Name: Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprenda a realizar injeção intraperitoneal em zebrafish adulto utilizando anestesia com água fria e microseringa. Este método permite estudar a homeostase da glicose sanguínea em Danio rerio.

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Este estudo foi apoiado pela Juvenile Diabetes Research Foundation conceder 5-2007-97 (a VEP), pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais concede R01DK064973 (a VEP), R01DK48494 (para LHP), T32DK07074 (apoio SCE), K01DK083552 (para MDK), e por P60DK20595 para a Universidade de Chicago e Diabetes Research Training Center. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do NIDDK ou o NIH.

1. Pré-injeção Preparações <ol><li> Rápido o peixe por pelo menos 24 horas antes da injeção. Isto irá esvaziar o bulbo intestinal (estômago) conteúdo. O protocolo de jejum básica é a de transferir o peixe, a sua densidade normal, para um tanque limpo, então reter o alimento. Para longo prazo jejum que exigir condições mais rigorosas (por exemplo, para estudos de glicose no sangue), ver considerações adicionais na discussão. </li><li> Prepare Cortland solução salina (Perry et al., 1984). Para um volume de 100 mL, dissolver o seguinte em água destilada: 725 mg de NaCl (124,1 mM) 38 mg KCl (5,1 mM) 41 mg Na 2 HPO 4 (2,9 mM) 24 mg MgSO 4 7H 2 O ∙ (1,9 mM) 16 mg CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1,4 mM) 100 mg NaHCO 3 (11,9 mM) 4 g Polivinilpirrolidona (PVP) (4%) 1000 unidades de Heparina USP Filtro, esterilizar e armazenar a 4 ° C. </li><li> Prepare o microscópio. <ul><li> Cobrir a base do microscópio com filme plástico para proteção em caso de derramamentos. </li><li> Coloque uma toalha de papel em cima do plástico. A mesa cirúrgica vai sentar em cima da toalha de papel. </li><li> Pré-ajustar o foco através da visualização da mesa cirúrgica e incidindo sobre a esponja. </li></ul> Dica: Coloque o seu dedo em cima da esponja e focar isso. Isto irá eliminar ou minimizar ainda mais o ajuste focal uma vez que o peixe está na mesa cirúrgica. </li><li> Pesar o peixe. <ul><li> Encher um copo de 500 ml cerca de 1 / 3 cheio com água instalação de peixe. </li><li> Tare a balança. </li><li> Recolher o peixe usando uma rede. Wick o excesso de água longe da net e peixes, por breves instantes dabbing o líquido sobre papel absorvente. Transfira o peixe para o copo. </li><li> Pesar o peixe. </li><li> Transferir os peixes para um tanque limpo. </li><li> Transferência de cada peixe pesava a seu próprio tanque rotulados. </li><li> Calcular o volume de injeção para cada peixe com base no peso dos peixes. </li></ul></li><li> Prepare a seringa e equipamento de injeção relacionados. Injectável, recomendamos uma 35G agulha de aço chanfrada a 10 micro e NanoFil mL. Prepare a seringa NanoFil e tubos silflex seguindo as instruções do fabricante. É importante para eliminar as bolhas da seringa e tubos. Após o preenchimento da seringa e tubulação, monte a seringa na bomba, e programar o volume de injeção para o primeiro peixe. </li><li> Prepare a mesa cirúrgica. <ul><li> Cortar uma esponja macia (como # L800-D, Jaece Industries), de modo que é de aproximadamente 20 mm de altura. Na face plana, faça um corte que é de 10-15 mm de profundidade. Este corte é a calha que vai segurar o peixe para injeção. </li><li> Definir a esponja em uma placa de Petri 60 mm. </li><li> Definir a placa de Petri com esponja em uma de dimensões adequadas e tampa da caixa ponta da pipeta. A tampa precisa ser grande o suficiente para armazenar água para ajudar a manter a temperatura esponja, mas deve ser rasa o suficiente para não ficar no caminho. Usamos uma tampa de uma caixa de ponta P200 que é 11,4 centímetros L x 7,7 centímetros W x 1.5 cm D. </li></ul> Estes três itens reunidos (esponja em placa de Petri na tampa da caixa) constituem a mesa cirúrgica. </li><li> Prepare o anestésico. <ul><li> Fazer gelo picado usando cubos feitos de água instalação de peixe. </li></ul> Dica: Usando bandejas do cubo de gelo típico, vai demorar 3 bandejas para anestesiar 12/10 peixe. <ul><li> Encher um balde de gelo limpo com o gelo picado. </li><li> Colocar a mesa cirúrgica em um recipiente maior, como um Rubbermaid 2,4 litros recipiente de armazenamento de alimentos. </li><li> Despeje um pouco de água facilidade (quente) para o recipiente externo e mesa cirúrgica. Manter uma reserva de água quente instalações nas proximidades. </li><li> Coloque um termômetro dentro do recipiente externo. </li></ul></li></ol> 2. Injeção de anestesia e recuperação <ol><li> Coloque o recipiente anestésico exterior com mesa cirúrgica ao lado do microscópio. Tem o balde de cubos de gelo nas proximidades. </li><li> Traga a temperatura da água até 17 ° C pela adição de pedaços de gelo. Importante: Não vá abaixo dos 17 ° C para esta etapa. </li><li> Use uma rede para transferir o peixe para o recipiente exterior. </li><li> Lentamente, adicionar pedaços de gelo ao recipiente para baixar a temperatura a 12 ° C, ao longo de vários minutos. </li><li> Monitorar o comportamento dos peixes: Aos 17 ° C ou ligeiramente abaixo, o peixe tipicamente espalhará seus nadadeiras peitorais horizontalmente, gasp, e tem movimentos rápidos opérculo. Quando a temperatura cai, os peixes vão nadar mais lentamente e, finalmente, parar de nadar. Como o plano cirúrgico de anestesia é abordado, ofegante vai parar e movimentos opérculo será lenta. O peixe está pronto para a injecção quando não reage a ser tratada. Para a maioria dos peixes, 12 ° C é suficiente. Peixes maiores podem exigir mais frio water. </li><li> Como a temperatura desejada é atingida (~ 12 ° C ou mais frio), pressione a esponja para saturá-lo. </li><li> Mantenha seus dedos na água fria o suficiente para que eles não vão aquecer o peixe e trazê-lo para fora de anestesia durante o manuseio. </li><li> Com dedos frios, gentilmente transferir o peixe para a calha da esponja. A posição do peixe com o abdômen para cima e as brânquias no cocho. </li><li> Transferir rapidamente da mesa cirúrgica para o palco microscópio. </li><li> Trabalhando rapidamente, insira cuidadosamente a agulha no midline entre as nadadeiras pélvicas. A agulha deve apontar cranialmente e ser inserido mais perto da cintura pélvica do que do ânus. Você deve ser capaz de sentir quando a agulha é profunda para a parede do corpo. Injetar o volume adequado e retire a agulha. </li><li> Após a injeção, transferir imediatamente os peixes de volta à sua água morna (~ 28.5 ° C) tanque de recuperação, libertando o peixe da esponja sobre a água do tanque. Dica: Se o peixe não começa imediatamente natação, ajudá-la a recuperar rodando suavemente água para as brânquias. </li><li> Verifique a agulha. Ocasionalmente, uma escala pode ser anexado e deve ser removido antes da próxima injeção. </li><li> Para injecções subsequentes, use água morna facilidade para trazer o anestésico temperatura da água câmara de volta até 17 ° C antes de introduzir os peixes próximos. </li></ol> 3. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Seguintes resultados Representante injeção intraperitoneal de 0,5 mg de glicose / g ou veículo. Peixes foram mantidos em jejum por 72 horas antes da injeção. O eixo x mostra o tempo, após a injecção. Média ± SEM.

<ol><li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G. Perfusion methods for the study of gill physiology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerry%2C+SF+%22Fish+Physiology+Volume+X%3A+Gills%2C+Part+B%3A+Ion+and+Water%22">Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water</a>. Hoar, W. S., Randall, D. J. , Academic Press, Inc. Orlando. 325-388 (1984).</li>
<li>Brown, L. A. Anesthesia and restraint. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+LA+%22Fish+Medicine%22">Fish Medicine</a>. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 79-90 (1993).</li>
<li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li>
<li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li>
<li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (1995).</li>
<li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A. Anaesthetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIwama%2C+GK+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Fishes%2C+Volume+3%3A+Analytical+Techniques%22">Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques</a>. Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. , Elsevier. Amsterdam. 1-15 (1994).</li>
<li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li>
<li>Stoskopf, M. K. Surgery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoskopf%2C+MK+%22Fish+Medicine%22">Fish Medicine</a>. Stoskopf, M. K. , Saunders Company. Philadelphia. 91-97 (1993).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Injeção intraperitoneal envolve cinco etapas: jejum, pesagem, anestesia, injeção e recuperação. Para cada etapa existem melhores práticas que podem garantir o sucesso. Sucesso de um paciente inclui peixes saudáveis, bem como um bom resultado experimental. Jejum: Um jejum de 24 horas deve esvaziar o bulbo intestinal. Esta prática é tomada a partir da literatura veterinária peixe (eg, Brown 1993). As considerações adicionais de jejum são discutidos abaixo. Longo prazo jejum: Descobrimos que um jejum de 72 horas é necessária para diminuir a glicose no sangue a um nível de base antes da injeção (Eames et al, 2010).. Temos também descobriu que, para estudos de glicose existem vários procedimentos que são necessários para garantir que os peixes estejam em jejum corretamente. Comece com um tanque limpa (sem resíduos no fundo). Tanques deve ser desligada, claramente identificados como &quot;jejum&quot;, e em um local onde o pessoal de assistência entusiástica peixe não vai alimentá-los. Avaliar o ambiente externo do tanque e tomar medidas para evitar que os peixes de ser estressado de distúrbios, como estresse é conhecido por elevar a glicose no sangue (Chavin e Young, 1970;. Groff et al, 1999). Por exemplo, nós tivemos uma experiência de jejum em que uma rádio foi operado diariamente no banco que estava segurando os tanques de peixes. Descobrimos que a glicemia foi invulgarmente elevado e concluiu que os peixes estavam estressados ​​pelas vibrações. Outro estressor é a superlotação. Os peixes devem ser mantidos a uma densidade que está em conformidade com boas práticas de peixe. Para recomendações, consulte Marca et al. (2002) e Westerfield (1995). Temos tido bons resultados em jejum nossos peixes com uma densidade de 10-12 peixes em um tanque de 9 litros (com 3 camadas de mármores ocupar algum desse volume). Separar os sexos pode causar estresse, por isso recomendamos a manutenção de uma população mista de sexo durante o jejum. Isto significa que os ovos podem ser estabelecidas, e os ovos precisam ser seqüestrado para que eles não serão comidos. Uma maneira simples de sequestrar ovos é para cobrir o fundo do tanque com 2-3 camadas de bolinhas de gude. Qualidade da água precisa ser mantida através da remoção de ovos e resíduos e pela substituição de cerca de 10-15% da água do tanque, diariamente. Para a remoção de ovos e resíduos, sifão funciona bem. Pesagem: Na pesagem dos peixes que não são anestesiados, cuidados devem ser tomados para minimizar a transferência de água da rede para o copo, para assegurar uma medição precisa. Se o líquido (com peixes) é apagado em toalhas de papel, a maioria da água em excesso pode ser removido, eo peso podem ser medidos com precisão. Pode ser mais fácil para anestesiar os peixes antes da pesagem, mas não testei os possíveis efeitos de anestesiar um peixe duas vezes em um dia. Nós testamos a nossa técnica de pesagem do pescado pela primeira vez com a compensação / blotting método e, em seguida, voltando a pesar o peixe depois de ter sido anestesiados, e suavemente secos com papel absorvente. Nós não encontramos nenhuma diferença significativa de peso entre os métodos (P = 0,7927, t-test). Além disso, testamos se essa compensação / blotting método de glicose no sangue afetadas, em comparação com simplesmente transferir o peixe para o copo assim que é saldada (sem blotting). Nós não encontramos nenhuma diferença significativa no nível de glicose no sangue entre os dois métodos de transferência (P = 0,2241, t-test). Anestesiar: anestesia química pode ser adequado para muitos estudos. Aqui nós temos demonstrado anestesia água fria como uma alternativa, porque muitos anestésicos (incluindo tricaine/MS-222 (Brown, 1993)), aumentar a glicose no sangue. Em estudos anteriores, nós determinamos que a água fria não levanta de glicose no sangue em zebrafish (Eames et al., 2010). Para anestesia água fria, a temperatura deve ser reduzida lentamente. A taxa de diminuição parece depender do tamanho do peixe, com peixes menores indo mais rápido do que em peixes maiores. Após a injeção, você pode observar que o peixe está se recuperando muito lentamente da anestesia (veja abaixo). Isto pode ocorrer quando tanto a temperatura inicial é muito baixo, ou quando a temperatura diminui muito rapidamente. A temperatura de partida é muito baixo se o peixe se dobra lateralmente ao entrar na água. Se a temperatura inicial está correto, os peixes vão manter o seu equilíbrio inicialmente. Ele irá girar suas nadadeiras peitorais para uma posição horizontal, gasp, e tem movimentos rápidos opérculo. Normalmente, ele irá nadar. Como a temperatura diminui, os movimentos irão diminuir e os peixes vão perder o equilíbrio. Um plano cirúrgico de anestesia é alcançado quando os peixes podem ser manuseados sem reagir. Para manter os peixes sob anestesia cirúrgica, os dedos devem ser frias, por isso mantê-los na água antes de manusear o peixe. A esponja também deve ser mantido frio na mesma temperatura que a água usada para anestesiar os peixes. É importante para saturar a esponja com água que é sufficiently frio para manter a anestesia uma vez que o peixe é colocado sobre ele. Injecção: Antes de injeções empresa, você pode querer dissecar pelo menos um peixe para ter uma noção de espessura da parede do corpo. Isso pode ajudar você para julgar o quanto a agulha precisa inserir para entrar na cavidade abdominal. Além disso, ao inserir a agulha, você pode sentir a parede do corpo &quot;dar&quot; quando a agulha penetra na cavidade abdominal. Durante a injeção, tomar medidas para manter o paciente feliz. Certifique-se que a esponja está saturada com a água correta temperatura fria para evitar que o peixe de reavivar durante a injeção. Uma esponja bem macia saturada e é importante para minimizar os danos às escalas e muco cobertura da pele. Uma esponja bem saturada também é importante para manter as brânquias aerado. É altamente recomendável a esponja de espuma listados abaixo em Materiais. Finalmente, uma vez que o peixe é anestesiado, trabalhar rapidamente para minimizar o tempo que o peixe está sob. Recuperação: O peixe deve se recuperar da anestesia praticamente ao entrar no tanque de água quente. Se o peixe não começa imediatamente natação, rode suavemente a água para suas guelras para acelerar a recuperação. Se a recuperação é lenta, então o peixe passou sob muito rapidamente e você deve ajustar o procedimento de anestesia de forma adequada. As possíveis causas da lenta recuperação são discutidos sob anestesia.

<table><tbody><tr><td>Espuma esponjosa</td><td>Jaece Industries</td><td>L800-D</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampa de caixa de ponteiras</td><td></td><td></td><td>não muito profunda, por exemplo, 1,5 cm</td></tr><tr><td>Recipiente plástico de armazenamento</td><td></td><td></td><td>fundo profundo, por exemplo, 7 cm</td></tr><tr><td>Termômetro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelo picado</td><td></td><td></td><td>feito com água da instalação</td></tr><tr><td>Água morna da instalação</td><td></td><td></td><td>1 litro ou mais</td></tr><tr><td>Béquer de 500 ml</td><td></td><td></td><td>para pesagem</td></tr><tr><td>Seringa NanoFil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL</td><td>ou seringa Hamilton</td></tr><tr><td>Agulha de calibre 35</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NF35BV-2</td><td>com bisel</td></tr><tr><td>Tubo de Silflex</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SILFLEX-2</td><td></td></tr><tr><td>Bomba UltraMicroPump III e controlador Micro4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMPS-1</td><td></td></tr><tr><td>Chave de pedal</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>15867</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel-filme plástico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel-toalha</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina Cortland</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

injeção intraperitoneal em zebrafish adulto

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Um método conveniente para tratar quimicamente zebrafish é introduzir o reagente na água do tanque, onde será absorvido pelos peixes. No entanto, este método torna difícil saber o quanto de reagentes é absorvido ou tomado por peixe. Algumas perguntas experimental, particularmente aqueles relacionados aos estudos metabólicos, pode ser melhor abordados através da apresentação de uma quantidade definida para cada peixe, com base no peso. Aqui apresentamos um método para injeção (IP) intraperitoneal em peixe-zebra adulto. Injeção é na cavidade abdominal, posterior à cintura pélvica. Este procedimento é uma adaptação de métodos veterinários utilizados para peixes maiores. É seguro, como temos observado mortalidade zero. Além disso, temos visto sangramento no local da injeção em apenas 5 de 127 injeções, e em cada um desses casos, o sangramento foi breve, durando vários segundos, ea quantidade de sangue perdido era pequeno. Sucesso com este procedimento requer manuseio suave dos peixes através de várias etapas, incluindo o jejum, pesagem, anestesia, injeção e recuperação. Precauções são necessárias para minimizar o estresse durante o procedimento. Nosso precauções incluem o uso de um volume de injeção de pequeno e uma agulha 35G. Usamos Cortland solução salina como o veículo, que é osmoticamente balanceada para peixes de água doce. Aeração das brânquias é mantida durante o procedimento de injeção pela primeira trazendo o peixe em um plano cirúrgico de anestesia, o que permite movimentos opérculo lento e, segundo, mantendo os peixes em um canal dentro de uma esponja saturada de água durante a injeção em si. Nós demonstrar a utilidade da injeção IP através da injeção de glicose e monitorar a elevação do nível de glicose no sangue e seu posterior retorno ao normal. Como o stress é conhecido por aumentar a glicose no sangue em peixes teleósteos, comparamos os níveis de glicose no sangue em adultos veículo injetado e não injetados e mostrar que o procedimento não causa um aumento significativo da glicose no sangue.

Demonstramos injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto. Usamos a 10 mL NanoFil micro controlado por um controlador MICRO4 e III UltraMicroPump. Esta demonstração inclui o uso de água fria como um anestésico.

Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

Um método conveniente para o tratamento químico de peixes-zebra consiste em introduzir o reagente na água do aquário, onde este será absorvido pelos peixes. No entanto, ...

O objetivo geral deste procedimento é injetar uma solução na cavidade peritoneal do peixe-zebra adulto. Neste exemplo, injetaremos glicose em nosso laboratório. Utilizamos este procedimento para estudar a estase da glicose sanguínea.Isso é realizado primeiramente pesando o peixe para determinar a quantidade de solução a ser injetada por grama de peso corporal. O segundo passo do procedimento é anestesiar o peixe com água fria. O terceiro passo do procedimento é transferir o peixe para a platina do microscópio e injetar.O passo final do procedimento é devolver o peixe ao seu tanque para recuperação. Em última análise, podem-se obter resultados que mostrem alterações na homeostase da glicose por meio da medição dos níveis de glicose no sangue. Olá, sou Mary Kinkle do Laboratório de Victoria Prince, do Departamento de Biologia e Anatomia Organísmicas da Universidade de Chicago.Sou Stephanie Ames, também do Laboratório Prince. Hoje vamos mostrar um procedimento para injeção intraperitoneal em peixes-zebra adultos. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a regulação da homeostase da glicose sanguínea.Então vamos começar. Para preparar os peixes para injeção, comece transferindo-os para um tanque limpo e suspenda a alimentação. Deixe os peixes em jejum por 24 horas para esvaziar o conteúdo do bulbo intestinal e por 72 horas para reduzir a glicose sanguínea aos níveis basais.A densidade utilizada neste protocolo é de 10 a 12 peixes de sexo misto por aquário de nove litros com três camadas de bolinhas de gude, que aprisionam os ovos para que não sejam comidos. Remova os ovos e os resíduos diariamente por meio de sifonagem do aquário.A seguir, prepare a solução salina Cortland utilizando 124,1 milimolar de cloreto de sódio, 5,1 milimolar de cloreto de potássio, 2,9 milimolar de pirofosfato de sódio, 1,9 milimolar de sulfato de magnésio hepta-hidratado, 1,4 milimolar de cloreto de cálcio di-hidratado, 11,9 milimolar de bicarbonato de sódio, quatro gramas de polivinilpirrolidona e 1000 unidades USP de heparina, completando o volume final para 100 mililitros com água deionizada; filtre, esterilize e armazene a quatro graus Celsius. Em seguida, dissolva cinco gramas de glicose em 10 mililitros da solução salina Cortland. Para obter uma solução de glicose a 0,5 miligramas por microlitro, filtre, esterilize e armazene a quatro graus Celsius.Em seguida, prepare a mesa cirúrgica cortando uma esponja macia com aproximadamente 20 milímetros de altura na face plana. Faça um corte de 10 a 15 milímetros de profundidade para segurar o peixe durante a injeção. Coloque a esponja em uma placa de Petri de 60 milímetros e posicione a placa com a esponja dentro da tampa de uma caixa para ponteiras de pipeta P 200.Em seguida, prepare o microscópio cobrindo sua base com filme plástico e toalhas de papel para proteção. Em caso de derramamentos, coloque a mesa cirúrgica sobre a toalha de papel. Ajuste previamente o foco observando a mesa cirúrgica e focalizando a esponja.Coloque o dedo sobre a esponja e concentre-se nele para minimizar ajustes focais adicionais quando o peixe estiver na mesa cirúrgica. Após pesar o peixe, encha um béquer de 500 mililitros aproximadamente um terço com água do sistema de criação de peixes e papel-toalha. Em uma balança, transfira cuidadosamente o peixe com o mínimo de água excedente possível para o béquer e registre o peso; transfira cada peixe pesado para um tanque transparente e identificado.Calcule o volume de injeção com base no peso. Neste exemplo, injetaremos uma solução de 0,5 miligramas por grama de peso corporal de glicose dissolvida em solução salina Cortland. Como nossa solução é de 0,5 miligramas por microlitro, o cálculo é: um vezes o peso do peixe em gramas equivale ao volume a ser injetado em microlitros. Prepare a seringa e os equipamentos relacionados para injeção.Este protocolo utiliza uma agulha de aço biselada 30G, uma bomba ultramicro e um microprocessador de quatro canais e uma seringa micro de 10 microlitros com nano preenchimento para injeção de glicose; preencha a seringa com glicose a 0,5 miligramas por microlitro dissolvida em solução salina Cortland. É importante remover todas as bolhas de ar da seringa, montar a seringa na bomba ultramicro e programar o volume de injeção para o primeiro peixe inserindo o volume em nanolitros, utilizando o teclado numérico no microprocessador de quatro canais. Por fim, prepare o anestésico de gelo triturando cubos de gelo suficientes feitos com água da instalação de criação de peixes.Para encher um balde de gelo, coloque a mesa cirúrgica em um recipiente maior, como um recipiente de armazenamento de alimentos de borracha com capacidade de 2,4 litros. Despeje água morna da instalação no recipiente externo e na mesa cirúrgica. Mantenha um tanque reserva de água morna da instalação por perto.Fixe um termômetro ao recipiente externo. Posicione o recipiente externo do anestésico mais a mesa cirúrgica ao lado do microscópio. Mantenha o balde com pedras de gelo por perto.Comece a adicionar pedras de gelo até que a temperatura da água atinja 17 graus Celsius. Não deixe a temperatura cair abaixo de 17 graus Celsius nesta etapa. Use uma rede para transferir os peixes para o recipiente externo.A 17 graus ou ligeiramente abaixo, os peixes normalmente espalham suas nadadeiras peitorais horizontalmente, ofegam e apresentam movimentos auriculares rápidos. Adicione lentamente pedaços de gelo ao recipiente para reduzir a temperatura até 12 graus Celsius ao longo de vários minutos. À medida que a temperatura diminui, o peixe nadará mais lentamente e, finalmente, parará de nadar.Eventualmente, os movimentos ofegantes cessarão e os movimentos auriculares desacelerarão. O peixe está pronto para a injeção quando não reage ao manuseio. Ao atingir a temperatura necessária, pressione a esponja para saturá-la.Mantenha os dedos na água fria por tempo suficiente para que não aqueçam o peixe e o retirem da anestesia. Durante o manuseio com os dedos frios, transfira suavemente o peixe para o sulco da esponja. Posicione o peixe com o abdômen voltado para cima e as brânquias no sulco.Transfira rapidamente a mesa cirúrgica para a platina do microscópio. Trabalhando rapidamente, posicione cuidadosamente a agulha de modo que a ponta aponte cranialmente e fique mais próxima da cintura pélvica do que do ânus. Insira a agulha na linha média entre as nadadeiras pélvicas.Você deve ser capaz de sentir quando a agulha estiver profunda em relação à parede corporal. Ao inserir a agulha, é possível sentir a parede corporal ceder. Quando a agulha entrar na cavidade abdominal, injete o volume apropriado utilizando o micro para processador.Use o pedal para injetar um microlitro por grama do peso corporal do peixe; após a injeção, remova a agulha e transfira imediatamente o peixe de volta para o seu tanque de água morna para recuperação. Ao soltar o peixe da esponja sobre a água do tanque, verifique a agulha ao microscópio. Ocasionalmente, uma escama pode ficar aderida e deve ser removida antes da próxima injeção.Após um período de tempo adequado, prossiga com o seu ensaio subsequente. Descobrimos que um jejum de 72 horas é necessário para reduzir a glicose sanguínea a um nível basal antes da injeção. Nesta figura, os dados do controle não injetado, mostrados em verde, exibem valores de glicose sanguínea não significativamente diferentes dos controles injetados com veículo, mostrados aqui em vermelho.No entanto, a linha azul exibe os valores de glicose sanguínea para os peixes injetados com glicose e mostra a elevação e queda da glicose circulante. Ao longo do tempo, tanto os animais injetados com glicose quanto os injetados com veículo estavam sob anestesia cirúrgica durante o procedimento de injeção, enquanto os controles não injetados não estavam sob anestesia cirúrgica. Acabamos de mostrar como realizar injeção intraperitoneal em peixes-zebra adultos.No nosso laboratório, estudamos as alterações na concentração de glicose no sangue em diferentes pontos temporais após a injeção IP de uma solução de glicose. No entanto, esta técnica que acabamos de mostrar pode ser utilizada para injetar a sua solução de interesse. Ao realizar este procedimento, lembre-se de anestesiar o peixe lentamente e manipulá-lo com cuidado.É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Biologia

Aqui nós mostramos como fazer retro-orbital injeção em peixe-zebra adulto.

Retro-orbital de injeção no Zebrafish Adulto

Este vídeo descreve a técnica de injeção intramuscular para administrar compostos nos músculos dorsais de um peixe-zebra adulto.

Injeção intramuscular (IM): entrega composta no músculo dorsal de um peixe-zebra adulto

Este vídeo descreve uma técnica de injeção intraperitoneal, um método para administrar soluções na cavidade abdominal de peixe-zebra adulto.

Injeção intraperitoneal: um método de administração de solução na cavidade abdominal de um peixe-zebra adulto

Este vídeo descreve a técnica de entrega de compostos no coração de peixes-zebra adultos usando injeção intratorácica.

Injeção intratorácica: entrega composta ao coração do peixe-zebra adulto

Este método baseia-se na injeção de 0,5 − 3 μL de solução no tórax de zebrafish adulto. O procedimento entrega eficientemente proteínas e compostos químicos na proximidade do coração de zebrafish sem danificar o órgão. A abordagem é adequada para efeitos de teste de fatores exógenos em vários tecidos do coração.

Injeção intratorácica para o estudo do coração de zebrafish adulto

Um novo método de injeção intraperitoneal (IP) em peixe-zebra adulto é descrito. Ao manusear compostos tóxicos como a doxorrubicina, esse procedimento é mais eficaz do que os dois métodos de IP relatados anteriormente. A técnica foi projetada para ser facilmente adotada por pesquisadores com experiência limitada no modelo de peixe-zebra.

Uma técnica de injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto que minimiza os danos corporais e a mortalidade associada

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado e eficaz para a injeção intravenosa de células ou agentes farmacológicos em peixes-zebra adultos, resultando em enxerto celular aprimorado e aumento das taxas de sobrevivência do peixe-zebra tratado.

Injeção intravenosa otimizada em peixe-zebra adulto

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório de James para injetar dsRNA em fêmeas de mosquitos A. aegypti, que abrigam o vírus da dengue. A técnica para a calibração de agulhas de injeção, manipulando a configuração da injeção, e injetando dsRNA no tórax é ilustrado.

Injeção de dsRNA em Mosquitos Feminino A. aegypti

Após a formação do tubo neural, o neuroepitélio contrai e dobras, enquanto o tubo se enche de líquido cefalorraquidiano embrionárias (eCSF) para formar os ventrículos do cérebro embrionário. Nós desenvolvemos esta técnica de injeção do ventrículo para visualizar melhor o espaço cheio de líquido, em contraste com a forma neuroepiteliais em um embrião vivo.

Zebrafish Injection Ventrículo Cerebral

Este protocolo descreve um procedimento para identificar e dissecar os órgãos do peixe-zebra adulto.

Dissecção de Órgãos do Zebrafish Adulto

Aprenda a realizar injeção intraperitoneal em zebrafish adulto utilizando anestesia com água fria e microseringa. Este método permite estudar a homeostase da glicose sanguínea em Danio rerio.

Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

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