Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar alvos genômicos de KDM cinco, um Jared, um RBB, duas histonas desmetilase. Isso é obtido pela preparação de cromatina reticulada que é sonicada para produzir fragmentos de DNA do tamanho apropriado como uma segunda etapa. Os fragmentos de DNA ligados a dois RBB são imunoprecipitados com anticorpos RBB dois.

Em seguida, o DNA genômico recuperado é amplificado por PCR para sequenciamento. Finalmente, as leituras curtas sequenciadas da Illumina são alinhadas de forma única ao genoma humano, e picos significativos são identificados e anotados nos genes mais próximos. Para identificar rbbb dois genes alvo são obtidos resultados que mostram funções moleculares associadas a Rrb B dois genes alvo com base na identificação de todo o genoma de Rbbb duas regiões enriquecidas.

Olá, sou Mike. Ela é do laboratório da Dra. Elizabeth Bencia no Departamento de Bioquímica e Genética Molecular da Universidade de Illinois em Chicago. E eu sou ala do laboratório de genômica biomédica liderado pelo Dr.NGA no BARCEL Biomedical Research Park University PO P fea.

E eu sou Danielle Dal. E eu sou William Richter. Nós dois também estamos no Laboratório de Habilidades de Benevolência.

Hoje vamos mostrar um procedimento para cromatina, imunoprecipitação e sequenciamento. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar o local de ligação de seu dermatologista. Então vamos começar.

Para iniciar este procedimento, cresça aproximadamente 10 até as oitavas células. Para cada imunoprecipitação ou ip. Aqui, linfoma osteolítico difuso.

As células U 9 37 são usadas e induzidas para diferenciação monocítica com TPA por 96 horas após o crescimento celular em solução de formaldeído diretamente para o meio até uma concentração final de 1% Em seguida, gire o frasco brevemente e deixe-os descansar em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, aspire o meio e enxágue as células com 15 mililitros de PBS gelado. Repita esta lavagem uma vez.

Em seguida, adicione seis mililitros de tampão de lise um a cada um dos frascos no gelo. Em seguida, balance os frascos por 20 minutos a quatro graus Celsius. Finalmente, colha as células usando um raspador de células e transfira-as para tubos cônicos de 15 mililitros.

Neste ponto, as células podem ser armazenadas a menos 80 graus Celsius. Se as células foram congeladas, retire-as. Depois de descongelado, gire as células para baixo e descarte o arrebatador.

Em seguida, ressuspenda as células em seis mililitros de tampão de lise dois, agite os tubos suavemente à temperatura ambiente por 10 minutos. Repita a centrifugação e ressuspenda as células em 2,5 mililitros de tampão de lise três. Em seguida, prepare a suspensão para sonicação colocando-a em um copo de água gelada com a microponta de um sonier Branson 450 ajustada para entre 50 e 60% de amplitude.

Sonicar a solução para uma 32ª explosão constante e esfriar no gelo. Por um minuto, repita esses pulsos 10 a 15 vezes, depois pipete o conteúdo do tubo para cima e para baixo e transfira-os para um novo tubo. Continue a pulsar e esfriar a solução.

Mais cinco vezes após a sonicação, adicione 10% de Triton X 100 a um décimo do volume da solução. Em seguida, transfira os lisados para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro e gire os detritos em uma microcentrífuga antes da cromatina, imunoprecipitação ou chip. Economize 50 microlitros do lisado celular como amostra de entrada.

Em seguida, combinou o lisado de células limpas com grânulos dyna ligados ao anticorpo que havia sido previamente preparado conforme descrito no protocolo escrito. Agite a mistura além da amostra de entrada de 50 microlitros a quatro graus Celsius durante a noite. Lave as contas com um mililitro de tampão de lavagem.

Em seguida, use um suporte magnético para coletar as contas e remover o sobrenadante. Repita esta lavagem seis a oito vezes. Efectuar uma lavagem final com um mililitro de TE mais 50 milimolares de cloreto de sódio.

Gire os grânulos em uma microcentrífuga após a centrifugação, aspire qualquer tampão TE residual. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão elu às amostras. Imediatamente depois.

Incube as amostras a 65 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Raspe os tubos contra um suporte de tubo de 1,5 mililitro a cada dois minutos para manter as contas em suspensão. Colete os grânulos usando centrifugação e o suporte magnético e transfira o SNAT para um tubo de PCR.

Em seguida, recupere o exemplo de entrada salvo anteriormente e adicione três volumes do buffer de eluição. Por fim, coloque o IP e insira as amostras no termociclador durante a noite a 65 graus Celsius. Para reverter as ligações cruzadas no dia seguinte, adicione um volume de tampão TE às amostras.

Em seguida, adicione RNAs A a uma concentração final de 0,2 microgramas por microlitro. Incube as amostras no termociclador por uma a duas horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, adicione a proteinase K a uma concentração final de 0,2 microgramas por microlitro.

Em seguida, incube amostras no termociclador a 55 graus Celsius por duas horas. Em seguida, extraia as amostras uma vez com um volume de fenol. Extrair as amostras uma segunda vez com um volume de álcool fenilclorofórmio isoamílico.

Por fim, extrair as amostras mais uma vez com um volume de álcool clorofórmio isoamílico. Em seguida, adicione 30 microgramas de glicogênio a cada amostra. Além disso, adicione cloreto de sódio a uma concentração final de 0,2 molar e dois volumes de etanol às amostras.

Incube-os por 30 minutos a menos 80 graus Celsius. Após a incubação, centrifugar as amostras e decantar o snat. Lave os pellets com 500 microlitros de etanol a 75%, depois seque os pellets e ressuspenda-os em 40 microlitros de água.

Para verificar os tamanhos dos fragmentos de DNA produzidos pelo procedimento de SONICAÇÃO, coloque cinco microgramas da amostra de entrada purificada em um gel de agro 1,8% e execute o gel. O procedimento de sonicação deve produzir fragmentos na faixa de 150 a 350 pares de bases. No entanto, se os fragmentos não se enquadrarem nesta faixa, o procedimento de sonicação deve ser ajustado variando o número de explosões e a amplitude antes da amplificação do DNA genômico.

Verifique o tamanho, concentração e enriquecimento das amostras conforme descrito no protocolo escrito. Para iniciar a amplificação do DNA genômico, obtenha 34 microlitros da amostra IP e 200 nanogramas da amostra de entrada. Execute e repare a adição e ligação de adaptadores a fragmentos de DNA usando um kit de preparação de amostra de DNA genômico Illumina, conforme descrito no protocolo escrito.

Purifique o DNA usando um kit de purificação mini lut PCR e, em seguida, eluia-o em tampão EB que foi pré-aquecido a 50 graus Celsius. Use 23 microlitros e 46 microlitros para o IP e amostras de DNA de entrada, respectivamente. Faça a reação de PCR usando 23 microlitros de DNA com adaptadores de 25 microlitros de fusão, DNA polimerase do kit.

Um microlitro de 20 micromolares único PCR um e um microlitro de 20 micromolar. Portanto, o PCR dois executa a reação de PCR conforme descrito no protocolo escrito após a amplificação do PCR. Purifique o DNA com o kit de purificação de PCR mini loop da Qiagen.

Pré-aqueça 15 microlitros de tampão EB a 50 graus Celsius e dilua o DNA, dilua 0,5 microlitros da amostra de um a quatro e faça uma leitura NanoDrop para purificar os produtos amplificados. Prepare um gel 1.8% AGROS de 50 mililitros usando água de grau HPLC, adicione TAE e brometo após o agros derreter. Em seguida, despeje o gel, carregue o gel.

Depois de adicionar quatro microlitros de buffer de carga às amostras de entrada e IP, execute o gel a 120 volts por 45 minutos. Analise o gel depois de executado. Deve revelar que são produzidos fragmentos na faixa entre 150 e 350 pares de bases.

Eles representam fragmentos de DNA genômico entre 50 e 250 pares de bases de comprimento. E um adaptador excisa a região do gel que contém o material na faixa de 150 a 350 pares de bases com um bisturi. Tome cuidado para evitar a excisão da banda do adaptador do adaptador, que funciona com cerca de 120 pares de bases.

Recupere o DNA usando um kit de extração rápida de gel de caiaque de acordo com as instruções do fabricante. Seque a amostra até precisamente 11 microlitros em uma velocidade de volta sem calor. Remova um microlitro da amostra e meça a concentração de DNA usando um espectrofotômetro NanoDrop.

Finalmente, identifique produtos de genes enriquecidos usando o analisador de genoma Illumina e analise os locais de ligação e genes-alvo conforme descrito no protocolo escrito. As coordenadas genômicas das regiões de ligação à proteína RB enriquecida identificada dois ou RBP dois são apresentadas em um formato cromossômico. As ocupações de genes de conjunto nos cromossomos podem ser visualizadas como VARs pretos.

Aqui, as ocupações do cromossomo 10 são mostradas rbp, duas regiões de ligação são mostradas como linhas verticais. O painel do meio mostra todas as duas regiões de ligação de isoforma rbp no cromossomo 10, e o painel inferior mostra rbp duas grandes regiões de ligação de isoforma. Essas informações fornecem uma visão geral da sobreposição e ocupação específica de duas isoformas de RBP no cromossomo 10.

Aqui, um mapa de calor é mostrado com taxa de descoberta falsa ou ontologia de gene significativamente enriquecida corrigida por FDR ou categorias de função molecular entre os genes ligados por rbp. Duas cores em direção ao vermelho indicam alta significância estatística. Amarelo indica baixa significância estatística e cinza indica nenhuma significância estatística.

A análise de enriquecimento mostra as funções moleculares sobrepostas e específicas da isoforma de R BP dois genes-alvo. Acabamos de mostrar como identificar locais de ligação do fator de transcrição durante este procedimento. É importante produzir fragmentos de DNA com a faixa de tamanho e rendimento apropriados.

Isso pode ser alcançado seguindo nossas diretrizes durante a etapa de SONICAÇÃO. Então é isso. Boa sorte com seus experimentos e obrigado por assistir.