Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

O objetivo geral deste procedimento é injetar uma solução na cavidade peritoneal do peixe-zebra adulto. Neste exemplo, injetaremos glicose em nosso laboratório. Utilizamos este procedimento para estudar a estase da glicose sanguínea.

Isso é realizado primeiramente pesando o peixe para determinar a quantidade de solução a ser injetada por grama de peso corporal. O segundo passo do procedimento é anestesiar o peixe com água fria. O terceiro passo do procedimento é transferir o peixe para a platina do microscópio e injetar.

O passo final do procedimento é devolver o peixe ao seu tanque para recuperação. Em última análise, podem-se obter resultados que mostrem alterações na homeostase da glicose por meio da medição dos níveis de glicose no sangue. Olá, sou Mary Kinkle do Laboratório de Victoria Prince, do Departamento de Biologia e Anatomia Organísmicas da Universidade de Chicago.

Sou Stephanie Ames, também do Laboratório Prince. Hoje vamos mostrar um procedimento para injeção intraperitoneal em peixes-zebra adultos. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a regulação da homeostase da glicose sanguínea.

Então vamos começar. Para preparar os peixes para injeção, comece transferindo-os para um tanque limpo e suspenda a alimentação. Deixe os peixes em jejum por 24 horas para esvaziar o conteúdo do bulbo intestinal e por 72 horas para reduzir a glicose sanguínea aos níveis basais.

A densidade utilizada neste protocolo é de 10 a 12 peixes de sexo misto por aquário de nove litros com três camadas de bolinhas de gude, que aprisionam os ovos para que não sejam comidos. Remova os ovos e os resíduos diariamente por meio de sifonagem do aquário.

A seguir, prepare a solução salina Cortland utilizando 124,1 milimolar de cloreto de sódio, 5,1 milimolar de cloreto de potássio, 2,9 milimolar de pirofosfato de sódio, 1,9 milimolar de sulfato de magnésio hepta-hidratado, 1,4 milimolar de cloreto de cálcio di-hidratado, 11,9 milimolar de bicarbonato de sódio, quatro gramas de polivinilpirrolidona e 1000 unidades USP de heparina, completando o volume final para 100 mililitros com água deionizada; filtre, esterilize e armazene a quatro graus Celsius. Em seguida, dissolva cinco gramas de glicose em 10 mililitros da solução salina Cortland. Para obter uma solução de glicose a 0,5 miligramas por microlitro, filtre, esterilize e armazene a quatro graus Celsius.

Em seguida, prepare a mesa cirúrgica cortando uma esponja macia com aproximadamente 20 milímetros de altura na face plana. Faça um corte de 10 a 15 milímetros de profundidade para segurar o peixe durante a injeção. Coloque a esponja em uma placa de Petri de 60 milímetros e posicione a placa com a esponja dentro da tampa de uma caixa para ponteiras de pipeta P 200.

Em seguida, prepare o microscópio cobrindo sua base com filme plástico e toalhas de papel para proteção. Em caso de derramamentos, coloque a mesa cirúrgica sobre a toalha de papel. Ajuste previamente o foco observando a mesa cirúrgica e focalizando a esponja.

Coloque o dedo sobre a esponja e concentre-se nele para minimizar ajustes focais adicionais quando o peixe estiver na mesa cirúrgica. Após pesar o peixe, encha um béquer de 500 mililitros aproximadamente um terço com água do sistema de criação de peixes e papel-toalha. Em uma balança, transfira cuidadosamente o peixe com o mínimo de água excedente possível para o béquer e registre o peso; transfira cada peixe pesado para um tanque transparente e identificado.

Calcule o volume de injeção com base no peso. Neste exemplo, injetaremos uma solução de 0,5 miligramas por grama de peso corporal de glicose dissolvida em solução salina Cortland. Como nossa solução é de 0,5 miligramas por microlitro, o cálculo é: um vezes o peso do peixe em gramas equivale ao volume a ser injetado em microlitros. Prepare a seringa e os equipamentos relacionados para injeção.

Este protocolo utiliza uma agulha de aço biselada 30G, uma bomba ultramicro e um microprocessador de quatro canais e uma seringa micro de 10 microlitros com nano preenchimento para injeção de glicose; preencha a seringa com glicose a 0,5 miligramas por microlitro dissolvida em solução salina Cortland. É importante remover todas as bolhas de ar da seringa, montar a seringa na bomba ultramicro e programar o volume de injeção para o primeiro peixe inserindo o volume em nanolitros, utilizando o teclado numérico no microprocessador de quatro canais. Por fim, prepare o anestésico de gelo triturando cubos de gelo suficientes feitos com água da instalação de criação de peixes.

Para encher um balde de gelo, coloque a mesa cirúrgica em um recipiente maior, como um recipiente de armazenamento de alimentos de borracha com capacidade de 2,4 litros. Despeje água morna da instalação no recipiente externo e na mesa cirúrgica. Mantenha um tanque reserva de água morna da instalação por perto.

Fixe um termômetro ao recipiente externo. Posicione o recipiente externo do anestésico mais a mesa cirúrgica ao lado do microscópio. Mantenha o balde com pedras de gelo por perto.

Comece a adicionar pedras de gelo até que a temperatura da água atinja 17 graus Celsius. Não deixe a temperatura cair abaixo de 17 graus Celsius nesta etapa. Use uma rede para transferir os peixes para o recipiente externo.

A 17 graus ou ligeiramente abaixo, os peixes normalmente espalham suas nadadeiras peitorais horizontalmente, ofegam e apresentam movimentos auriculares rápidos. Adicione lentamente pedaços de gelo ao recipiente para reduzir a temperatura até 12 graus Celsius ao longo de vários minutos. À medida que a temperatura diminui, o peixe nadará mais lentamente e, finalmente, parará de nadar.

Eventualmente, os movimentos ofegantes cessarão e os movimentos auriculares desacelerarão. O peixe está pronto para a injeção quando não reage ao manuseio. Ao atingir a temperatura necessária, pressione a esponja para saturá-la.

Mantenha os dedos na água fria por tempo suficiente para que não aqueçam o peixe e o retirem da anestesia. Durante o manuseio com os dedos frios, transfira suavemente o peixe para o sulco da esponja. Posicione o peixe com o abdômen voltado para cima e as brânquias no sulco.

Transfira rapidamente a mesa cirúrgica para a platina do microscópio. Trabalhando rapidamente, posicione cuidadosamente a agulha de modo que a ponta aponte cranialmente e fique mais próxima da cintura pélvica do que do ânus. Insira a agulha na linha média entre as nadadeiras pélvicas.

Você deve ser capaz de sentir quando a agulha estiver profunda em relação à parede corporal. Ao inserir a agulha, é possível sentir a parede corporal ceder. Quando a agulha entrar na cavidade abdominal, injete o volume apropriado utilizando o micro para processador.

Use o pedal para injetar um microlitro por grama do peso corporal do peixe; após a injeção, remova a agulha e transfira imediatamente o peixe de volta para o seu tanque de água morna para recuperação. Ao soltar o peixe da esponja sobre a água do tanque, verifique a agulha ao microscópio. Ocasionalmente, uma escama pode ficar aderida e deve ser removida antes da próxima injeção.

Após um período de tempo adequado, prossiga com o seu ensaio subsequente. Descobrimos que um jejum de 72 horas é necessário para reduzir a glicose sanguínea a um nível basal antes da injeção. Nesta figura, os dados do controle não injetado, mostrados em verde, exibem valores de glicose sanguínea não significativamente diferentes dos controles injetados com veículo, mostrados aqui em vermelho.

No entanto, a linha azul exibe os valores de glicose sanguínea para os peixes injetados com glicose e mostra a elevação e queda da glicose circulante. Ao longo do tempo, tanto os animais injetados com glicose quanto os injetados com veículo estavam sob anestesia cirúrgica durante o procedimento de injeção, enquanto os controles não injetados não estavam sob anestesia cirúrgica. Acabamos de mostrar como realizar injeção intraperitoneal em peixes-zebra adultos.

No nosso laboratório, estudamos as alterações na concentração de glicose no sangue em diferentes pontos temporais após a injeção IP de uma solução de glicose. No entanto, esta técnica que acabamos de mostrar pode ser utilizada para injetar a sua solução de interesse. Ao realizar este procedimento, lembre-se de anestesiar o peixe lentamente e manipulá-lo com cuidado.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.