Isolamento de queratinócitos da pele humana: um método para cultivar queratinócitos primários de amostras de pele

- Os queratinócitos são as células mais proeminentes presentes na epiderme ou na camada mais externa da pele. Eles se organizam em várias camadas sobre a derme, associados a vários outros tipos de células, como melanócitos, células dendríticas e células de Merkel.

Para isolar os queratinócitos, comece retirando o tecido epidérmico da pele humana. Em seguida, trate com um tampão de digestão enzimática. As enzimas no tampão degradam as proteínas da matriz extracelular presentes no tecido epidérmico, iniciando assim a dissociação celular. Agora, adicione um meio adequado e interrompa mecanicamente o tecido.

Para liberar as células dissociadas em suspensão, filtre a suspensão de células epidérmicas através de uma peneira para remover quaisquer aglomerados ou detritos celulares. Centrifugue para peletizar as células epidérmicas e separá-las do sobrenadante contendo enzimas. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células usando um meio de crescimento de queratinócitos preferido. Cultive as células pela duração desejada.

Durante a cultura, os meios otimizados enriquecem a expansão dos queratinócitos, promovendo seu crescimento seletivo sobre os outros tipos de células epidérmicas. No protocolo a seguir, mostraremos o isolamento de queratinócitos do tecido da pele humana adulta.

- Colete amostras de pele de 10 centímetros por 15 centímetros de voluntários adultos saudáveis submetidos a cirurgia plástica. Mantenha a pele fresca transportando as amostras de pele em uma caixa de isopor contendo um elemento de resfriamento. Se necessário, armazene a amostra de pele a 4 graus Celsius durante a noite. Usando tesouras, bisturis e pinças esterilizadas, remova a gordura de baixo da seção da pele.

Em seguida, usando agulhas, prenda a seção de pele em uma capa estéril em cima de um prato. Com uma gaze seca e esterilizada, limpe a pele. Em seguida, siga com etanol a 70% em uma gaze esterilizada. Em seguida, usando uma plaina de pé, corte a camada epidérmica superior da seção da pele e transfira-a para uma placa de Petri de 9 centímetros.

Em seguida, adicione imediatamente 25 mililitros da solução de DPBS/tripsina/glicose previamente preparada à placa de Petri. Incube as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos. Usando uma pipeta, remova a solução de DPBS/tripsina/glicose da placa de Petri e adicione 10 mililitros de RPMI-1640 mais 2% de FBS para inativar a tripsina.

Agora, com duas pinças, libere as células epidérmicas no meio raspando e agitando suavemente o compartimento epidérmico e dérmico das seções da pele. Filtrar a suspensão de células epidérmicas através de um filtro metálico e recolher o filtrado para um tubo de 50 mililitros. Adicione as seções de pele restantes a um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de RPMI-1640 sem FBS e vórtice por 10 segundos.

Filtrar esta suspensão através do filtro metálico para um tubo de 50 mililitros contendo a suspensão de células epidérmicas. Em seguida, adicione DPBS a um volume total de 50 mililitros. Centrifugue a suspensão da célula a 450 x g à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e, dependendo do tamanho do pellet celular, ressuspenda o pellet de células epidérmicas em aproximadamente 10 mililitros de 37 graus Celsius KSFM.

Usando o método de coloração Trypan Blue, conte as células ao microscópio. Em seguida, para cada frasco de cultura de 75 centímetros quadrados, transfira 8 vezes 10 para as sextas células junto com 12 mililitros de 37 graus Celsius KSFM. Agitar suavemente os frascos de cultura para assegurar uma distribuição uniforme das células. Incubar os queratinócitos em uma incubadora a 37 graus Celsius com 100% de umidade e 5% de CO₂. Troque o meio após dois dias e, em seguida, 3 vezes por semana.