Geração de um grande número de progenitores mieloides e células dendríticas precursores de murino medula óssea usando um celular romance classificação estratégia

Esse método pode permitir que os pesquisadores adquiram um número suficiente de tipos de células para responder a perguntas-chave no campo da imunologia do desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é que ela depende de alguns marcadores selecionados para isolar um grande número de células que são tradicionalmente encontradas em números baixos ex vivo. A implicação desta técnica estende-se ao transplante terapêutico de medula óssea, pois permite o isolamento de um grande número de progenitores.

Para iniciar o protocolo, sature as patas traseiras e o tronco de um camundongo previamente preparado com 75% de etanol e faça cortes superficiais na pele ao redor da articulação do quadril com uma tesoura de tecido curva. Em seguida, remova e retire as patas traseiras. Usando uma pinça, puxe firmemente a pele do quadril para baixo em direção ao tornozelo, revelando o músculo, e use uma tesoura para remover o retalho de pele.

Corte logo acima do fêmur e da articulação do quadril e remova toda a perna traseira cortando o osso. Trabalhando em um gabinete de biossegurança estéril, transfira as pernas para uma das placas de Petri previamente preparadas. Use uma tesoura para cortar logo abaixo do tornozelo e remova cuidadosamente o máximo possível do músculo e do tecido conjuntivo elástico.

Transfira o osso limpo para a segunda placa de Petri preparada. Em seguida, separe o fêmur, o joelho e a tíbia. Usando uma pinça, segure a perna no joelho e localize a medula, uma linha vermelha fraca dentro da cavidade óssea na parte superior do fêmur e em direção ao final da tíbia.

Com uma tesoura, corte a tíbia logo acima de onde a medula parece terminar. Corte logo abaixo da articulação do joelho, corte logo acima da articulação do joelho. Em seguida, lave a medula óssea do fêmur e da tíbia.

Encha uma seringa de 10 mililitros com meio completo do tubo cônico de 50 mililitros e tampe a seringa com uma agulha de calibre 23. Segurando o osso com uma pinça acima da terceira placa de Petri preparada, insira a agulha no canal ósseo e empurre o meio, lavando as células. Repita esta etapa até que não haja mais cor

Continue o procedimento esmagando a epífise. Ainda na segunda placa de Petri, segure a rótula firmemente com uma pinça e amasse os joelhos com a ponta da seringa. Continue até que a epífise não esteja mais vermelha.

Usando a seringa, transfira as células da segunda e terceira placas de Petri para o tubo de 50 mililitros. Quebre os aglomerados pipetando suavemente para cima e para baixo e tente evitar a formação de bolhas. Centrifugue as células.

Em seguida, remova o sobrenadante com a pipeta sorológica, desaloje o pellet sacudindo e lise os glóbulos vermelhos incubando-os em um mililitro de cloreto de amônio potássio ou tampão de lise ACK, por um minuto em temperatura ambiente. Usando uma pipeta sorológica, adicione 40 mililitros de tampão HBSS. Usando uma pipeta sorológica, filtre as células através de um filtro de células de 70 micrômetros em um novo tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue as células.

Usando uma pipeta sorológica, remova o sobrenadante e cultive as células da medula óssea em meio completo com 10 nanogramas por mililitro de GM-CSF de camundongo recombinante a uma densidade de um vezes 10 elevado a 6 células por mililitro. Usando uma pipeta sorológica, transfira as células para placas de cultura de tecidos e incube-as a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono, até que estejam prontas para prosseguir com a coloração. Suavemente, mas completamente, pipete as células para cima e para baixo para desalojar as células frouxamente aderentes.

Usando uma pipeta sorológica, transfira as células para um tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue as células. Despeje suavemente o sobrenadante e lave as células peletizadas adicionando 30 mililitros de tampão de lavagem FACS, ou SFWB, com a pipeta sorológica. Em seguida, centrifugue as células e repita a lavagem.

Em seguida, suspenda e core as células de acordo com as instruções do fabricante do anticorpo. Ressuspenda cinco vezes 10 elevado à 7ª célula em um mililitro de FWB e adicione dois microgramas de anti Ly-6C e anti CD115, marcados com fluoróforos. Para distinguir ainda mais o CMP do MODC, adicione dois microgramas de anticorpos anti-CD11C.

Incubar as amostras durante 30 minutos no gelo. Após a incubação, use uma pipeta sorológica para adicionar 10 mililitros de FWB e centrifugue as células. Despeje suavemente o sobrenadante e lave as células peletizadas adicionando 30 mililitros de FWB com uma pipeta sorológica.

Centrifugue as células e repita a lavagem. Antes de suspender as células, agite o tubo completamente para desalojar o pellet. Use uma pipeta sorológica para ressuspender as células de uma vez 10 a 7 células por mililitro de FWB e filtre-as através de um filtro de células de 35 micrômetros.

Use uma pipeta sorológica para transferir as células filtradas para um tubo de polipropileno e coloque o tubo no gelo até que estejam prontas para serem classificadas. Execute o controle não corado através do classificador de células e aplique uma porta para excluir pequenos detritos e partículas altamente granulares. Passe as amostras de controle fluorescentes individuais pelo classificador de células e ajuste a compensação conforme necessário.

Execute uma amostra da amostra multi-rotulada e observe quatro populações distintas. Aplique um portão para isolar cada uma das quatro populações principais. Prepare os tubos de coleta adicionando soro fetal de bezerro, ou FCS, suficiente para atingir pelo menos 20% de concentração final quando estiver cheio.

Por exemplo, se estiver usando tubos de cinco mililitros, adicione um mililitro de FCS antes de classificar e remova o tubo quando atingir o volume total de cinco mililitros. Para evitar a renovação da membrana e a absorção de anticorpos, mantenha todas as amostras a quatro graus Celsius durante toda a classificação. Após a coleta do número desejado de células, use uma pipeta sorológica para transferir as células para um novo tubo cônico e centrifugue as células.

Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mililitros de FWB e centrifugue as células novamente. Repita a suspensão FWB para um total de duas lavagens. Por fim, remova o sobrenadante após a segunda lavagem e prossiga com base no projeto do experimento.

Para manter o maior número possível de canais disponíveis para análise, células viáveis foram selecionadas rotineiramente, com base na dispersão direta e lateral, excluindo eventos muito pequenos e muito granulares. Para determinar se essa estratégia de gating excluía de forma confiável as células mortas, as amostras foram coradas com 7-aminoactinomicina D. As células analisadas imediatamente após a colheita tinham aproximadamente 10% das células positivas para 7-AAD, quando um FSC típico, SSC gate foi aplicado a células recém-isoladas da medula óssea. Uma proporção semelhante de células mortas também estava presente na estadia 1 e na estadia 3 da cultura.

No quinto dia, o número de células mortas dentro do portão foi reduzido para 5%, portanto, o uso de tal portão de viabilidade é geralmente apropriado para a classificação no quinto dia e depois. A citometria de fluxo revelou que dentro da população Ly6C negativa, CD115, as células CD3, CD45R positivas persistiram fortemente do dia zero ao três. No quarto dia, apenas algumas células CD3, CD45R positivas permaneceram e, no quinto e sexto dias, não havia células CD3, CD45R expressando presentes; assim, dentro de quatro dias de cultivo em GM-CSF, as células positivas da linhagem estavam essencialmente ausentes e não foram detectadas nos dias cinco e seis de cultivo.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a composição celular depende da duração da cultura. A classificação três dias após a colheita produz um grande número de estágios iniciais e poucos estágios tardios, e vice-versa para culturas classificadas após cinco dias.