Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
É necessário ter uma assinatura JoVE para assistir este Faça login ou comece sua avaliação gratuita.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
تؤدي خلية جذعية واحدة لسرطان الثدي إلى مجموعة من الخلايا تسمى الماموسفير الأولي. للحصول عليها، والثقافة الأولى خط خلايا سرطان الثدي حتى 70٪ إلى 80٪ التقاء، لضمان الخلايا هي في مرحلة نموها. إضافة تريبسين-EDTA لفصل الخلايا من قارورة، وإضافة وسيلة مع المصل لوقف عمل تريبسين.
الآن، خذ الخلايا في أنبوب والطرد المركزي للحصول على بيليه الخلية. Resuspend بيليه في المتوسط ماموسفير دون مصل وتمرير التعليق من خلال مرشح غطاء مصفاة الخلية، للحصول على تعليق خلية واحدة. يتكون هذا التعليق من الخلايا الجذعية وخلايا السلف والخلايا المتمايزة التي تظهر تعبيرات بروتينية مختلفة.
CD44 و CD24 هي بروتينات سطح الخلية المميزة للخلايا الجذعية سرطان الثدي. وهي إيجابية للتعبير CD44 وسلبية لCD24. عزل الخلايا من تعليق الخلية باستخدام الفلورسينس أو المغناطيسي فرز الخلايا المنشطة. بعد ذلك ، خذ بقعة زرقاء aliquot وd trypan إلى الخلايا ، واحسب عدد الخلايا القابلة للحياة لكل ملليلتر باستخدام شريحة مقياس الدم للعثور على كثافة البذر.
وأخيرا، بذرة الخلايا في لوحة ستة جيدا منخفضة جدا معتنقة، بحيث تبقى الخلايا معلقة. احتضان لوحة لمدة 5 إلى 10 أيام دون إزعاج لوحة حتى المجالات هي 40 ميكرون في القطر. في البروتوكول التالي، سوف نولد الماموسفير الأولي من خط خلايا سرطان الثدي.
- العمل تحت غطاء محرك السيارة ثقافة معقمة، تبدأ هذا الإجراء مع MCF7 أو MDA-MB-231 الخلايا التي هي 70٪ إلى 80٪ التقاء. يستنشق الوسط من القارورة. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، ثم إضافة تريبسين-EDTA واحتضان لمدة دقيقتين إلى ست دقائق. بعد مفرزة، إخماد بإضافة ماموسفير المتوسطة التي تحتوي على 10٪ FBS.
بمجرد انفصال الخلايا، قم بنقلها إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي 15 ملليلتر وتدور 200 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد هذا الطرد المركزي إزالة الناموست، ثم إعادة إنفاق الخلايا في 1-5 ملليلتر من المتوسط ماموسفير. ماصة صعودا وهبوطا 10 مرات لتفريق بيليه الخلية.
بعد ذلك، نقل تعليق الخلية إلى 40 ميكرون خلية إجهاد غطاء مرشح وجمع تدفق من خلال في أنبوب المرفقة للحصول على تعليق خلية واحدة. Pipette a 20 ميكرولتر aliquot من الخلايا التي أعيد إنفاقها على مقياس الدم واستخدام المجهر لفحصه. إذا لوحظت مجموعات الخلايا كما رأينا هنا، فاستخدم حقنة لتمرير التعليق داخل وخارج إبرة قياس 25 مرة أو مرتين.
مرة واحدة وقد تم تفريق الخلايا في تعليق خلية واحدة كما هو مبين هنا، والمضي قدما لعزل CD44 إيجابية، CD24 المجموعات الفرعية الخلوية السلبية عن طريق فرز الخلايا المنشطة مضان أو المغناطيسي فرز الخلايا المنشطة باستخدام LS-العمود لتحديد إيجابي الخلايا الإيجابية CD44. منذ الخلايا المطلوبة نعلق على جدران العمود LS، تجاهل flowthrough، ثم إزالة الخلايا من العمود، وتطبيق خمسة ملليلتر من العازلة وتطبيق والاكتئاب المكبس الموردة مع العمود لطرد الخلايا المطلوبة.
بعد ذلك، استخدم عمود LD لزيادة تنقية السكان عن طريق التحديد السلبي. هنا، إرفاق الخلايا الإيجابية CD24 إلى الأعمدة LD. جمع flowthrough الذي يحتوي على الخلايا السلبية CD24. بعد ذلك ، باستخدام قياس التدفق الخلوي يؤكد الأنماط الظاهرية لجميع الخلايا المعزولة. باستخدام طريقة استبعاد الأزرق تريبان، حساب كثافة الخلايا قابلة للحياة.
بعد تمييع تعليق الخلية بشكل مناسب ، قم بزرع كل بئر من لوحة مرفق فائقة التوهج بستة بشكل جيد مع 500 إلى 4000 خلية لكل سنتيمتر مربع في 2 ملليلتر من متوسط الماموسفير الكامل. احتضان لوحات مع الحرص على عدم إزعاج لهم لمدة 5 إلى 10 أيام حتى يتم رصد المجالات. مواصلة زراعة حتى كانت المجالات ما لا يقل عن 40 ميكرون في القطر ولكن لم تبدأ بعد لتحويل apoptotic.
