Generierung von primärer Mammosphären: Eine Technik zur Bestimmung der Zellpotenz

Eine einzelne Brustkrebs-Stammzelle führt zu einem Cluster von Zellen, die als primäre Mammosphäre bezeichnet werden. Um sie zu erhalten, zuerst Kultur eine Brustkrebs-Zelllinie bis 70% bis 80% konfluent, um sicherzustellen, dass die Zellen in ihrer Wachstumsphase sind. Fügen Sie Tripsin-EDTA hinzu, um Zellen vom Kolben zu lösen, und fügen Sie ein Medium mit Serum hinzu, um die Aktion von Tripsin zu stoppen.

Nehmen Sie nun die Zellen in einem Rohr und Zentrifuge, um das Zellpellet zu erhalten. Setzen Sie das Pellet im Mammosphärenmedium ohne Serum aus und leiten Sie die Suspension durch einen Zellsiebkappenfilter, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Diese Suspension besteht aus Stammzellen, Vorläuferzellen und differenzierten Zellen, die unterschiedliche Proteinausdrücke zeigen.

CD44 und CD24 sind Zelloberflächenproteine, die für Brustkrebsstammzellen charakteristisch sind. Sie sind positiv für CD44-Ausdruck und negativ für CD24. Isolieren Sie Zellen aus der Zellsuspension mit Fluoreszenz oder magnetisch aktivierter Zellsortierung. Als nächstes nehmen Sie einen aliquot und ad trypan blauen Fleck zu den Zellen, und berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro Milliliter mit einem Hämozytometer-Dia, um die Sädichte zu finden.

Schließlich säen Sie die Zellen in einer sechs gut ultra niedrigen haftenden Platte, so dass die Zellen suspendiert bleiben. Inkubieren Sie die Platte für 5 bis 10 Tage, ohne die Platte zu stören, bis Kugeln einen Durchmesser von 40 Mikrometern haben. Im folgenden Protokoll werden wir primäre Mammosphären aus einer Brustkrebs-Zelllinie erzeugen.

- Arbeiten unter einer sterilen Kulturhaube, beginnen Sie dieses Verfahren mit MCF7 oder MDA-MB-231 Zellen, die 70% bis 80% konfluent sind. Aspirieren Sie das Medium aus dem Kolben. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, fügen Sie dann Tripsin-EDTA hinzu und brüten Sie für zwei bis sechs Minuten. Nach der Ablösung durch Zugabe von Mammosphärenmedium mit 10% FBS ablöschen.

Sobald sich die Zellen gelöst haben, übertragen Sie sie in ein 15 Milliliter konisches Zentrifugenrohr und drehen Sie es 200 mal g bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Nach dieser Zentrifugation dekantden sie den Überstand und resuspendierten die Zellen in ein bis fünf Milliliter Mammosphärenmedium. Pipette 10 Mal auf und ab, um das Zellpellet aufzubrechen.

Übertragen Sie als Nächstes die Zellsuspension in einen 40-Mikron-Zell-Belastungskappenfilter und sammeln Sie den Durchfluss im angeschlossenen Rohr, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Pipette ein 20 Mikroliter Aliquot der resuspendierten Zellen auf ein Hämozytometer und verwenden Sie ein Mikroskop, um es zu untersuchen. Wenn Zellcluster wie hier beobachtet werden, verwenden Sie eine Spritze, um die Suspension ein- oder zweimal in eine 25-Spur-Nadel ein- und auszutragen.

Sobald die Zellen in eine einzelne Zellsuspension dispergiert wurden, wie hier gezeigt, gehen Sie fort, CD44-positive, CD24-negative Zellteilmengen über Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung oder magnetisch aktivierte Zellsortierung mit LS-Spalte zu isolieren, um die CD44-positiven Zellen positiv auszuwählen. Da die gewünschten Zellen an die Wände der LS-Säule anheften, verwerfen Sie den Durchfluss, entfernen Sie dann Zellen aus der Spalte, wenden Sie fünf Milliliter Puffer an und wenden und drücken Sie den mit der Spalte gelieferten Kolben, um die gewünschten Zellen auszuspülen.

Verwenden Sie als Nächstes eine LD-Spalte, um die Grundgesamtheit durch negative Auswahl weiter zu reinigen. Hier werden die CD24-Positivenzellen an die LD-Spalten angebunden. Sammeln Sie den Flowthrough, der die negativen CD24-Zellen enthält. Als Nächstes bestätigen die Phänotypen aller isolierten Zellen mit der Durchflusszytometrie. Berechnen Sie mit der Trypan-Blau-Ausschlussmethode die Dichte lebensfähiger Zellen.

Nach entsprechender Verdünnung der Zellsuspension säen Sie jeden Brunnen einer sechs gut ultraniedrigen Aufsatzplatte mit 500 bis 4.000 Zellen pro Zentimeter Quadrat in 2 Millilitern kompletten Mammosphärenmedium. Inkubieren Sie die Platten, die darauf achten, sie nicht für 5 bis 10 Tage zu stören, bis Kugeln beobachtet werden. Fahren Sie weiter, bis die Kugeln mindestens 40 Mikrometer im Durchmesser hatten, aber noch nicht begonnen haben, apoptotisch zu werden.