Name: Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-28T17:33:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda a quantificar focos de γH2AX em tecidos de camundongo por imunofluorescência para avaliar danos ao DNA. Este método permite detectar quebras de fita dupla em modelos de doenças e estudar respostas à radiação.

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O apoio do Instituto Australiano de Ciência Nuclear e Engenharia é reconhecido. TCK foi o ganhador de prêmios AINSE. Lab Medicine epigenômico é suportado pelo National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). LM é apoiada por Melbourne Research (University of Melbourne) e Biomedical Imaging bolsas complementares CRC. O apoio de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody e ISKA Carmichael) foi inestimável para este trabalho. MMT é grato pela assistência especializada e conselhos do Dr. Olga Sedelnikova do National Institutes of Health.

Tecidos <ol><li> Tecido pulmonar, embutidos em moldes de temperatura de corte ideal (OCT) composto de 4583, foi seccionado (5 mm) usando uma Leica CM 1950 criostato e montados em poli-L-lisina slides. </li></ol> As amostras congeladas foram obtidos a partir Dr Simon Royce Research the Children Murdoch Institute. Tecido pulmonar foi obtido a partir Balb não tratada / c camundongos e de um modelo do rato de doenças crônicas das vias aéreas alérgicas que mostra muitas das características patológicas da asma humana 6. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Instituto da Criança Murdoch Research que adere ao Código de Práticas para Australian o cuidado e uso de animais de laboratório para fins científicos. <ol start="2"><li> Secções foram secas ao ar em temperatura ambiente por 1 hora. </li></ol> Imunofluorescência <ol><li> Secções foram fixadas com 2% (w / v) paraformaldeído em tampão fosfato salino (PBS) por 20 minutos. </li><li> Seções foram equilibradas com duas lavagens em PBS por 15 minutos cada. </li><li> Cortes foram tratados com etanol 70% (refrigerados a -20 ° C) por 20 minutos, seguida de três lavagens em PBS por 10 minutos cada. </li></ol> Neste ponto slides podem ser armazenadas em recipientes fechados, a 4 ° C por até duas semanas. <ol start="4"><li> Cortes foram lavados três vezes com PBS por 10 minutos cada e, em seguida, bloqueadas com 100μL preparada em PBS contendo BSA 8% em PBS contendo 0,5% Tween-20 e 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) por 1 hora em temperatura ambiente . Todas as incubações foram realizadas em um cocho de coloração umidificado. </li><li> Cortes foram lavados com PBS-TT por 5 minutos e um perímetro hidrofóbico foi marcado em todo o tecido com uma caneta Pap. </li><li> Tampão em excesso foi derrubado fora e 100μl do ensino primário de coelho anti-anticorpo policlonal γH2AX (diluído 1:500 em BSA 1% em PBS, Millipore), foi adicionado a cada seção para incubação de duas horas à temperatura ambiente. Incubação com anticorpo primário pode ser realizada durante a noite a 4 ° C. Para mais provas, que representam focos γH2AX LAP, um anticorpo primário que reconhece uma proteína de reparo DSB também pode ser usado. Por exemplo, co-localização de γH2AX e fosfo-ATM é uma combinação comumente usados. </li><li> Cortes foram lavados duas vezes em PBS-TT por 5 minutos cada e incubadas com 100μl de anticorpo secundário (Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho diluído 1:500 em BSA 1%; Invitrogen) por 1 hora à temperatura ambiente no escuro . (Anticorpo diluído foi mantido no escuro durante todo o procedimento). </li><li> Cortes foram lavados três vezes com PBS-TT por 5 minutos cada e incubadas com 0,5 mg de RNAse A por 30 minutos a 37 ° C. </li><li> Nuclear contracoloração e montagem foi realizada com Vectashield meio contendo iodeto de propídio. </li><li> As lâminas foram seladas com unha polonês e armazenados durante a noite a 4 ° C no escuro antes da análise. </li></ol> Microscopia / Análise <ol><li> A Zeiss Microscópio Confocal Meta LSM510 foi usado para aquisição de imagens utilizando a GFP padrão (para γH2AX - Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho) e PI (543 nm) lasers. </li></ol> Imagens foram adquiridas em um padrão Z-série com um tamanho de passo de 0,5 micron. Durante a análise, planos individuais foram deconvoluídos e empilhados para produzir uma imagem máxima projetada para minimizar a sobreposição de focos. O método de criação de uma imagem projetada no máximo antes de uma contagem de partículas só deve ser utilizado em circunstâncias em que uma seção fina (por exemplo, 5m) é usado e onde a coloração de fundo é insignificante. Onde as seções mais grossas com um fundo significativos devem ser analisados, uma análise mais complexa, como Contador de objetos 3D, como descrito por Bolte e Cordelières (2006) deve ser usado 7. <ol start="2"><li> Metamorph (dispositivos Molecular, EUA) foi usado para criar mescladas (vermelho e verde) imagens para quantificar o número de focos. </li></ol> Embora Metamorph podem ser usados ​​para quantificar números de focos, geralmente quando utilizando secções de tecido focos são contados manualmente (por olho) para maior precisão. Tipos de células específicas de interesse podem ser selecionados para quantificação, por exemplo, células epiteliais do pulmão. Isso pode ser feito com base na histologia e com referência a cortes corados hematoxilina e eosina serial.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li>
<li>Bhogal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+residual+gamma-H2AX+foci+in+murine+skin+are+dose+responsive+and+predict+radiosensitivity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo.</a> Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).</li>
<li>Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+as+a+biomarker+of+DNA+damage+induced+by+ionizing+radiation+in+human+peripheral+blood+lymphocytes+and+artificial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Space+Res%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin.</a> Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).</li>
<li>Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+airway+remodeling+in+acute%2C+subacute%2C+and+chronic+models+of+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).</li>
<li>Bolte, S. &amp, Cordelieres, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para os fins desta demonstração foram utilizados a partir de tecido pulmonar do rato não tratada Balb / c infectados e de um modelo do rato de doenças crônicas das vias aéreas alérgicas. Nós quantificada diferenças no número de focos por célula com médias um pouco maior observada no pulmão danificado em comparação com seções não tratada. Especificamente, a quantificação indicou 6,5 por focos / célula e 9,4 focos por célula / (contagem manual de 20 células por seção), no tecido não tratados e de tecido doença alérgica cr...

<table><tbody><tr><td>Albumina Sérica Bovina (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>O BSA (1%) é usado para bloquear qualquer ligação inespecífica de anticorpos. Os anticorpos primários e secundários são diluídos em BSA.</td></tr><tr><td>PBS (sem Ca)&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; e Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>Composto OCT (Optimal Cutting Temperature) 4583</td><td></td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>Lâminas Polysine</td><td>Menzel-Glaser</td><td>SF41296SP</td><td>Atrai eletrostaticamente seções de tecido congelado e reduz a necessidade de revestimentos e adesivos adicionais.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Reagente</td><td>Calbiochem</td><td>655205</td><td>Tween 20 (0,5%) é um detergente utilizado para permeabilizar células</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100 (0,1%) utilizado para permeabilizar células.</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-&amp;#947;H2AX (anticorpo policlonal de coelho)</td><td>Anticorpo Primário</td><td>Upstate, Millipore</td><td>07-164</td><td>Diluição do anticorpo primário (1:500) em BSA 1%.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo secundário de cabra anti-coelho IgG (H+L)</td><td>Anticorpo Secundário</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>Diluição do anticorpo secundário (1:500) em BSA 1%</td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>BSPEL316</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Reagente</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield PI</td><td>Reagente</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1300</td><td>Um meio de montagem à base de glicerol contendo iodeto de propídio (um corante nuclear vermelho). Este meio deve ser usado com uma lente de óleo que corresponda ao seu índice de refração.&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Observação: corante de DNA comumente utilizado: 4,6-diamidino-2-fenilindol di-hidrocloridrato (DAPI). Pode ser usado apenas com microscópios que possuam laser de excitação apropriado.</td></tr><tr><td>Mini PAP Pen</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>008877</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de cobertura (22x50 mm)</td><td></td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Pote Coplin, vidro</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Bacia de Coloração</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td><td></td><td>Microscópio confocal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM Leica 1950 Criostato</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Software para análise de imagens</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de γh2ax focos em amostras de tecido

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (LAP) são lesões particularmente letal e genotóxicas, que podem surgir tanto por processos endógenos (fisiológica ou patológica) ou por fatores exógenos, a radiação ionizante e compostos principalmente radiomimético. Fosforilação da variante histona H2A, H2AX, na serina-139 resíduos, na altamente conservada motivo SQEY C-terminal, formando γH2AX, é uma resposta inicial ao DNA de fita dupla-breaks<sup&gt; 1</sup&gt;. Este evento de fosforilação é mediada pela fosfatidil-inosito 3-quinase (PI3K) família de proteínas, ataxia telangiectasia mutantes (ATM), subunidade proteína-quinase DNA catalítico e ATM e Rad3 relacionados (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Globalmente, os resultados de indução DSB na formação de discreta nuclear γH2AX focos que podem ser facilmente detectadas e quantificadas por microscopia de imunofluorescência<sup&gt; 2</sup&gt;. Dada a especificidade e sensibilidade única deste marcador, a análise de focos γH2AX levou a uma ampla gama de aplicações em pesquisa biomédica, particularmente na biologia radiação e medicina nuclear. A quantificação de γH2AX focos tem sido mais amplamente investigado em sistemas de cultura celular no contexto de radiação ionizante induzida por LAP. Além da radiossensibilidade celular, imunofluorescência ensaios com base também foram usados ​​para avaliar a eficácia da radiação modificando compostos. Além disso, γH2AX tem sido usada como um marcador molecular para examinar a eficácia de vários DSB indutores de compostos e foi recentemente anunciado como sendo importante marcador do envelhecimento e doenças, especialmente câncer<sup&gt; 3</sup&gt;. Além disso, os métodos baseados em imunofluorescência foram adaptados para atender a detecção e quantificação de γH2AX focos<em&gt; Ex vivo</em&gt; E<em&gt; In vivo</em<sup&gt; 4,5</sup&gt;. Aqui, nós demonstramos um método típico de imunofluorescência para detecção e quantificação de γH2AX focos nos tecidos dos camundongos.

Quantificação de DNA dupla fita-breaks, com base em γH2AX focos tem se tornado uma ferramenta valiosa, especialmente na biologia da radiação, para a avaliação da radiossensibilidade de tecidos e os efeitos de compostos de radiação modificando. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para quantificação de γH2AX focos em amostras de tecido.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

As quebras de fita dupla (DSBs) do DNA são lesões particularmente letais e genotóxicas, que podem surgir seja por causas endógenas (fisiológicas ou patológicas) ...

Olá, meu nome é Michelle Tang dos Laboratórios de Medicina Epigenômica e Epigenética Humana. Liderados pela Dra. Tom Carianne, professora associada da ASAM Holster no Instituto Baker IDI de Coração e Diabetes. Hoje demonstrarei um ensaio de imunofluorescência gama H2AX in vivo para determinar a quantidade de dano ao DNA em tecidos doentes.H2AX é uma variante da histona que representa aproximadamente de dois a 10% da histona H2A total em Sahel e que é rapidamente fosforilada na serina 139 de células de mamíferos. Em resposta a danos no DNA, a forma fosforilada de H2AX é também conhecida como γH2AX, e já foi estabelecido que existe uma correlação direta entre o número de quebras de dupla fita e γH2AX. γH2AX é um marcador molecular sensível e tem sido demonstrado como um indicador precoce de quebras de dupla fita. Portanto, é uma técnica útil para detectar danos no DNA.Gamma H2AX pode ser visualizado como focos nucleares nos locais de dano ao DNA por microscopia fluorescente. Para o propósito deste experimento, utilizarei tecidos pulmonares de camundongos obtidos com o Dr. Simon Royce do Instituto de Pesquisa Infantil Murdoch. Investigarei o dano ao DNA em tecidos pulmonares de um mod

quantitation-of-h2ax-foci-in-tissue-samples

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Quantificação de DNA dupla fita-estrias usando formação γH2AX como um marcador molecular tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui mostramos o uso de um teste de imunofluorescência para a quantificação dos focos γH2AX após a exposição das células à radiação.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

Análise microscópica de γH2AX focos, que formam após a fosforilação de H2AX em Ser-139 em resposta ao DNA dupla fita-breaks, tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui usamos um anticorpo mono-metilado histona H3 em lisina 4 como um marcador epigenético ativamente de eucromatina transcrever, para avaliar a distribuição espacial da radiação induzida por formação γH2AX dentro do núcleo.

Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

Neste vídeo, descrevemos a técnica de microscopia de imunofluorescência para detectar proteínas específicas de resposta a danos no DNA localizadas nos locais de quebras de fita dupla de DNA em células mononucleares humanas. As proteínas são reconhecidas por anticorpos primários específicos, que por sua vez se ligam a anticorpos secundários marcados com fluoróforo que fluorescem durante a visualização microscópica, permitindo a visualização das proteínas como focos fluorescentes distintos dentro...

Microscopia de imunofluorescência para análise de quebras de fita dupla de DNA

A senescência celular, o estado irreversível de paragem do ciclo celular, pode ser induzida por vários stresses celulares. Aqui, descrevemos os protocolos para induzir a senescência e métodos celular para avaliar marcadores de senescência.

Técnicas para induzir e quantificar Cellular Senescence

Este manuscrito fornece um protocolo de análise de quebras de DNA dobro-costa pela microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.

Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar a formação e reparação do DNA Double-strand Breaks

Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

O método apresentado combina a análise quantitativa das rupturas da dobro-Costa do ADN (DSBs), a distribuição do ciclo de pilha e o apoptose para permitir a avaliação ciclo-específica da pilha da indução e do reparo de DSB assim como as conseqüências da falha do reparo.

Medição específica do ciclo celular de γH2AX e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Este protocolo apresenta a preparação do slide e a pontuação automatizada do ensaio de focos γ-H2AX em linfócitos sanguíneos periféricos. Para ilustrar o método e a sensibilidade do ensaio, linfócitos isolados foram irradiados in vitro. Este método automatizado de detecção de DSB de DNA é útil para aplicações de dosimetria biológica rápida e de alto rendimento.

Um método automatizado de pontuação microscópica para o ensaio de γ-H2AX Foci em Linfócitos de Sangue Periféricos Humanos

Este protocolo apresenta um método para avaliar a formação e o reparo de quebras de dupla fita de DNA através da detecção simultânea de focos de γH2AX e 53BP1 em núcleos interfásicos de linfócitos periféricos humanos tratados com bleomicina.

Imunofluorescência Dupla de γH2AX e 53BP1 em Linfócitos Periféricos Humanos

Aqui, apresentamos um protocolo simples e rápido para a detecção de interação proteica em locais de dano ao DNA.

Ensaio de ligante de proximidade para localizar proteínas em locais de dano ao DNA

Aprenda a quantificar focos de γH2AX em tecidos de camundongo por imunofluorescência para avaliar danos ao DNA. Este método permite detectar quebras de fita dupla em modelos de doenças e estudar respostas à radiação.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

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