PCR digital baseado em chip em tubo para quantificação de variantes de nucleotídeo único

A reação em cadeia da polimerase digital - ou dPCR - é útil para quantificar variantes de nucleotídeo único - ou SNVs - uma mutação em que a substituição de um único nucleotídeo em uma posição específica no genoma cria duas variações de nucleotídeos ou alelos.

Para iniciar a quantificação usando a técnica de dPCR chip-in-a-tube, pegue uma amostra de DNA contendo SNVs - o alelo mutante e o alelo do tipo selvagem correspondente. Adicione uma mistura contendo uma enzima DNA polimerase termoestável, dNTPs e primers.

Em seguida, adicione sondas de oligonucleotídeos específicos do alelo - marcadas com repórteres de fluorescência de cores diferentes para distinguir entre os alelos - e uma molécula de atenuador. A proximidade do supressor com o repórter suprime sua fluorescência.

Divida a solução nas câmaras de reação de um chip microfluídico. Cada câmara contendo um alelo serve como um recipiente de reação independente.

Coloque o tubo com o chip dentro de um termociclador e inicie a reação. Em alta temperatura, o DNA de fita dupla se desnatura em fitas simples. Abaixe a temperatura para recozer os primers e as sondas de oligonucleotídeos em suas regiões complementares.

A uma temperatura de extensão apropriada, a DNA polimerase estende os primers e cliva a sonda. A distância do extintor permite a emissão de fluorescência do repórter.

Leia os sinais de fluorescência de cores diferentes e crie um gráfico de posição para detectar as câmaras que contêm os alelos.

Para determinar a frequência do alelo mutante - a fração do alelo variante - calcule a proporção de câmaras contendo o alelo mutante versus o alelo do tipo selvagem.