Geração de células dendríticas derivadas da medula óssea: um método para gerar células dendríticas a partir da medula óssea de camundongos

- As células dendríticas ou DCs são células-chave apresentadoras de antígenos que ativam as células T. Em pacientes leucêmicos, essas células expressam mal o antígeno associado ao tumor e não conseguem provocar uma resposta imune específica do antígeno. As células dendríticas são abundantes na medula óssea. E, portanto, a medula óssea é o local preferido para seu isolamento para ajudar a estudar seu papel no câncer.

Para obter células dendríticas, extraia a medula óssea do fêmur ou tíbia de um camundongo sacrificado usando uma seringa cheia de mídia para lavá-la. Centrifugue e ressuspenda o pellet em tampão de cloreto de amônio-potássio ou ACK para lisar os eritrócitos. Agora adicione meios de cultura para interromper a lise e centrifugar. Ressuspenda o pellet no meio de cultura que contém um antibiótico. Adicione o fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos ou GM-CSF e transfira a suspensão celular para uma placa de Petri.

Incube a placa pelo tempo desejado. O GM-CSF ajuda as células progenitoras a se diferenciarem em células dendríticas. Finalmente, ative as células com lipopolissacarídeos ou LPS, que se liga ao receptor de superfície das células dendríticas, resultando em células dendríticas da medula óssea totalmente maduras e imunogênicas. Neste protocolo, demonstraremos a geração de células dendríticas a partir da medula óssea de camundongos.

- Para gerar células dendríticas derivadas da medula óssea, isole a medula óssea dos fêmures de camundongos selvagens ou nocautes para o fator B, conforme demonstrado, e lise os glóbulos vermelhos em 5 mililitros de tampão de lise ACK, interrompendo a reação com 10 mililitros de RPMI, suplementado com 1% de FBS após cinco minutos.

Depois de coletar as células sanguíneas totais por centrifugação, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de cultura para uma concentração de 2 vezes 10 a 6 células por mililitro e adicione 20 nanogramas por mililitro de GM-CSF às células, antes de semear 10 mililitros de células em placas de Petri individuais de 100 por 15 milímetros a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por seis dias. No sexto dia, ative as culturas de células dendríticas derivadas da medula óssea com 25 microgramas por mililitro de LPS por placa.