Name: Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda a analisar funções tecido-específicas de vias de sinalização na formação de folículos capilares usando células dérmicas e epidérmicas de camundongos recém-nascidos. Este método permite avaliar rapidamente o efeito da manipulação gênica no crescimento capilar em três semanas.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) e concede NIH AR052785 e AR046786 (AEO e W. MW).

1. Prepare 0-2 dias de idade ratos recém-nascidos para a dissecção da pele <ol><li> Euthanize filhotes de rato, utilizando uma câmara de CO 2 durante pelo menos 20 min. Deixar filhotes em gelo até uma hora, até que a dissecção. P0-P2 ratos são altamente recomendados como células preparadas a partir de ratos mais velhos têm capacidade reduzida progenitor que resulta em menores rendimentos de enxerto. Preparar um prato de etanol a 70% (para o passo 1.3), e três pratos de solução de lavagem (para o passo 3) quando estiver pronto para executar a dissecção da pele. Descongele Solução Dispase e deixe-a 4 ° C. Cervical deslocar filhotes após superexposição CO 2 para garantir a eutanásia. </li><li> Coloque filhotes sacrificados em uma placa de cultura sobre gelo e transferência para uma câmara de fluxo estéril. </li><li> Lave filhotes por breves instantes, a imersão em etanol 70% e coloque sobre prato de cultura estéril. </li></ol> 2. Dissecar pele do rato <ol><li> Cortar cada um dos membros e na base da cauda do torso com tesoura estéril. </li><li> Segure firmemente o corpo entre um par de cufórceps rved e fazer uma incisão na pele do dorso da cabeça à cauda, ​​usando um bisturi sem penetrar na fáscia. </li><li> Retire cuidadosamente a pele longe da linha média do mouse. </li><li> Segure o mouse exposto firmemente com o lado longo do fórceps curvos e inserir um outro par de pinças curvas debaixo da pele na extremidade posterior do mouse e puxe a pele sobre os quadris em direção ao meia ventral do mouse. </li><li> Retire cuidadosamente a pele completamente fora do mouse em um movimento suave e descarte da carcaça. </li></ol> 3. Lavar a pele e incubar com Solução Dispase <ol><li> Coloque a pele no primeiro prato de solução de lavagem com o lado da derme para baixo. Espalhe pele para fora e agitar com uma pinça. Deixar a pele no primeiro prato da solução de lavagem, enquanto dissecar a pele em seguida. </li><li> Depois de colocar a pele próximo dissecados no primeiro prato de solução de lavagem, transferir a pele antes de o segundo prato de solução de lavagem. Mantenha peles em poe solução de lavagem segundo até que todas as peles são coletados. Transfira a totalidade das peles para a lavagem final, agitar brevemente. </li><li> Adicionar 10 ml de gelo Dispase frio para um estéril prato de cultura de 10 cm. Transfira pele para a solução Dispase e achatar pele derme voltada para baixo. </li><li> Flutuador da pele para 8-16 horas a 4 ° C (solução alternativa: 1 hora a 37 ° C). </li></ol> 4. Derme separado e Epiderme <ol><li> Transfira para um prato pele nova cultura estéril e achatar pele derme voltada para baixo. Cuidadosamente pressione a derme de um canto com um bisturi. </li><li> Segure a epiderme com uma pinça e lentamente casca de distância da derme. Epiderme deve descascar como uma peça. A epiderme será branca e fina ea derme deve ser marrom, mais grosso e gelatinoso. </li><li> Separa-se os dois tecidos separados em placas de cultura estéreis. <ol class="lalpha"><li> Para fazer um enxerto dérmico gene específico knockdown / superexpressão, tomar derme e pique em pedaços muito pequenos, com tbisturis WO. Descarte epiderme. No dia da infecção (passo 7), dissecar outro conjunto de peles de rato para preparar frescos não tratados, as células epidérmicas se combinar com lentiviral infectadas células dérmicas. </li><li> Para fazer um enxerto epidérmico gene específico knockdown / superexpressão, corte cada epiderme em 6-8 pedaços menores. Descarte derme. No dia da infecção (passo 7), dissecar outro conjunto de peles de rato para preparar frescos não tratados, as células dérmicas de combinar com lentiviral infectadas células epidérmicas. </li></ol></li></ol> 5. Dissociar células primário do mouse dérmicas (mDCs) de tecido picada <ol><li> Dissociar mDCs incubando partes dérmicos com solução de colagenase feita de fresco a 37 ° C durante 1 h. Use 10 ml de solução de colagenase por rato filhote. </li><li> Misture delicadamente derme solução contendo cada 10 min. Verificar o grau de dissociação sob um microscópio, a suspensão de células deve ser digerido principalmente células individuais. A solução deve passar de claro a nublado comocélulas dérmicas são dissociados a partir da derme. </li><li> Adicionar a solução de colagenase FBS contendo derme para um volume final de 10% de redução da actividade da colagenase. </li><li> Passar a suspensão de células através de um coador de células 70 um para um tubo novo 50 ml para remover grandes aglomerações não digeridas e folículos inteiros. Adicionar 10 ml de DMEM/10% de FBS por 30 ml do fluxo através para diluir ainda mais a colagenase. </li><li> Tubos de centrífuga contendo derme digerida a 30 xg numa centrífuga de bancada durante 5 minutos para remover adicionalmente folículos inteiros. </li><li> Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo novo ml 50. Células de pelotas por centrifugação a 200 xg numa centrifugadora de mesa, durante 5 min. </li><li> Ressuspender as células com FBS DMEM/10% (1 ml por pup) e contagem de células. Células da placa com Amniomax C-100 meios para a infecção (passo 7), ou para combinar com lentivírus infectadas KC-enxertos (passo 9). Rendimento típico é de 20 x 10 6 células por filhote. </li></ol> 6. Dissociar queratinócitos primários (KC) a partir de tecido triturada <ol><li> Dissociar KC incubando partes epidérmicas com recém-descongeladas 0,05% Tripsina-EDTA a 37 ° C durante 15 min. Use 7 ml de tripsina-EDTA, por ratinho pup. </li><li> Gentilmente solução redemoinho contendo epiderme a cada 5 minutos. </li><li> Adicionar um volume igual de solução de neutralização de Tripsina-EDTA contendo epiderme para reduzir a actividade da tripsina. </li><li> Células de pelotas por centrifugação a 200 xg numa centrifugadora de mesa, durante 5 min. Restante tecido não digerido deve flutuar em cima. </li><li> Verter cuidadosamente a maior parte do sobrenadante com o tecido não digerido. Remover o sobrenadante restante com uma pipeta de 10 ml sem perturbar pellet celular. Ressuspender pellet celular com PBS. No caso de KCS não são sedimentadas completamente, verter a maior parte do sobrenadante e repetir a centrifugação até que a maioria das células são sedimentadas. </li><li> Estirpe suspensão de células através do filtro 70 uM de células para um novo tubo para remover o tecido restante ou grumos. </li><li> Pellet células por centrifugaçãoa 200 xg numa centrifugadora de mesa, durante 5 min. </li><li> Ressuspender as células em CNT-07 mídia ou PBS (1 ml por filhote) e contagem de células. Use CNT-07 por células em placas para a infecção (passo 7), use PBS para combinar com lentivírus infectadas mDCs para enxerto (passo 9). Rendimento típico é 3-10 x 10 6 células por filhote. </li></ol> 7. Infectar células primárias com Lentivirus Contendo shRNA ou cDNA No dia da infecção dissecar outro conjunto de peles de rato para preparar frescos não tratados KCS primários ou MDCs para combinar com células infectadas por vírus no dia do enxerto (passo 9). <ol><li><ol class="lalpha"><li> Para mDCs, placa de 4 x 10 6 mDCs por 10 cm de placa com Amniomax-C100 media e incubar a 37 ° C + 5% de CO2 para a infecção no dia seguinte a uma densidade celular de 50%. Placas geralmente 3-4 mDCs são usados ​​para gerar um enxerto, e um total de 10-12 placas são necessárias para gerar três enxertos em um experimento. Como alternativa, deixe mDCs anexar e espalhar fou um mínimo de 2 horas a 37 ° C + 5% de CO 2 e execute infecção no mesmo dia de plaqueamento das células. mDCs terá de fibroblastos-like morfologia. </li><li> Para KC, placa de 12 x 10 6 KC por 10 cm de placa com CNT-07 mídia e incubar a 37 ° C + 5% de CO 2 para a infecção pelo dia seguinte. Alternativamente, deixa KC anexar e espalhar por um período mínimo de 2 horas a 37 ° C + 5% de CO 2 e execute infecção no mesmo dia. Normalmente as placas 3-4 de KC são usados ​​para gerar um enxerto. Um total de 10-12 placas são necessários para gerar três enxertos para um experimento. KCS terá morfologia paralelepípedos. </li></ol></li><li> Pré-incubação de células de 5-10 min com 8 ug / ml Solução Polybrene a 37 ° C + 5% de CO 2. </li><li> Troca de mídia e adicionar lentivírus + 8 mg / ml solução Polybrene. Título Lentivirus irá variar dependendo da construção utilizada e deve ser determinado antes da infecção. </li><li> Centrifugar as placas a 200 xg numa centrifugadora de mesa, durante 1 hora a 32 °; C para infectar células com lentivirus. </li><li> Remover lentivírus contendo mídia e adicionar novas mídias. Para KC, lavar as células uma vez com PBS antes de adicionar de volta novas mídias. As células normalmente infectadas recuperar durante a noite a 37 ° C + 5% de CO 2. Em alternativa, permitir que pelo menos duas horas de recuperação, a 37 ° C + 5% de CO2 antes de trypsinizing as células para enxertos. Continuar a cultura de uma pequena porção de células infectadas para verificar a eficiência de infecção, tal como descrito na secção de resultados representativos. </li></ol> 8. Prepare células infectadas para Enxertia <ol><li> Isolar frescos mDCs primárias ou KCS de pele usando os passos 4-6. Ressuspender as células em gelada PBS estéril. Contar as células. </li><li><ol class="lalpha"><li> Para dérmica gene específico enxerto knockdown / superexpressão, dissociar mDCs infectadas a partir de placas com 0,05% Tripsina-EDTA a 37 ° C durante 8 min. </li><li> Para epidérmico gene específico enxerto knockdown / superexpressão, dissociar KC infectadas a partir de placas de using 0,125% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 15 min. </li></ol></li><li> Neutralizar a actividade de tripsina utilizando DMEM + 10% FBS (mDCs) ou solução neutralizante (KC). Transferir as células tripsinizadas em um tubo de 50 ml. </li><li> Células de pelotas por centrifugação a 200 xg numa centrifugadora de mesa, durante 5 min. </li><li> Ressuspender as células em gelada PBS estéril. Contar as células. </li><li> Reúne-se as células infectadas por vírus com o tipo de célula preparada de fresco não tratado correspondente. Por um enxerto, combinam 7-10 x 10 6 mDCs com 7-10 x 10 6 KCS em gelo PBS estéril e pellet a pasta de células numa centrífuga de bancada a 4 ° C. Ressuspender as células em 50 -100 ul gelada PBS estéril. Manter as células em gelo até câmaras nu / nu do mouse estão prontos. </li></ol> 9. Criar leito da ferida e da Câmara Fix nas costas de nu / nu Rato Um dia antes de enxertia, esterilizar instrumentos cirúrgicos com câmaras de silício autoclave e estéril por imersão em etanol 70%. Substitua o Etha de 70%nol com PBS estéril antes de usar as câmaras. <ol><li> Anesthetize nu / nu de rato (7-12 semanas de idade, sexo feminino) com cetamina (8 mg / ml) / xilazina (1,6 mg / ml) através de injecção intraperitoneal (100 g de peso corporal μl/10) ou outro método preferido. Aplique lubrificante ocular. Almofada de aquecimento sob lugar do mouse. </li><li> Desinfectar a pele volta nu mouse com iodo e limpar com álcool. </li><li> Adicionar 1-3 gotas Bupivicaine 0,25% a incisão topicamente. Aperte a pele de volta nu rato na base do pescoço com uma pinça. </li><li> Cortar um furo circular pequena (~ 1 cm de diâmetro) na pele presa com tesoura estéril. </li><li> Coloque câmara estéril em leito da ferida e cobrir as bordas da câmara com pele circundante. </li><li> Câmara seguro no lugar com suturas ao longo das arestas da câmara (6 pontos por câmara) como mostrado na Figura 2A. </li><li> Quando câmaras estão prontos, gentilmente pasta celular redemoinho e elaborar em 23 agulha de calibre ligado a uma seringa ml. Se lama celular foi condensado na parte inferior, suavementeressuspender com uma ponta de pipeta ml antes de desenhar na agulha. </li><li> Câmara de punção com agulhas e lentamente por gotejamento em células de feridas. </li><li> Camundongos colocar em gaiolas limpas, autoclavada. Casa 2 ratos por gaiola e adicionar antibióticos e Tylenol (3 mg / ml) para a água potável. Na nossa experiência, dois ratinhos fêmeas em cada gaiola não resultaram em trauma adverso para a câmara, enxerto, ou animais. </li><li> Coloque almofada de aquecimento sob o meia gaiola e observar ratos até anestesia desgasta fora. </li></ol> 10. Remover Câmara Após 7-9 dias <ol><li> Anestesiar chambered nu / nu rato como no passo 9.1. Aplique lubrificante ocular. </li><li> Desinfectar a pele ao redor da câmara com iodo e limpar com álcool. </li><li> Corte cuidadosamente e retire pontos da câmara. </li><li> Remova cuidadosamente câmara de mouse. Se varas novas da pele de enxerto para a câmara, retire parte da câmara e enxerto delicadamente separada da câmara usando uma pinça. Segurar enxerto para baixo durante a remoção da câmara. Enxerto deve look maçante e opaco como na figura 2B. </li><li> Aplicar uma camada não-aderente com uma fina película de antibióticos sobre o ferimento aberto e sutura no lugar (2 pontos). </li><li> Enrole atadura em torno do rato para fixar a almofada e proteger a ferida. Suturar bandagem no lugar. </li><li> As câmaras de silício são limpos por lavagem com sabão neutro e bem enxaguados com água deionizada. Mergulhe as câmaras em etanol a 70% durante a noite, o ar seco, e loja. </li></ol> 11. Examine Rato para o crescimento do cabelo <ol><li> Remover ataduras e almofada após 3 dias de remoção de câmara. Enxerto deve ser seco e opaco para na cor marrom. </li><li> Verifique periodicamente ratos para o crescimento do cabelo. O cabelo deve começar a mostrar menos 16 dias após enxerto. </li></ol> Esboço procedimento Dia 1 (2-3 hr): Sacrifica crias recém-nascidas, remover a pele, e deixar em dispase a 4 ° C durante a noite. Dia 2 (2-3 horas): isolar as células primárias da pele eplaca com uma densidade de célula recomendada. Dia 3 (3-4 horas): Infect células com lentivirus. Remover a pele a partir de um outro conjunto de crias recém-nascidas e deixar em dispase a 4 ° C durante a noite. Dia 4 (6-8 horas): isolar as células primárias de pele, contar e deixar no gelo. Recuperar as células infectadas com lentivírus por tripsinização e centrifugação, contar e combinar 7-10 x 10 6 células dérmicas e queratinocitos em 50-100 ul de PBS por enxerto. Criar leito da ferida no mouse, anexar câmara, e aplicar a mistura de células de ferir cama. Procedimento Alternativo Outlines Contornos procedimento alternativo irá reduzir o processo de quatro dias a três. <ol><li> Combinar Dia 1 e Dia 2, tratando peles de rato em dispase a 37 ° C durante uma hora (hr hora estimada 5-7). </li><li> Combinar o Dia 2 e Dia 3, infectando células com células em placas após o lentivírus de duas horas (tempo estimado hr 5-7). </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Ensaios de reconstituição de cabelo fornecer um modelo de regeneração único órgão para examinar o mecanismo de formação de folículo novo cabelo. Aqui, nós descrevemos um ensaio modificado câmara cabelo útil para determinar a função do gene na formação do folículo piloso. O nosso ensaio baseia-se no ensaio de reconstituição relatado câmara cabelo 5, 6,11, o que foi modificado para introduzir uma técnica de expressão lentiviral para alcançar sobre-expressão do gene ou knockdown em ambos os tipos de células dérmicas ou epidérmicas. O nosso ensaio proporciona uma alternativa rápida à geração específica de tecido nocaute genético. Este ensaio nos permite demonstrar a função dos genes na formação dos folículos pilosos em menos de três semanas de infectar células primárias com lentivírus para coleta de enxerto. O nosso ensaio pode ser alargado a interacções genéticas usando combinação shRNA / entrega cDNA por lentivírus em um tipo de célula 12, assim como permite o exame de sinalização entre o typ célula epidérmica e dérmicaes. O nosso ensaio o cabelo é mais adequado para a detecção de fenótipos fortes de ganho ou perda de função na regeneração do folículo piloso, enquanto que os defeitos subtis são mais difíceis de observar. Temos demonstrado com sucesso a função do gene dérmica específico de alguns genes com o nosso ensaio regeneração do cabelo 1,12. Com base no marcador GFP co-expressos a partir do vector de lentivírus expressando shRNA 10, demonstrou-se que o shRNA expressando células doadoras dérmicos persistiu nos enxertos de cabelo regenerados. GFP-positivas estavam presentes em células da papila dérmica (DP) dos folículos pilosos regenerada (Figura 3). As células DP provavelmente consistiam de diferentes níveis de knockdown do gene como células expressaram níveis variáveis ​​de GFP, assim o fenótipo do folículo de cabelo observada era uma gama de genética hypomorph como nulo. Uma melhoria para este ensaio será o de estabelecer uma seleção rápida e eficiente para as células que expressam shRNA alta antes grafting tal como a utilização de FACS para purificar fortes GFP-expressando células. Uma alternativa consiste em substituir as células mutantes knockout ou condicional neste ensaio 9. Por outro lado, um sistema de cultura que pode preservar a função da célula DP é muito útil como a potência DP é gradualmente perdido, uma vez que as células dérmicas primárias são passadas. Sistemas de cultura potenciais incluem o uso de biomateriais derivados de nicho artificial ou culturas de agregação 2,7,8,13. Outro melhoramento será gerar um método fiável de congelação de células da epiderme, com uma elevada taxa de recuperação de células, porque isto reduziria a utilização do segundo grupo de crias de rato (etapa 7) para gerar os queratinócitos frescas em dermo-específico perda ou ganho-de- estudos de função. Este ensaio cabelo câmara produz a densidade dos folículos pilosos e de qualidade semelhante à pele do rato normal, embora o crescimento do cabelo é um pouco menos sincronizados e orientação folículo é mais aleatória. Algumas limitações do ensaio de regeneração de cabelo genética include a exigência de grande quantidade de lentivírus e os números de células, e é um trabalho muito intensivo em termos de métodos cirúrgicos, quando comparada a outras formas de ensaios de reconstituição do cabelo, tais como o adesivo das abas e ensaios 3,4,14. No entanto, a qualidade dos folículos pilosos e linha de tempo para detectar o crescimento do cabelo é superior aos outros ensaios 4. Nosso ensaio regeneração alvo cabelo fornece um companheiro rápido e conveniente para os actuais modelos genéticos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Catalogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> CNT-07 </td><td> Célula N Tec </td><td> CNT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 Suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> A colagenase, Tipo 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultura de tecido </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura Dissecando </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-275 </td><td> curvada </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex Abastecimento </td><td> GRF-2975 N º 10 </td><td> Sem tamanho. 10 </td></tr><tr><td> 70 stainer célula mM </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubo de centrífuga cónico </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49D </td><td></td></tr><tr><td> Compressas com álcool </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> Agulha de calibre 23 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Lubrificante ocular </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providone-Lodine cotonetes </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silício Chambers </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> Suturas </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Bandagem flexível </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Não aderente vestir </td><td> Telfa </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiais </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lave solução PBS 500 ug / ml Penicilina / Estreptomicina 12,5 ng / ml Fungizone 100 ug / ml de gentamicina Solução dispase HBSS 2,5 mg / ml final Dispase 100 ug / ml de gentamicina Mídia neutralizantes HBSS 15% (v / v) de FBS Solução de colagenase 0,25% (w / v) de colagenase, tipo 1 ONTEÚDO &quot;&gt; 100 ug / ml de Penicilina / Estreptomicina 2,5 ug / ml de Fungizone 50 ug / ml de gentamicina Solução Polybrene HBSS 8 ug / ml (w / v) Polybrene </td></tr></tbody></table>

análise genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Morfogénese do folículo de cabelo, um processo complexo que requer a interacção entre epitélios derivados de queratinócitos e o mesênquima subjacente, é um sistema de modelo atractivo para estudar o desenvolvimento de órgãos e tecidos específicos de sinalização. Embora o desenvolvimento de folículos do cabelo é geneticamente tractable análise rápida e reprodutível de factores essenciais para este processo continua a ser um desafio. Aqui descrevemos um procedimento para gerar superexpressão alvo ou shRNA mediada knockdown de factores utilizando lentivírus de um modo específico do tecido. Usando uma versão modificada de um modelo de regeneração do cabelo 5, 6, 11, pode-se atingir o ganho ou perda robusto de função de análise em queratinócitos de ratinho ou as células dérmicas primárias para facilitar o estudo de epitelial-mesenquimal as vias de sinalização que conduzem à morfogénese folículo piloso . Nós descrevemos como isolar frescos queratinócitos principal do mouse e células dérmicas, que contêm células da papila dérmica e seus precursores, entregar lentivírus containing ou shRNA ou cDNA para uma das populações de células, e as células se combinam para gerar folículos pilosos completamente formados nas costas de ratinhos nus. Esta abordagem permite a análise de tecido, os factores específicos necessários para gerar folículos capilares dentro de três semanas e proporciona um companheiro rápido e conveniente para os actuais modelos genéticos.

Na Figura 1 mostra o resultado de dermo-específico knockdown shRNA lentiviral de Smoothened (Smo), um componente crítico Shh sinalização, num enxerto de cabelo de 3 semanas de idade regenerativa. Os enxertos de controlo utilizando vector lentiviral sozinha mostra o crescimento do cabelo robusta (Figura 1A). Em contraste, por via cutânea específica knockdown de Smo resulta na perda do crescimento do cabelo (Figura 1B). Hematoxilina e eosina ilustra a fase de controlo de folículos pilosos e das condições experimentais (figura 1C, D). O fenótipo de crescimento do cabelo a partir de tratamentos semelhantes podem ser variáveis ​​entre experiências, incluindo o controlo positivo com infecção vector lentiviral sozinho. Enxertos de controle, portanto, positivas devem sempre ser incluídos em cada experiência como uma referência como 30% dos enxertos podem falhar como resultado de cicatrizes ou anexo incompleta de enxertos. No caso do teste de uma interacção entre dois factores, tais como overexpressing cDNA de um factor de rescue knockdown shRNA mediada de um outro fator, deve-se sempre incluem enxertos knockdown só para manifestar o resultado de perda de função em cada experimento. Isto irá fornecer um alcance necessário para determinar como um gene particular perturba o cabelo caminho de regeneração dos folículos e como dois genes interagem. Remoção da câmara (Figura 2A) deve ser feita com cuidado. O enxerto recém-formado deve ser ligeiramente opaco com uma superfície opaca (Figura 2B). O enxerto pode ficar para a câmara, tão suavemente levantando um lado é importante certificar-se o enxerto permanece presa ao leito da ferida. O enxerto é bastante estável depois de três dias e deve apresentar pouca dificuldade na remoção do penso. O crescimento do cabelo robusto devem ser observados depois de três semanas (Figura 2C). Omitindo quer mDCs ou KCS resultará num local da ferida recuperou sem pêlos (Figura 2D) 11. A morte celular ou perda de células num dostipos de células também resulta em nenhum cabelo, em contraste com a regeneração do cabelo reduzido em dermo-Smo knockdown, como mostrado na Figura 1B. Para assegurar um teste bem sucedido, é fundamental para conseguir mais do que 90% de infecção virai de células com sobre-expressão apropriada ou eficiência knockdown antes da enxertia. Devido às restrições de tempo do procedimento de enxertia, recomendamos resolução de problemas eficiências de infecção viral antes de iniciar a experiência do miocárdio, e sempre guardar uma pequena porção de células no dia da enxertia procedimento para verificar a perda ou ganho de expressão. Título Lentivirus irá variar dependendo da construção utilizada e deve ser determinado antes da infecção para alcançar eficiência 90-100%. Nós monitoramos eficiência de infecção viral com GFP coexpressas a partir do vetor lentivírus. Rotineiramente executar PCR quantitativo e / ou de transferência de Western para determinar a extensão do knockdown ou sobre-expressão. Utilizando dupla-expressão vetores com marcas fluorescentes para rotularAs células infectadas por vírus fornece uma maneira de comunicar perdurance de sinal e número de células que expressam as construções em enxertos maduros. Usamos GFP conduzida por um promotor de CMV a partir do vector lentiviral pSicoR-CMV-GFP 10 em combinação com Smo shRNA. Na Figura 3, mostramos um 3-semana enxerto dermo-específica antiga, onde GFP é lentivirally expresso em papila dérmica de um folículo piloso representante. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Figura 1. A análise histológica do crescimento do folículo capilar. (A) Vista de controlo de regeneração do cabelo com enxerto de células dérmicas infectadas com vector lentiviral vazio e queratinócitos não tratados. (B) usando knockdown Smoothened shRNA lentiviral em células dérmicas combinada com resultados não tratados queratinócitos na perda dos folículos pilosos. (C) Hematoxilina e eosina mostra anágena f cabeloollicles em enxertos de controle de estender-se até a derme e (D) folículos pilosos Smoothened knockdown permanecer atrofiado e grande parte ausente. Todas as imagens têm três semanas depois do enxerto. Barra de escala indica 100 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Figura 2. Enxertia células primárias. (A) rato nu / nu com suturadas câmara habitação principais células dérmicas e queratinócitos. (B) Remoção de câmara expõe recém-formado pele que é maçante e opaco no caráter. (C) cabelos totalmente crescidas sobre enxerto utilizando selvagem tipo primário células dérmicas e queratinocitos nas três semanas após o enxerto. (D) Adição de células primárias de queratinócitos da derme sem conduzir à ausência de cabelo depois de três semanas. Resultados semelhantes foram observados com a adição de queratinócitos primários sem células dérmicas. Figura 3. Manutenção da GFP expressão em papila dérmica. Imagens confocal papila dérmica de um 3-semana enxerto velho regenerado. GFP foi expressa na população de células dérmicas de um vector lentiviral e detectado na papila dérmica (verde). Versicam (vermelho) demarca a papila dérmica e núcleos foram etiqueta com Hoechst (azul). Nota GFP é expresso especificamente nas células da derme mas não nos queratinócitos circundantes. Barra de escala indica 20 um.

Tissue-specific análise de um modelo de regeneração do cabelo folicular usando lentivírus para mediar o ganho ou perda de função.

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

A morfogênese do folículo piloso, um processo complexo que requer a interação entre queratinócitos derivados do epitélio e o mesênquima subjacente, é um...

O objetivo geral deste procedimento é investigar as funções específicas de vias de sinalização em tecidos que são críticas para a formação do folículo piloso. Isso é realizado primeiramente isolando células dérmicas e epidérmicas primárias de camundongos recém-nascidos. Em seguida, a expressão gênica é alterada infectando-se as células primárias com lentivírus.O terceiro passo consiste em combinar as populações celulares epidérmicas e dérmicas em câmaras fixadas a um leito de ferida em um camundongo nu. O enxerto é então monitorado quanto ao crescimento dos pelos. Por fim, o efeito da manipulação gênica na formação do folículo piloso pode ser avaliado visualmente e por meio de coloração histológica do local do enxerto.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como um modelo nacal em camundongo, é que o enxerto pode ser concluído em três semanas. Este método pode responder perguntas fundamentais no campo da biologia do desenvolvimento, como a forma pela qual fatores em um tecido podem impactar a sinalização e a função em outro. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando desejávamos dissecar funções específicas de tecidos das moléculas do teto na formação do folículo piloso após lavar um camundongo que havia sido eutanasiado por asfixia.Corte cada membro e a cauda na base do tronco com tesoura estéril. Em seguida, segure firmemente o corpo entre um par de pinças curvas e faça uma incisão ao longo da pele dorsal, da cabeça até a cauda, usando um bisturi. Não penetre a fáscia subjacente.Agora, retire cuidadosamente a pele ao longo da linha média do camundongo. Segure firmemente o camundongo exposto com o lado longo da pinça curva e insira outro par de pinças curvas sob a pele na extremidade posterior do camundongo. Em seguida, retire cuidadosamente a pele completamente do camundongo com um movimento suave e descarte a carcaça.Coloque a pele no primeiro recipiente com solução de lavagem com o lado dérmico voltado para baixo. Espalhe a pele na solução e agite-a com a pinça. Em seguida, deixe a pele na solução de lavagem enquanto dissecar a próxima pele.Após colocar a próxima pele dissecada no primeiro recipiente com solução de lavagem, transfira a pele anterior para o segundo recipiente com solução de lavagem. Mantenha as peles na segunda solução de lavagem até que todas as peles sejam coletadas. Após a lavagem final, transfira até cinco peles para um recipiente contendo solução de disbe fria.Achate as peles com o lado dérmico voltado para baixo e deixe-as flutuar por oito a 16 horas a quatro graus Celsius. Transfira uma pele das bandejas frias para um novo recipiente. Ache-a com o lado dérmico voltado para baixo.Segure a epiderme com pin&ccedil;as e retire-a lentamente da derme. A epiderme deve se soltar em uma &uacute;nica pe&ccedil;a, ser&aacute; branca e fina, enquanto a derme ser&aacute; acastanhada, mais espessa e gelatinosa. Separe os dois tecidos em placas de cultura distintas para iniciar o isolamento celular.Para isolar células dérmicas, pique a derme em pedaços muito pequenos com duas lâminas de bisturi. Incube o tecido dérmico picado com solução fresca de colagenase a 37 graus Celsius por uma hora, agitando suavemente a mistura celular a cada 10 minutos; quando a digestão estiver completa.A suspensão deve conter principalmente células isoladas, e a solução deve ter mudado de transparente para turva. Agora, adicione um volume de 10% de soro bovino fetal (FBS) à suspensão celular. Passe-as através de um filtro celular de 70 mícrons para tubos de 50 mililitros.Colete até 30 mililitros de fluxo retido por tubo. Prossiga com o isolamento de células dérmicas conforme o protocolo escrito. Para isolar os queratinócitos, corte cada epiderme em seis a oito pedaços menores.Incube o tecido fatiado com tripsina 0,05% EDTA recém-descongelada a 37 graus Celsius por 15 minutos. Prossiga com o isolamento de queratinócitos conforme o protocolo escrito, anestesie um camundongo nu fêmea com sete a 12 semanas de idade utilizando ketamina e xilazina ou um método preferencial. Certifique-se de aplicar lubrificante ocular e posicione o camundongo sobre uma placa aquecida.Agora desinfete a pele das costas com iodo, seguido por álcool em swabs. Usando pinça, pince a pele na base do pescoço e corte um orifício com diâmetro de um centímetro na pele pinçada. Coloque a câmara sobre o leito da ferida e cubra as bordas da câmara com a pele circundante.Fixe a câmara com cerca de seis suturas. Apenas nas bordas, fixe uma câmara por camundongo. Uma vez que a câmara esteja fixada, verifique a suspensão celular. Se ela estiver condensada no fundo, ressuspenda-a suavemente com uma ponteira de pipeta de um mililitro.Agora, agite suavemente a suspensão celular e aspire-a com uma agulha de 23 gauge acoplada a uma seringa de um mililitro. Fure cada câmara com a agulha e goteje lentamente as células suspensas em PBS sobre a ferida. Quando os camundongos recuperarem da anestesia, coloque-os em gaiolas limpas autoclavadas, com dois camundongos por gaiola.Certifique-se de administrar antibióticos e Tylenol pela água de bebida. Após sete a nove dias, anestesie o camundongo nu tratado como feito anteriormente. Desinfete a pele ao redor da câmara com iodo e limpe com cotonetes de álcool.Corte cuidadosamente os pontos e remova-os da câmara. Remova suavemente a câmara caso a pele nova adere a ela. Separe delicadamente o enxerto da câmara.Usando pin&ccedil;as, segure o enxerto para baixo. Durante a remo&ccedil;&atilde;o da c&acirc;mara, o enxerto deve parecer opaco e sem brilho. Aplique uma gaze n&atilde;o aderente com uma fina camada de antibi&oacute;ticos sobre a ferida aberta e fixe-a com pontos, utilizando dois pontos.Enrole uma atadura ao redor do camundongo para fixar a gaze e proteger a ferida. Suture a atadura no lugar. Após três dias, remova as ataduras e a gaze. O camundongo não precisa ser anestesiado durante este passo.O enxerto deve estar seco e opaco, com coloração marrom. Verifique periodicamente o enxerto quanto ao crescimento de pelos, que deve começar a aparecer 16 dias após a realização do enxerto. Foi realizada uma inibição específica da derme no gene smoothened, que é um componente crítico da sinalização sonic hedgehog, em células dérmicas isoladas.Essas células foram aplicadas em enxertos de reconstituição capilar utilizando o protocolo descrito. Após três semanas de crescimento, os enxertos do controle positivo com vetor lentiviral isolado mostraram crescimento capilar robusto. No entanto, a diminuição da expressão do gene smoothened resultou em uma redução acentuada do crescimento capilar.Enxertos de controle negativo, omitindo-se células dérmicas primárias ou queratinócitos, resultaram em um local de ferida recuperado sem qualquer crescimento de pêlos. Da mesma forma, a morte celular ou perda celular de um dos tipos celulares no enxerto também resultou na ausência de crescimento de pêlos. Determinou-se que o vetor de lentivírus possuía boa eficiência de infecção antes do experimento de enxerto, e foi também projetado para produzir GFP juntamente com esta Smoothened, S-H-R-N-A.Assim, a visualização da papila dérmica dos folículos capilares em microscopia fluorescente serviu como um controle útil para confirmar a duração da expressão lentiviral. Após três semanas, a coloração H e E é utilizada para mostrar a fase de crescimento dos folículos capilares no enxerto controle e seu estágio de desenvolvimento atrasado quando a expressão de smoothened foi reduzida. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 14 horas ao longo de três dias, se executada corretamente. Esta técnica pode ser estendida para explorar a relação entre tumor e estroma durante a progressão do câncer no campo da biologia do câncer.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar a função gênica na formação do folículo piloso. Utilize nosso ensaio rápido de reconstituição capilar como uma alternativa aos tradicionais knockouts genéticos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

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