原発性のmmmospheresの生成:細胞の効力を決定する技術

単一の乳癌幹細胞は、原発性乳房圏と呼ばれる細胞のクラスターを生み出す。それらを得るために、最初の培養は、乳癌細胞株を70%〜80%コンフルエントまで、細胞がそれらの増殖期にあることを保証する。Flaskから細胞を取り外すためにTripsin-EDTAを追加し、トリップシンの作用を停止するために血清で媒体を追加します。

さて、細胞ペレットを得るためにチューブと遠心分離機の中の細胞を取ります。血清を含まないmmosphere培地中のペレットを再懸濁し、細胞ストレーナーキャップフィルターを通して懸濁液を通過させ、単一の細胞懸濁液を得る。この懸濁液は、幹細胞、前駆細胞、および異なるタンパク質表現を示す分化細胞からなる。

CD44およびCD24は、乳癌幹細胞に特徴的な細胞表面タンパク質である。これらは、CD44 表現では正、CD24 では負の値です。蛍光または磁気活性化細胞選別を使用して細胞懸濁液から細胞を分離する。次に、 アリコート とアドトリパンブルー染色を細胞に取り、ヘモサイトメータースライドを用いてミリリットル当たりの生存細胞数を計算し、播種密度を求める。

最後に、細胞が懸濁されたままになるように、6つのウェル超低接着プレートに細胞を播種します。球体が直径40ミクロンになるまで、プレートを邪魔することなく5〜10日間インキュベートします。次のプロトコルでは、乳がん細胞株から原発性の乳房圏を生成する。

- 無菌培養フードの下で作業し、MCF7またはMDA-MB-231細胞で70%〜80%コンフルエントであるこの手順を開始します。フラスコから培地を吸引する。PBSで細胞を2回洗い、その後、Tripsin-EDTAを追加し、2〜6分間インキュベートします。剥離後、10%FBSを含有するmmosphere培地を添加して急減する。

細胞が切り離されたら、15ミリリットルの円錐型遠心分離管に移し、室温で5分間200g回転させます。この遠心分離に続いて上清をデカントし、次いで細胞を1〜5ミリリットルのmmosphere培地に再懸濁させた。ピペットは10回上下して細胞ペレットを分解する。

次に、細胞懸濁液を40ミクロンの細胞ストレインキャップフィルターに移し、付属チューブ内を通る流れを集めて、単一の細胞懸濁液を得る。再懸濁細胞の20マイクロリットル のアリコート をヘモサイトメーターにピペットし、顕微鏡を用いて検査する。細胞クラスターがここで見られるように観察される場合は、注射器を使用して25ゲージ針の中または外に1〜2回懸濁液を渡します。

細胞がここに示すように単一の細胞懸濁液に分散されたら、CD44陽性、CD24陰性細胞サブセットを、LSカラムを用いて蛍光活性化細胞選別または磁気活性化細胞選別を介してCD44陽性細胞を分離し、CD44陽性細胞を正に選択する。目的のセルがLSカラムの壁に付着するので、フロースルーを破棄し、カラムからセルを取り除き、5ミリリットルのバッファを適用し、カラムに付属のプランジャーを適用して押し込んで、目的のセルを洗い流します。

次に、LD列を使用して、負の選択によって母集団をさらに浄化します。ここでは、CD24陽性細胞がLDカラムに付着している。CD24陰性セルを含むフロースルーを収集します。次に、フローサイトメトリーを用いて、全ての単離細胞のフェノタイプを確認する。トリパンブルーの除外法を使用して、生存可能な細胞の密度を計算します。

細胞懸濁液を適切に希釈した後、完全なmmosphere培地の2ミリリットルで500〜4,000セルセンチメートル平方メートルの6つのウェル超低添付着プレートの各ウェルを播種する。球が観察されるまで5〜10日間、それらを邪魔しないように注意してプレートをインキュベートします。球体の直径が40ミクロン以上になるまで培養を続けるが、まだアポトーシスに変わり始めていない。