Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.

Este método foi projetado para ajudar os cientistas a isolar DCs derivadas de monócitos do sangue e tumores de camundongos portadores de tumores, a fim de estudar suas propriedades imunoestimulantes. Acho que a principal vantagem desse procedimento em relação a outros métodos é que as DCs derivadas de monócitos obtidas refletem melhor seu estado de ativação no tumor e no sangue. O mais difícil é provavelmente garantir que todos os seus reagentes e ferramentas sejam estéreis e que você não introduza contaminação durante este procedimento.

Eu tenho isolado células mieloides e células dendríticas de tumores há mais de 15 anos, e tive a ideia desse método quando percebi que diferentes protocolos de isolamento resultavam em diferentes padrões de ativação celular. Demonstrando o procedimento estará a Sra. Santana-Magal, que é estudante de pós-graduação em meu laboratório.

Após a eutanásia dos camundongos usando dióxido de carbono dentro de uma capela de fluxo laminar, extraia os tumores e coloque-os em meio RPMI sem soro fetal bovino. Em seguida, use uma tesoura cirúrgica para cortar o tumor em pequenos pedaços. Transfira todos os pedaços do tumor de um único camundongo para um tubo de fundo plano de 30 mililitros contendo tampão HBSS suplementado com colagenase IV e DNase I junto com as barras de agitação magnéticas.

Incube o tubo com os pedaços do tumor em um agitador a 37 graus Celsius com um agitador magnético dentro a 200 a 400 rotações por minuto por 20 a 30 minutos. Em seguida, filtre as células através de um filtro de células de 70 micrômetros. Em seguida, centrifugue as células a 400 vezes g por cinco a 10 minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, adicione 1,5 mililitros de solução de estoque de meio de gradiente de densidade a 8,5 mililitros de HBSS. Em seguida, misture vigorosamente o gradiente de densidade médio. Em seguida, pipete a mistura para o pellet.

Centrifugar a suspensão da célula a 400 vezes g durante 20 minutos à temperatura ambiente. Decantar o sobrenadante após o término da centrifugação. Depois de lavar as células peletizadas duas vezes, ressuspenda em um mililitro de tampão de isolamento.

Adicione a suspensão celular a 30 microlitros de esferas magnéticas conjugadas CD11b. Em seguida, incube a mistura a quatro graus Celsius por 15 minutos. Após centrifugação, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento num mililitro de tampão de isolamento.

Aplique a suspensão celular em uma coluna magnética pré-lavada. Em seguida, use três mililitros de tampão de isolamento para lavar a coluna duas vezes. Em seguida, remova a coluna do ímã.

Em seguida, adicione seis mililitros de tampão de isolamento na coluna. Empurre com um êmbolo para lavar as células marcadas magneticamente em um tubo de coleta estéril. Mais uma vez, centrifugue as células a 400 vezes g por cinco a 10 minutos a quatro graus Celsius.

Depois de ressuspender e colorir as células, classifique-as bloqueando as células pequenas, usando o lado pequeno e a dispersão frontal pequena. Depois de sacrificar o rato, borrife 70% de etanol nele. Em seguida, use uma tesoura cirúrgica para remover a pele que cobre o coração sob o capuz laminar.

Em seguida, limpe a tesoura com etanol. Lave a cavidade com EDTA HBSS 20 milimolares e use a tesoura para cortar o átrio direito do coração. Em seguida, use uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de calibre 25 para lavar lentamente o ventrículo direito do coração com EDTA HBSS 20 milimolares.

Em seguida, use uma seringa estéril para tirar sangue da cavidade pleural. Transfira o sangue em um tubo contendo sulfato de heparano e EDTA. Em seguida, pipete o sangue no meio de gradiente de densidade.

Centrifugue as células sanguíneas a 400 vezes g por 15 minutos em temperatura ambiente com freio baixo. Após a centrifugação, recolher as células mononucleares num tubo. Dissolva as células em 10 mililitros de tampão de isolamento para lavar as células.

Novamente, centrifugue as células a 400 vezes g por cinco a 10 minutos a quatro graus Celsius. Para selecionar as células CD11b, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de isolamento. Incube por 15 minutos com 50 microlitros de esferas magnéticas conjugadas CD11b a quatro graus Celsius.

Centrifugue novamente a 400 vezes g por cinco a 10 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, remova o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de isolamento.

Em seguida, aplique a suspensão celular em uma coluna magnética pré-lavada. Lave a coluna com tampão de isolamento duas vezes. Remova a coluna do ímã e adicione seis mililitros de tampão de isolamento na coluna.

Em seguida, lave as células marcadas magneticamente em um tubo de coleta estéril empurrando o êmbolo. Centrifugue as células a 400 vezes g por cinco a 10 minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda as células em tampão de isolamento e cove com anticorpos conjugados com fluoróforo.

Classifique as células bloqueando as células pequenas usando o lado pequeno e a dispersão frontal pequena. Primeiro, fixe as células em paraformaldeído tamponado a 1,8% por 10 minutos em temperatura ambiente. Semeie a suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços em forma de U.

Em seguida, adicione diluições variadas de anticorpos de ligação ao tumor em cada poço. Depois disso, incube as células no gelo por 15 a 20 minutos. Após a incubação, lave as células com 150 microlitros de solução salina tamponada com fosfato.

Em seguida, centrifugue a 400 vezes g por cinco a 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, expulsar o sobrenadante e lavar as células duas vezes. Dissolva as células em 100 microlitros de tampão FACS contendo anticorpo secundário conjugado com fluoróforo.

Em seguida, incube o prato no gelo por 15 a 20 minutos. Após 15 a 20 minutos, adicione 200 microlitros de tampão FACS para lavar as células. Centrifugue a placa a 400 vezes g durante cinco a 10 minutos.

Decantar o sobrenadante. Realize citometria de fluxo para analisar a ligação do tumor e determinar a concentração mínima de imunoglobulina G necessária para revestir as células. Uma vez que as células estejam revestidas com concentração mínima de imunoglobulina G, adicione o complexo imune tumoral marcado com CFSE às células dendríticas derivadas de monócitos em uma proporção de um para cinco.

Em seguida, incube a mistura por 12 a 16 horas durante a noite em meio completo. Realize a análise FACS da ativação de células dendríticas derivadas de monócitos. A intensidade média de fluorescência é calculada após a análise de citometria de fluxo para estudar a presença de anticorpos IgG e M que se ligam às células tumorais LMP ex vivo.

Os resultados mostram que os anticorpos IgG de camundongos alogênicos C57-Black / 6 se ligam às células tumorais com muito mais força do que os anticorpos dos camundongos singênicos 129S1. Em seguida, calcula-se a intensidade média de fluorescência da capacidade de ligação das células tumorais B16F10 com o IgG. IgG obtido de camundongos alogênicos 129S1 mostra intensidade de coloração 10 vezes maior com tumor B16F10 em comparação com IgG singênico de camundongos C57-Black / 6.

Em seguida, imagens microscópicas DIC são capturadas para mostrar as células dendríticas derivadas de monócitos associadas ao tumor dos tumores B16F10. Aqui, as imagens DIC são capturadas para mostrar as células dendríticas inflamatórias e derivadas de monócitos de patrulhamento isoladas do sangue de camundongos portadores de tumor B16F10. A análise por citometria de fluxo também é feita para comparar os padrões de ativação de células dendríticas derivadas de monócitos do baço e da medula óssea com os do tumor e do sangue na incubação com o complexo imune.

O resultado mostra aumento da expressão de CD86 e MHC II pela medula óssea e células dendríticas esplênicas com os complexos imunes. Em seguida, é feita a imuno-histoquímica confocal, que mostra a captação do tumor e a expressão do MHC II quando as células dendríticas são incubadas com o complexo imune tumoral marcado com CFSE. Uma vez dominado, este procedimento pode ser feito em poucas horas, dependendo do número de mouses que você está usando.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todos os seus reagentes e ferramentas estéreis o tempo todo. A pele de rato é uma importante fonte de contaminação. Certifique-se de que nenhum dos pelos esteja tocando seus tecidos.

Esperamos que, depois de assistir a este vídeo, você tenha uma boa compreensão de como isolar DCs derivadas de monócitos de sangue e tumores de camundongos e como ativá-las posteriormente com células imunocomplexas, evitando sua ativação prematura.