemos um método para analisar mudanças na iniciação da tradução do mRNA de células eucarióticas em resposta a condições de estresse. Este método baseia-se na separação de velocidade em gradientes de sacarose de traduzindo ribossomas de ribossomas não traduzindo.

Análise da Tradução Iniciação Durante condições de estresse por polysome Profiling

Este protocolo ilustra modificações essenciais da polyribosome fraccionamento, a fim de estudar o translatome in vivo de amostras do SNC. Ele permite que a avaliação global de tradução e transcrição regulação através do isolamento e comparação de RNA total para ribossomo frações de RNA ligado.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Ribossomas desempenham um papel central na síntese de proteínas. Polyribosome (polysome) fracionamento por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose permite a determinação direta da eficiência de tradução de mRNAs individuais em uma escala de todo o genoma. Além disso, este método pode ser usado para a análise bioquímica de ribossomas e factores associados--polissomas como acompanhantes e moléculas de sinalização.

Polysome Fracionamento e Análise de mamíferos Translatomes em uma escala genômica

A capacidade das células de se adaptarem ao estresse é crucial para sua sobrevivência. A regulação da tradução do mRNA é uma dessas estratégias de adaptação, proporcionando uma regulação rápida do proteoma. Aqui, fornecemos um protocolo padronizado de perfil de polissoma para identificar mRNAs específicos que são traduzidos seletivamente sob condições de estresse.

Avaliação da Seletiva mRNA Tradução em células de mamíferos por polissoma Profiling

Este protocolo descreve um método fácil de extrair e fracionar transcritos de tecidos vegetais com base no número de ribossomos ligados. Permite uma estimativa global da atividade de tradução e a determinação do status translacional de mRNAs específicos.

Um método fácil para a planta polysome Profiling

Regulamento translacional desempenha um papel importante no controle da abundância de proteína. Aqui, descrevemos um método de alta produtividade para análise quantitativa de tradução em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae.

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

O objectivo geral da técnica de criação de perfil de polysome é análise da actividade translacional de mRNAs individuais ou mRNAs transcriptome durante a síntese de proteína. O método é importante para estudos de regulamento de síntese de proteínas, ativação de tradução e repressão em saúde e várias doenças humanas.

Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.

Perfil de polissomas sem fabricantes de gradientes ou sistemas de fracionamento

As interações co-translacionais desempenham um papel crucial nas modificações da cadeia nascente, na segmentação, na dobra e nas vias de montagem. Aqui, descrevemos o Perfil Ribossomo Seletivo, um método para in vivo, análise direta dessas interações no modelo eucariote Saccharomyces cerevisiae.

Identificação Global de Redes de Interação Co-Translacional por Perfil Seletivo Ribosome

Traduzindo ribossomos decodificam três nucleotídeos por codon em peptídeos. Seu movimento ao longo do mRNA, capturado pelo perfil ribossomo, produz as pegadas exibindo periodicidade trigêmea característica. Este protocolo descreve como usar o RiboCode para decifrar esse recurso proeminente de dados de criação de perfil ribossomos para identificar quadros de leitura abertos traduzidos ativamente no nível de transcriptome inteiro.

De novo Identificação de quadros de leitura abertos traduzidos ativamente com dados de perfil ribossomo

Aprenda a separar monossomos e polirribossomos de lisados celulares eucarióticos usando gradiente de sacarose e traçado UV. Este método permite analisar regulação da tradução e dinâmica ribossomal em diferentes condições experimentais.

Análise de Perfil eucarióticas Polyribosome

Explorar mais vídeos