Isolar células-tronco de tecidos moles músculo-esqueléticas

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco adultas de tecidos moles musculoesqueléticos, como o músculo esquelético. Isso é feito primeiro fazendo uma biópsia do tecido mole, desbridando-o e cortando-o finamente. A segunda etapa do procedimento é digerir enzimaticamente o tecido.

A terceira etapa do procedimento é isolar as células-tronco por meio de etapas repetidas de pré-plaqueamento. A etapa final do procedimento é a identificação das células-tronco isoladas. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostrem os comportamentos morfológicos e celulares das células usando imunofluorescência, microscopia e / ou citometria de fluxo.

Olá, sou Lee do Laboratório de Patologia Molecular do Departamento de Cirurgia Ortopédica da Universidade de Pittsburgh. Hoje vou mostrar como isolar uma célula-tronco adulta dos tecidos moles do sistema esquelético Mus, como o músculo esquelético. Olá, sou o Dr. Johnny Ward.

Sou professor da Escola de Medicina da Universidade de Pittsburgh no Departamento de Cirurgia Ortopédica. Eu tenho trabalhado, você sabe, em estreita colaboração com o Dr. Young Lee e esses procedimentos para isolar, você sabe, diferentes tipos de células-tronco do músculo esquelético e alterar tecidos como o padrão. Usamos os procedimentos em nosso laboratório para isolar células-tronco para estudos de pesquisa basicamente sobre as aplicações da medicina translacional.

Então, vamos estudar. Deixe os tecidos dos quais as células-tronco podem ser isoladas incluem tendões e músculos esqueléticos colhidos da tíbia ou músculos sóleo do membro posterior de camundongos do tipo selvagem. Depois de remover restos de pele e osso, coloque os lenços em um prato contendo HBSS frio suplementado com 5% de FBS.

Em seguida, coloque o tecido separadamente em placas revestidas de colágeno contendo HBSS frio. Usaremos tecidos musculares esqueléticos para demonstrar os procedimentos básicos para dissociação e digestão de tecidos. Use microtesouras e/ou lâminas de bisturi para picar os tecidos esqueléticos em uma digestão enzimática de pH grosseiro dos tecidos.

Comece transferindo as pastas de tecido do MIT para tubos separados de 15 mililitros na centrífuga a aproximadamente 3.500 RPM a quatro graus Celsius por cinco minutos. Remova a lavagem SANE por Resus suspendendo um HBSS e repita a centrifugação. Depois de remover o sobrenada, digerir as pastas adicionando 10 mililitros de pré-aquecimento.0,2%colagenase.

O tipo 11 incuba por 60 minutos a 37 graus Celsius, agitando os tubos manualmente a cada 10 minutos quando a incubação de 60 minutos é concluída. Centrifugue e ressuspenda as pastas em 10 mililitros de solução de espaço DYS. Incube por 45 minutos a 37 graus Celsius, agitando com a mão a cada 10 minutos após a centrífuga de incubação de 45 minutos e ressus, suspenda as pastas em 10 mililitros de 0,2% de viagens em solução HBSS.

Costumamos incubar por 15 a 20 minutos a 37 graus Celsius enquanto invertemos os tubos a cada 10 minutos, a incubação está completa. Quando células individuais suficientes forem liberadas dos tecidos, conforme ilustrado aqui, centrifugue as células resultantes e suspenda novamente o pellet celular em cinco mililitros de proliferação. O PM médio dissocia a suspensão celular passando o extrato por uma série de agulhas duas vezes através de uma agulha de calibre 18, depois uma vez através de uma agulha de calibre 23 e, finalmente, uma vez através de uma agulha de calibre 27.

Por fim, passe o extrato celular por um filtro de células de 70 mícrons para iniciar a técnica prepl. Centrifugue o extrato celular que acabou de ser preparado e ressuspenda os pellets em proliferação. Placa média de cinco mililitros da mistura de células em um frasco T 25 revestido de colágeno e comercialize como PP um incubado a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono por duas horas.

Depois de duas horas. Transferir as células não aderentes para um novo balão T 25 revestido de colagénio e comercializar como PP dois. Adicione cinco mililitros de PM no frasco T 25 anterior rotulado como PP um.

Retorne os dois frascos à incubadora por 24 horas. Após 24 horas, transferir as células não aderentes do PP dois para um novo balão de colágeno T 25 revestido com ENC e marcá-lo como PP três. Adicione cinco mililitros de meio de proliferação no frasco rotulado PP dois.

Retorne os frascos à incubadora. Repita o procedimento a cada 24 horas até a população PP seis. A população de células-tronco é criada.

As seis células PP isoladas são muito poucas em número e precisam ser mantidas em meio de proliferação rico em FBS. Isso mudou diariamente. Embora a maioria das células na cultura de PP seis morra durante as próximas uma a duas semanas de cultivo.

Uma grande população saudável de PP seis geralmente é criada após uma a duas semanas adicionais de expansão. Mantenha todos os outros grupos de células suspensas também, permitindo que proliferem e examinando-as regularmente usando um microscópio invertido. As células aderentes precoces que se ligam aos frascos PP um e PP dois são principalmente células fibróticas.

Células que aderem aos frascos revestidos de colágeno após um período de tempo mais longo dentro de 48 a 96 horas. PP três e PP quatro são principalmente mioblastos. Enquanto as células satélites musculares são frequentemente vistas principalmente no PP cinco, as células prepl posteriores 96 horas ou PP seis posteriores são consideradas células-tronco adultas e parecem pequenas, redondas e translúcidas.

No início de seu isolamento, eles podem ser caracterizados por imuno-histoquímica por sua expressão de marcadores de células-tronco, como células-tronco, antígeno um e CDC 34. Acabamos de mostrar como isolar células-tronco de uma segunda massa do camundongo. Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de manter o esteróide durante todos os procedimentos.

Uma vez que a célula-tronco tenha sido isolada, certifique-se de cultivar essas células em baixa densidade para manter as características das células-tronco das células. Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com sua experiência E desejo-lhe boa sorte para tentar usar isso em seu experimento.

Obrigado.