Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

O objetivo geral deste procedimento é investigar as funções específicas do tecido das vias de sinalização que são críticas para a formação do folículo piloso. Isso é feito isolando primeiro as células dérmicas e epidérmicas primárias de camundongos recém-nascidos. Em seguida, a expressão gênica é alterada infectando células primárias com lentivírus.

O terceiro passo é combinar as populações de células epidérmicas e dérmicas em câmaras presas a um leito de ferida em um camundongo nu. O enxerto é então monitorado quanto ao crescimento do cabelo. Em última análise, o efeito da manipulação gênica na formação do folículo piloso pode ser avaliado visualmente e por coloração histológica do local do enxerto.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como um modelo nacal de camundongo, é que o enxerto pode ser concluído em três semanas. Este método pode responder a questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento, como como os fatores em um tecido podem afetar a sinalização e a função em outro. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando queríamos dissecar as funções específicas do tecido das moléculas do teto na formação do folículo piloso Depois de lavar um camundongo que havia sido sacrificado por asfixia.

Corte cada membro e cauda na base do tronco com uma tesoura estéril. Em seguida, segure o corpo firmemente entre um par de pinças curvas e faça uma incisão ao longo da pele dorsal, da cabeça à cauda, usando um bisturi. Não penetre na fáscia subjacente.

Agora, retire cuidadosamente a pele da linha média do mouse. Segure o mouse exposto firmemente com o lado comprido da pinça curva e insira outro par de pinças curvas sob a pele na extremidade posterior do mouse. Agora retire cuidadosamente a pele completamente do mouse em um movimento suave e descarte a carcaça.

Coloque a pele no primeiro prato de solução de lavagem com a derme voltada para baixo. Espalhe a pele na solução e agite com a pinça. Em seguida, deixe a pele na solução de lavagem enquanto disseca a próxima pele.

Depois de colocar a próxima pele dissecada no primeiro prato de solução de lavagem, transfira a pele anterior para o segundo prato de solução de lavagem. Mantenha as películas na segunda solução de lavagem até que todas as películas sejam coletadas. Após a lavagem final, transfira até cinco peles para um prato contendo solução de disbe fria.

Alise as peles com o lado dermo voltado para baixo e deixe-as flutuar por oito a 16 horas a quatro graus Celsius. Transfira uma pele de baias frias para um novo prato. Achate o lado da derme para baixo.

Segure a epiderme com uma pinça e retire-a lentamente da derme. A epiderme deve descascar inteira, será branca e fina e a derme deve ser acastanhada, mais espessa e gelatinosa. Classifique os dois tecidos em placas de cultura separadas para iniciar o isolamento celular.

Para isolar as células dérmicas, pique a derme em pedaços muito pequenos. Com dois bisturis. Incube o tecido dérmico picado com solução de colagenase recém-feita A 37 graus Celsius por uma hora a cada 10 minutos, agite suavemente a mistura celular quando a digestão estiver completa.

A suspensão deve ser principalmente de células únicas e a solução deve ter mudado de clara para turva. Agora, adicione um volume de 10% de FBS à suspensão celular. Passe-os por uma célula de 70 mícrons, filtre em tubos de 50 mililitros.

Colete até 30 mililitros de fluxo por tubo. Continue com o isolamento das células dérmicas de acordo com o protocolo escrito. Para isolar os queratinócitos, corte cada epiderme em seis a oito pedaços menores.

Incube o tecido fatiado com 0,05% de tripsin EDTA recém-descongelado a 37 graus Celsius por 15 minutos. Continue com o isolamento de queratinócitos de acordo com o protocolo escrito, anestesiar um camundongo nu fêmea de sete a 12 semanas usando cetamina e xilazina ou um método preferido. Certifique-se de aplicar lubrificante para os olhos e colocar o mouse em uma almofada de aquecimento.

Agora desinfete a pele posterior com iodo, seguido de compressas com álcool. Usando uma pinça, aperte a pele na base do pescoço e faça um orifício de um centímetro de diâmetro na pele comprimida. Coloque a câmara no leito da ferida e cubra as bordas da câmara com a pele ao redor.

Prenda a câmara com cerca de seis suturas Ao longo de suas bordas, prenda apenas uma câmara por mouse. Uma vez que a câmara esteja presa, verifique a pasta da célula. Se estiver condensado na parte inferior, ressuspenda-o suavemente com uma ponta de pipeta de um mililitro.

Agora gire suavemente a pasta celular e puxe-a para uma agulha de calibre 23 presa a uma seringa de um mililitro. Perfure cada câmara com a agulha e pingue lentamente as células suspensas de PBS na ferida. Quando os camundongos se recuperarem da anestesia, coloque-os em gaiolas de autoclave limpas com dois camundongos por gaiola.

Certifique-se de administrar antibióticos e Tylenol através da água potável. Após sete a nove dias, anestesiar o rato nu tratado como feito antes. Desinfete a pele ao redor da câmara com iodo e limpe-a com compressas embebidas em álcool.

Corte cuidadosamente os pontos e remova-os da câmara. Remova suavemente a câmara se a nova pele grudar nela. Separe suavemente o enxerto da câmara.

Usando uma pinça, segure o enxerto para baixo. Durante a remoção da câmara, o enxerto deve parecer opaco e opaco. Aplique uma almofada não aderente com uma fina película de antibióticos na ferida aberta e suture-a no lugar usando dois pontos.

Enrole um curativo ao redor do mouse para prender a almofada e proteger a ferida. Suture o curativo no lugar Após três dias, remova os curativos e a almofada. O mouse não precisa ser anestesiado durante esta etapa.

O enxerto deve ser seco e opaco a marrom. Verifique o enxerto periodicamente quanto ao crescimento do cabelo, que deve começar a aparecer 16 dias após o enxerto. Um knockdown dérmico específico do gene suavizado, que é um componente crítico de sinalização sônica do ouriço, foi feito em células dérmicas isoladas.

Essas células foram aplicadas em enxertos de reconstituição capilar usando o protocolo delineado. Após três semanas de crescimento, os enxertos controle positivo com vetor lentiviral isolado apresentaram crescimento robusto do cabelo. No entanto, o knockdown do gene suavizado resultou em uma redução severa no crescimento do cabelo.

Os enxertos de controle negativo, omitindo células dérmicas primárias ou queratinócitos, resultaram em um local da ferida recuperado sem nenhum cabelo. Da mesma forma, a morte celular ou perda celular por um dos tipos de células no enxerto também resultou em nenhum crescimento de cabelo. O vetor lentivírus foi determinado como tendo boa eficiência de infecção antes do experimento com enxerto e também foi projetado para produzir GFP junto com este Smoothened, S-H-R-N-A.

Assim, a visualização da papila dérmica dos folículos pilosos sob óptica fluorescente fez um controle útil para confirmar o per dur da expressão lentiviral Após três semanas, a coloração H e d é usada para descrever o estágio de crescimento dos folículos pilosos no enxerto de controle e seu estágio tardio de desenvolvimento quando a expressão suavizada foi derrubada. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em 14 horas ao longo de três dias, se executada corretamente. Essa técnica pode ser estendida para explorar a relação entre tumor e estroma durante a progressão do câncer no campo da biologia do câncer.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar a função do gene na formação do folículo piloso. Use nosso ensaio de reconstituição rápida do cabelo como uma alternativa aos nocautes genéticos tradicionais.