Um ensaio de PCR Duplex Digital para a simultânea Quantificação da

O objetivo geral deste Ensaio de PCR Duplex Digital é quantificar simultaneamente a contaminação fecal geral e associada ao ser humano em águas. Este ensaio pode ajudar a responder perguntas fundamentais no monitoramento da qualidade da água recreativa, como, por exemplo, quanto indicador fecal geral, ou seja, Enterococcus, e, mais importante, qual a quantidade do marcador HF183 associado a fezes humanas está presente nas águas.

A principal vantagem deste ensaio é que ele quantifica dois alvos em uma única reação e, em comparação com a qPCR, elimina a necessidade de executar curvas-padrão e, portanto, os vieses e variabilidades associados. O procedimento será demonstrado por Meredith Raith, nossa Técnica Sênior de Pesquisa. Para iniciar este procedimento, prepare primeiramente concentrações estoque de 100 micromol por litro para todos os iniciadores em Água Grau Molecular e para as sondas em Tampão TEPH 8, conforme descrito no texto do protocolo.

Em seguida, prepare uma Mistura Mestra misturando as quantidades apropriadas de mistura de PCR digital, iniciadores direto e reverso, a sonda fluorescente e água livre de nucleases. Pipete para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para homogeneizar, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução. Como a Mistura Mestra de dPCR é mais viscosa do que a Mistura Mestra convencional de qPCR, é necessário utilizar a técnica de mistura por pipetagem para obter uma solução homogênea.

Isso permite uma quantificação precisa por dPCR na etapa seguinte. Para preparar a Mistura de Ensaios para Geração de Gotas para execução das amostras em duplicata, pipete 36 microlitros da Mistura Mestra em uma placa PCR comum. Em cada uma das Misturas Mestras de 36 microlitros, adicione 12 microlitros de molde de DNA, deixando os poços correspondentes para as réplicas vazios na placa.

Inclua controles positivos para garantir que o ensaio esteja funcionando corretamente. Inclua controles sem molde (No Template Controls ou NTCs) para assegurar que não haja contaminação na placa e para definir posteriormente a linha de base da fluorescência na análise de dados. Antes de preparar o Gerador de Gotas, misture as soluções de ensaio utilizando uma pipeta multicanal para pipetar as misturas para cima e para baixo aproximadamente 15 vezes.

Certifique-se de que a ponta da pipeta permaneça dentro do líquido para evitar a formação de bolhas de ar na mistura. Em seguida, insira o cartucho um, contendo oito poços, em um suporte branco para cartucho e feche o suporte com um clique. O cartucho um está agora firmemente fixado e não pode ser deslocado do suporte durante a geração de gotículas.

Usando uma pipeta multicanal, transfira suavemente 20 microlitros da Mistura de Ensaio para a posição central do cartucho marcada como amostra, sem introduzir bolhas de ar. Pipete 70 microlitros de óleo para Geração de Gotas para o lado esquerdo do cartucho marcado como óleo. Cubra o cartucho com uma junta, certificando-se de que a junta esteja plana e firmemente fixada pelos quatro marcadores na borda do cartucho.

Pressione o botão iluminado em verde no Gerador de Gotas para abrir a porta e inserir o cartucho. Pressione o botão novamente para fechar o gerador. Assim que a porta se fecha, o botão verde é atenuado e a porta não pode ser reaberta.

A geração de gotículas começará imediatamente e continuará por aproximadamente um minuto. Enquanto a geração de gotículas estiver em andamento, coloque o cartucho dois em um segundo suporte branco para cartucho e prepare-o da mesma maneira que o cartucho um. Quando a geração de gotículas for concluída, o botão fracamente iluminado ficará verde.

Abra a porta do Gerador de Gotas, remova o suporte branco do cartucho contendo o cartucho um e coloque-o de lado. Coloque o cartucho dois no Gerador de Gotas. Remova a junta do cartucho um e descarte-a.

Não desencaixe o suporte branco do cartucho, pois essa ação pode romper as gotículas recém-geradas. Usando uma pipeta multicanal ajustada para 40 microlitros, insira as ponteiras na terceira coluna do cartucho marcada como gotículas em um ângulo de 45 graus e pipete lentamente todas as gotículas. Transfira-as para a placa final de PCR colocando a ponteira da pipeta contra a parede do poço aproximadamente na metade da altura e expelindo as gotículas lentamente.

Da mesma forma, quando a geração de gotículas para o cartucho dois estiver concluída, remova a junta do cartucho dois e transfira as gotículas geradas para a placa final de PCR. Coloque uma tampa de folha perfurável sobre a placa e posicione-a em um selador de placas. Ajuste o selador para 180 graus Celsius, pressione o botão de reprodução no selador e realize a vedação por 10 segundos.

Para iniciar este procedimento, coloque a placa final de PCR selada no termociclador. Utilize um termociclador compatível com a placa final de PCR e com velocidade de rampa de temperatura de dois graus Celsius por segundo. Execute o seguinte programa térmico: dez minutos a 95 graus Celsius, seguidos por 40 ciclos de 30 segundos a 94 graus Celsius e 60 segundos a 60 graus Celsius, seguidos por uma etapa de espera de dez minutos a 98 graus Celsius.

Após a conclusão do ciclo térmico, transfira a placa para um Droplet Reader para medição automática da fluorescência em cada gotícula de cada poço. Certifique-se de que as gotículas estejam à temperatura ambiente antes de prosseguir com a leitura de gotículas. Comece abrindo o software acompanhante para configurar a leitura de gotículas.

No menu de configuração padrão que contém um esquema de uma placa de 96 poços vazia, clique duas vezes no poço A1 para abrir o menu contendo três seções: Amostra, Ensaio 1 e Ensaio 2. Na seção Amostra, digite o ID da amostra na caixa rotulada como Nome e marque a caixa à direita indicada como Aplicar. Em seguida, clique no menu suspenso rotulado como experimento, escolha RED para Detecção de Eventos Raros e clique em Enter.

Dirija-se à seção denominada Ensaio 1. Na seção Nome, preencha o campo Ensaio e clique em Enter. Na caixa abaixo rotulada Tipo, clique no menu suspenso, escolha Canal 1 Desconhecido e clique em Enter.

Dirija-se à seção denominada Ensaio 2. Na seção Nome, preencha o Ensaio e clique em Enter. Na caixa abaixo rotulada como Tipo, clique no menu suspenso, escolha Canal 2 Desconhecido e clique em Enter.

Todas as informações das etapas anteriores estão agora presentes no poço A1. Nomeie todos os poços subsequentes que contêm gotículas. Para reduzir o tempo total de configuração, clique em shift ou control para selecionar múltiplos poços simultaneamente. Quando a representação digital da placa espelhar a placa física, pressione OK no canto inferior direito do menu.

No novo menu que aparece na parte superior do esquema da placa, em Modelo, escolha Salvar Como, dê um nome e salve a placa. À esquerda da tela, clique em Executar e selecione o Conjunto de Corantes apropriado na janela pop-up Opções de Execução. A coleta de dados será iniciada e será exibida em tempo real no software.

Quando o leitor terminar e uma caixa aparecer informando que a execução foi concluída, clique em OK. Verifique a separação entre as gotas positivas e negativas. Certifique-se de que os sinais de fluorescência em todas as gotas nos poços de NTC estejam próximos da linha de base. Clique no botão denominado Eventos.

Na parte inferior, clique na caixa denominada Único e, à direita do Histograma apresentado, clique na caixa denominada Total para exibir o número total de microgotas aceitas por poço. Exclua quaisquer poços contendo menos de 10.000 microgotas mantendo a tecla de controle pressionada e clicando nos poços a serem excluídos. Clique no botão denominado Amplitude 1D para definir o limiar de fluorescência em aproximadamente um desvio padrão das microgotas negativas nos poços de controle negativo para ambos os alvos.

No extremo esquerdo da tela, abaixo do Auto Analyze, que mostra dois botões de limite, escolha o ícone à direita que possui uma linha horizontal rosa sólida atravessando-o. Clique na caixa à esquerda de Definir Limite em cada um dos Gráficos de Amplitude e insira os valores apropriados de limite de fluorescência. As concentrações-alvo em cópias por microlitro de reação são então calculadas automaticamente.

Exporte os resultados em um arquivo CSV clicando no botão Exportar no canto superior esquerdo da tela de Amplitude 1D. No arquivo CSV, multiplique a concentração do alvo exportada por quatro para convertê-la de cópia do alvo por microlitro de reação para cópia do alvo por microlitro de molde de DNA. Esta figura compara os formatos duplex e simplex do ensaio de PCR Digital.

Os painéis esquerdo e direito exibem, respectivamente, a quantificação de Enterococcus e HF183, com os coeficientes de correlação correspondentes entre os resultados de duplex e simplex. As linhas contínuas indicam as linhas de regressão e o sombreamento cinza indica os erros padrão correspondentes. Diferentes tipos de amostras são indicados pelos símbolos.

Os resultados são altamente consistentes e frequentemente indistinguíveis, independentemente de Enterococcus e HF183 serem medidos simultaneamente em uma única reação ou separadamente em duas reações. O ensaio de PCR Digital também pode tolerar inibidores em concentrações um a duas ordens de magnitude superiores àquelas toleradas pelos seus equivalentes em qPCR. Esta figura mostra a quantificação por qPCR e por PCR Digital do marcador HF183 em DNA de esgoto limpo adicionado com concentrações crescentes de ácido húmico, que inibe a PCR.

A quantificação esperada de HF183 na ausência de inibidores é definida como uma faixa de confiança de 95% entre as duas linhas tracejadas horizontais. A PCR digital, indicada por triângulos, continua fornecendo quantificação precisa até uma concentração de ácido húmico de 15 nanogramas por microlitro da reação, enquanto a qPCR, indicada por cruzes, começa a subestimar a partir de um nanograma por microlitro e torna-se completamente inibida a cinco nanogramas por microlitro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar este ensaio entérico de Duplex Droplet Digital PCR para HF183 ou outros ensaios semelhantes utilizando diferentes primers e sondas.

Desde o desenvolvimento deste Ensaio Duplex, publicado na revista water research em 2015, desenvolvemos e validamos uma série de outros Ensaios de PCR Digital que visam bactérias indicadoras fecais gerais, marcadores de rastreamento microbiano e patógenos veiculados pela água. Esses Ensaios permitem a quantificação direta e imparcial de seus alvos e estão se tornando alternativas úteis aos ensaios de qPCR no campo de testes de qualidade da água.