Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar métodos de imagem viva e quantificação simples para analisar a morfologia de células epiteliais embrionárias. Isso é realizado primeiramente preparando todas as ferramentas e aparelhos necessários. O segundo passo do procedimento é dissecar X explan de embriões de rã e acomodá-los em câmaras para cultura de longo prazo.

O terceiro passo do procedimento é coletar imagens de alta resolução de células epiteliais em tempo real. O passo final do procedimento é quantificar os detalhes morfológicos das células epiteliais utilizando o Image J. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram áreas celulares rastreadas e intensidades de membrana por meio de microscopia confocal de alta resolução. Olá, sou Sagar Joshi do Laboratório Davidson do Departamento de Bioengenharia da Universidade de Pittsburgh.

Hoje vamos mostrar um procedimento para imagem de células vivas e análise quantitativa de células epiteliais embrionárias de Xenos lavia. Utilizamos este procedimento para estudar alterações em tempo real no citoesqueleto celular. Então, vamos começar.

Para preparar as câmaras para o cultivo de explantes de calota animal, use graxa de silicone para selar uma câmara acrílica personalizada ou uma arruela de náilon pequena a um lamínula grande de 45 por 50 milímetros. Adicione um mililitro de BSA 1% em um terço de XMBS à câmara. Revesta fragmentos pequenos de lamínulas com a mesma solução e incube por duas a quatro horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius.

Para reduzir a adesão do X explan ao vidro, enxágue e preencha a câmara com meio DFA até logo antes de transferir os xs, enxaguando os fragmentos de lamínula da mesma maneira. Em seguida, imerja-os em uma placa com embriões de cultura DFA que foram microinjetados no estágio de uma a quatro células com o MR NA desejado até o estágio desejado em um terço de XMBS. Utilize uma pipeta de transferência com abertura inclinada para transferir os embriões para uma placa com DFA sob um microscópio estereoscópico de dissecção.

Use uma pinça para imobilizar os embriões e excisar uma planta CapEx animal. Use um laço de cabelo para sustentar um embrião em uma posição. Use uma lâmina de cabelo para fazer uma pequena incisão no polo animal.

Realize cortes suaves e repetidos com o bisturi para ampliar a incisão e remover o ectoderma do capuz. Disseque três ou quatro x explantes da mesma maneira. Em seguida, utilize uma pipeta de transferência para movê-los para a câmara de cultura preparada.

Usando o laço de cabelo, posicione cada X explan de modo que o epitélio fique voltado para o fundo da câmara. Usando pinça, segure um fragmento de lamínula pelo seu centro.

Mergulhe as extremidades em graxa de silicone. Coloque um fragmento sobre cada X explicativo. Fixe levemente cada fragmento no lugar com pequenas quantidades de graxa de silicone.

Tendo o cuidado de não esmagar completamente o X explan com força excessiva. Encha a câmara com DFA e cubra as bordas superiores da câmara com graxa de silicone. Em seguida, feche a parte superior com uma lamínula de 24 x 40 milímetros.

Ajuste o nível do DFA dentro da câmara para reduzir bolhas de ar e use tecido para remover qualquer excesso. As plantas X podem agora ser cultivadas a longo prazo na câmara selada por um dia à temperatura ambiente; posicione o objetivo de 20 x de um microscópio confocal. Coloque a câmara contendo o explante X na platina do microscópio e posicione pequenos pesos de equilíbrio sobre a câmara para mantê-la fixa sob campo claro.

Ajuste o foco e use o posicionamento grosseiro para visualizar as extremidades apicais das células superficiais. Mude para fluorescência e para uma objetiva de maior aumento. Para coletar imagens individuais ou filmes com lapso de tempo do epitélio explantado, ajuste a aquisição para obter a melhor imagem possível.

Consulte a parte escrita deste protocolo para obter dicas sobre ajuste e imageamento. Mantenha a potência do laser tão baixa quanto possível. Capture imagens ou filmes em lapso de tempo do epitélio x.

Consulte a parte escrita do protocolo para sugestões sobre coleta de dados. Arquivos de imagens confocais podem ser explorados para obtenção de dados de várias maneiras. Abaixo seguem dois exemplos de como analisar arquivos de dados utilizando o software de análise Image J com o plugin bioformats.

Para medir a área celular de uma célula epitelial, abra o menu analisar e clique em definir medições. Selecione a ferramenta de seleção na barra de ferramentas e contorne a célula no menu analisar, selecione ferramentas e depois o gerenciador de ROI. Para abrir o gerenciador de regiões de interesse, pressione Ctrl+T.

Para adicionar o contorno ao gerenciador de ROI, selecione e adicione quantos contornos desejar a partir da imagem. Em seguida, clique em salvar para armazenar o conjunto de ROI no gerenciador de ROI. Clique em medir.

A janela de resultados agora mostrará as áreas medidas de cada ROI. Para medir a intensidade de uma membrana celular, selecione a ferramenta de linha reta na barra de ferramentas do ImageJ. Trace uma linha perpendicular através da membrana.

Pressione CTRL T como no exemplo anterior. Para adicionar a seleção ao gerenciador de ROI, abra o menu analisar e clique em perfil de plotagem para gerar um gráfico das intensidades relativas ao longo da linha. Para salvar o gráfico como uma imagem, clique em salvar na nova janela de plotagem que aparece.

Abra o menu suspenso em Arquivo e, em seguida, salve como. Acabamos de mostrar como obter imagens em tempo real e quantificar células epiteliais embrionárias a partir de explantes de CapEx animais removidos. Durante este procedimento, é importante lembrar-se de adicionar antibiótico e antibiótico ao DFA. Para inibir o crescimento bacteriano e fúngico, tenha cuidado extra ao comprimir os explantes sob as lamínulas, pois pressão excessiva pode esmagar o explante.

Também é importante lembrar de ajustar as configurações ideais no microscópio confocal para obter dados de imagem de qualidade máxima. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.