Name: Um ensaio de PCR Duplex Digital para a simultânea Quantificação da Enterococcus spp. Ea Human Fecal-associado HF183 marcador no Waters (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Aprenda a realizar PCR digital duplex para quantificar simultaneamente Enterococcus spp. e o marcador HF183 em águas recreativas. Este método elimina curvas padrão, reduzindo vieses e variabilidade na análise da qualidade da água.

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Os autores não têm agradecimentos.

1. Ensaio da preparação da mistura <ol><li> Faça concentrações 100 mmol / L de ações para todos os iniciadores em água de grau molecular e sondas em tampão TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3]. Nota: Sondas para os dois alvos são fluorescente etiquetado com diferentes fluoróforos 7 como indicados na Lista de materiais / equipamentos. </li><li> Prepare mistura principal misturando, por reacção planejado, 12 ul digital de mistura de PCR (2x de ações, ver Lista de materiais / equipamentos), 0,216 mL cada um para a frente e primer, 0,06 mL cada sonda fluorescente reversa e 5.016 mL de água livre de nuclease (concentração final : 900 nm cada iniciador, 250 nM cada sonda). Pipeta cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar ao tomar cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução. </li><li> Pipeta de 18 mL mix master (a partir do passo 1.2) para um tubo de PCR regular ou placa, misturando no modelo de DNA 6 ul (extraído como descrito Previously 13) para fazer mistura de ensaio para a geração de gotículas. Se a execução de amostras em duplicado, pipeta 36 ul de mistura principal e 12 molde de ADN em cada poço. Deixe os poços em duplicado correspondentes vazio sobre o prato. Incluir controlos positivos (ver lista de materiais / equipamentos) e não há controles de modelo (NTC) (ou seja, com água de grau molecular usado como modelo). Nota: O controlo positivo é necessário para assegurar que o ensaio é executado correctamente e o CNT é necessário para assegurar que não há contaminação dentro do prato e para definir a linha de base fluorescente mais tarde na análise de dados. usuários de primeira vez são recomendados para usar ambas as amostras de DNA não diluídas e diluídas. </li></ol> 2. Geração Gota e configuração da placa PCR <ol><li> Misture as misturas de ensaio pipetando cima para baixo aproximadamente 15 vezes usando uma pipeta multicanal. Certifique-se de que a ponta da pipeta permanece dentro líquido para evitar que bolhas em excesso dentro da mistura. </li><li> inscartucho de ert 1 (contendo 8 poços) em um suporte de cartucho branco e clique no suporte do cartucho fechada. Cartucho 1 é agora firmemente no lugar e não pode ser desalojado do suporte enquanto que a geração de gotículas. Usando uma pipeta multicanal, gentilmente transferir 20 l de mistura de ensaio para a posição do meio do cartucho marcado &quot;amostra&quot; sem a introdução de bolhas de ar. </li><li> Pipetar em 70 ul de óleo de geração de gotículas para o lado esquerdo do cartucho (marcado &quot;Óleo&quot;). </li><li> cartucho de tampa com uma junta de vedação para garantir que a junta de vedação é realizada de forma uniforme e plana por a quatro carraças na direcção da extremidade do cartucho. Pressione o botão de luz verde sobre o gerador de gotículas de abrir e coloque o cartucho. Pressione o botão verde iluminado novamente para fechar o gerador. Nota: Uma vez que a porta se fecha, o botão fica esmaecido, a porta não pode ser reaberto e geração de gota começa imediatamente continuando por cerca de 1 min. </li><li> Se fazendo mais de 8 reações, lugar de cartuchos 2 em um segundoo suporte do cartucho e branco preparar da mesma maneira como um cartucho enquanto a geração de gotículas está em andamento para economizar tempo total de instalação. </li><li> Abra a porta do gerador de gotículas quando o botão dim iluminada fica verde, indicando a conclusão da geração de gotículas. Retire o suporte do branco cartucho contendo cartucho 1, posta de lado, eo cartucho de lugar 2 para o gerador de gota. </li><li> Remova a junta de cartucho 1 e descarte. Suavemente transferir o volume total (aproximadamente 40 ul) de gotículas geradas a partir da terceira coluna do cartucho (marcado &#39;Gotas&#39;) para uma placa de PCR final (mantido à temperatura ambiente) durante o ciclo térmico. Nota: Não desmarque suporte do cartucho de branco como a ação pode quebrar as gotículas recém-gerados; abrir apenas o suporte do cartucho após as gotículas de ter sido transferido para a placa de final. </li><li> Repita os passos de 2,1-2,7 para amostras adicionais. </li><li> Quando todas as gotículas são na placa de PCR final, colocar uma perfurávelcobertura de alumínio em cima do prato e coloque-o sobre o selador de placa. Definir o cimento a 180 ° C, prima &#39;Play&#39; no selador e deixe selo para 10 seg. </li></ol> 3. ciclos térmicos e Leitura Gota <ol><li> Colocar a placa selada no termociclador, um compatível com a placa de PCR final utilizada no passo 2.7, e uma velocidade de rampa de temperatura de 2,0 ° C / seg. </li><li> Executar programa térmico como se segue: 10 min a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de 30 seg a 94 ° C e 60 segundos a 60 ° C, seguido de 10 minutos de espera em 98 ° C (opcional: preensão final em 4 ou 15 ° C). </li><li> Após a conclusão dos ciclos, transferir a placa para um leitor de gota para a medição automática da fluorescência em cada gota em cada poço. Alternativamente, armazenar a placa a 4 ° C durante até 3 dias antes da leitura das gotículas. Certifique-se as gotas são à temperatura ambiente antes de prosseguir com a leitura. <ol><li> Abra o software que acompanha a configuração da leitura gota. Dentroo menu padrão &#39;Setup&#39; contendo um esquema de uma placa de 96 poços vazios, clique duas vezes no poço A1 para abrir o menu que contém três seções: &quot;amostra&quot;, &quot;Ensaio 1 &#39;e&#39; Ensaio 2. &#39; </li><li> Na seção &#39;Sample&#39; digite o ID da amostra na caixa chamada &quot;Nome&quot; e pressione enter ou marque a caixa à direita marcado &quot;Aplicar&quot;. Em seguida, clique no menu drop-down rotulados &#39;Experiment&#39; e escolha &#39;RED&#39; (detecção evento raro) e clique em entrar. </li><li> Mover para a seção indicada &quot;Ensaio 1. &#39; Na seção &#39;Nome&#39; preencher o ensaio (por exemplo, Enterococcus) e clique em entrar. Na caixa abaixo &#39;Tipo&#39; rotulado clique no menu drop-down e escolha &quot;Canal 1 Desconhecido&quot; e clique em entrar. </li><li> Mover para a seção indicada &quot;Ensaio 2. &#39; Na seção &#39;Nome&#39; preencher o ensaio (por exemplo, HF183) e clique em entrar. Na caixa abaixo rotulados &#39;Tipo&#39;, clique no menu suspenso um menud Escolha &#39;Canal 2 Desconhecido &quot;e clique em entrar. Toda a informação de Passos 3.3.2 a 3.3.4 está presente em bem A1. </li><li> Nome todos os poços subsequentes contendo gotículas. Para economizar tempo total de instalação, clique em &quot;Shift&quot; ou &quot;Ctrl&quot;, para escolher vários poços simultaneamente. </li><li> Quando a representação digital do prato espelha a placa física, pressione &quot;OK&quot; na parte inferior direita do menu. No novo menu que aparece no topo do esquema placa, na seção &#39;Modelo&#39; escolha &#39;Salvar como&#39; e o nome e salvar o prato. </li><li> À esquerda da tela, clique em &quot;Executar&quot; e escolha apropriada Set Dye em pop-out janela &quot;Opções de Execução&quot; o. A recolha de dados inicia e é exibida em tempo real no software. </li></ol></li></ol> 4. Análise de Dados e Relatórios <ol><li> Quando o leitor está terminada e uma caixa será exibida informando &#39;Run Complete&#39;, clique em &#39;OK&#39;. Nota: O softWare exibe o arquivo de dados final na seção &quot;Analisar&quot; do software. Neste ponto de vista, o software tem todos os poços na placa selecionados e padrões para trama de dados do &#39;2D Amplitude&#39;. </li><li> Verifique a separação entre as gotículas positivos e negativos. Assegure-se que a fluorescência em todas as gotículas nos poços NTC estão perto da linha de base. </li><li> Clique no botão &#39;Eventos&#39;. À direita do histograma apresentado clique na caixa chamada &quot;Total&quot; ea caixa com o nome &quot;único&quot; na parte inferior para exibir o número total de gotículas aceites por poço. Excluir quaisquer poços contendo &lt;10.000 gotículas 7, mantendo a tecla Ctrl e clicando sobre o bem (s) a ser excluído. </li><li> Clique no botão indicado como &#39;1D Amplitude&#39; para definir o limiar de fluorescência a cerca de um desvio padrão (500-700 unidades de fluorescência) acima das gotas negativos em poços NTC para ambas as metas. No lado esquerdo do ecrã under &quot;Analisar Auto &#39;o que mostra dois botões de limite, escolha o ícone à direita que tem uma linha horizontal rosa contínuo que passa por ele. </li><li> Clique na caixa à esquerda de &quot;Threshold Definir &#39;no âmbito de cada um dos gráficos de amplitude e digite os valores de limite de fluorescência apropriados. As concentrações de alvo em cópia por reacção uL são então calculados automaticamente. Nota: Os limiares não precisam ser idênticas para os diferentes alvos. </li><li> Exportar os resultados em um arquivo .csv, clicando no botão &quot;Exportar&quot; no canto superior esquerdo na tela do 1D Amplitude. No arquivo .csv, multiplicar a concentração alvo exportados por 4 a convertê-lo de cópia do alvo (23S gene de Enterococcus spp., Ou o marcador HF183) por reacção ul para copiar da meta per l modelo de DNA. </li></ol>

<ol><li>Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/">http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/</a> (2012).</li>
<li>Boehm, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+forty-one+microbial+source+tracking+methods%3A+A+twenty-seven+lab+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).</li>
<li>Layton, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+human+fecal+anaerobe-associated+PCR-based+assays+in+a+multi-laboratory+method+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platform%2C+reference+material%2C+and+quantification+model+on+enumeration+of+Enterococcus+by+quantitative+PCR+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods.</a> Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).</li>
<li>Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPN+estimation+of+qPCR+target+sequence+recoveries+from+whole+cell+calibrator+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples.</a> J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
<li>Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+for+simultaneous+quantification+of+general+and+human-associated+fecal+indicators+for+water+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment.</a> Water Res. 70, 337-349 (2015).</li>
<li>Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Digital+PCR+for+Absolute+DNA+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification.</a> Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).</li>
<li>Whale, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microfluidic+digital+PCR+and+conventional+quantitative+PCR+for+measuring+copy+number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation.</a> Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+food+and+feed+aamples+with+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR.</a> PLoS One. 8 (5), e62583(2013).</li>
<li>Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf">http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf</a> (2012).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+molecular+community+analysis+methods+for+discerning+fecal+sources+and+human+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste.</a> Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Existem algumas etapas críticas do protocolo. Em primeiro lugar, a mistura das misturas de ensaio pode ser difícil, porque a mistura principal é mais viscoso do que misturas principais qPCR convencionais. vórtex simples pode levar a uma mistura insuficiente, o que conduz por sua vez à distribuição não uniforme de moldes de ADN nas misturas de ensaio e posteriormente nas gotículas. A técnica de mistura-por-pipetagem descrito no protocolo deve ser seguido para garantir a quantificação precisa dPCR. Em segundo lugar, é imp...

Os métodos quantitativos de PCR (qPCR) têm sido amplamente utilizados para a monitorização da qualidade da água de recreio e aplicações de monitorização de origem microbiana, porque eles são mais rápidos, mais flexível e específica em comparação com os métodos baseados em cultura tradicionais. Consequentemente, qPCR é recomendado para a obtenção de resultados de monitorização das águas rápidas para os indicadores fecais gerais, tais como Enterococcus spp. Nos critérios de qualidade revistos USEPA águas de recreio 1. Muitos ensaios qPCR também têm sido desenvolvidos e validados para a identificação de fontes de contaminação fecal em águas ambientais 2. Entre estes, os ensaios HF183 marcadores estão entre os mais utilizados para identificar a contaminação fecal associada a 3 humano. No entanto, os resultados qPCR muitas vezes pode ser tendenciosa, porque dependem de curvas padrão para a quantificação. qPCR quantifica concentrações desconhecidas do alvo em amostras por interpolação seu ciclo de quantificação (CQ) de um standard curva que descreve uma relação linear entre a quantidade Cq e logarítmica de um conjunto de padrões diluído seriadamente. Falta de material de referência confiável e consistente pode, portanto, viés bastante resultados qPCR. Estudos mostraram que os resultados qPCR diferiram em aproximadamente metade de um log usando padrões de diferentes fornecedores 4 e por 2 vezes utilizando diferentes lotes de padrões do mesmo fornecedor 5. A tecnologia digital PCR (dPCR) quantifica uma amostra desconhecida, contando a frequência de positivos em grande número de PCRs em miniatura que são gerados pelo particionamento de um qPCR em massa para milhares ou milhões de nanoliter uniforme ou reações picolitros 6. É referido como PCR gota digitais (isto é, neste artigo) ou PCR câmara digital de, respectivamente, se as divisórias são água-em-óleo de gotículas (isto é, neste artigo) ou pequenas câmaras sobre um chip. A concentração da amostra mais elevada resultará na presença de ADN alvo(PCR daí positiva), numa proporção superior das divisórias, uma relação aproximada pela distribuição de Poisson. Como tal, os resultados binários (PCR positiva ou negativa) são registados e a frequência de gotículas de positivos é usado para calcular as concentrações das amostras desconhecidas directamente através de Poisson aproximação, eliminando a necessidade de uma curva padrão como no qPCR. Esta natureza binária de quantificação PCR digital proporciona vantagens adicionais sobre qPCR 7. Uma vez que a amplificação atrasada pode ainda produzir um PCR positivo, dPCR quantificação seja mais robusto contra inibição que reduz a eficiência de amplificação. Da mesma forma, dPCR quantificação não é afectado pela variabilidade em valores Cq como é qPCR, levando a uma maior precisão da dPCR em comparação com 8-10 qPCR. Além disso, o processo de particionamento garante uma muito pequena quantidade de ADN presente alvo em cada gotícula, minimizando eficazmente competição pelo substrato (durante amplification de alvos diferentes de DNA) que são obstáculos comuns para alcançar duplex (ou seja, um ensaio mede simultaneamente dois alvos de ADN) em qPCR. Como tal, se executado em duplex ou simplex (ou seja, um alvo é medido em um único ensaio) dPCR produz quantificação quase indistinguível de ambos os alvos 7,11. O objetivo do ensaio de PCR digitais (EntHF183 dPCR) descrito neste artigo é a obtenção de quantificação direta simultânea do indicador fecal geral Enterococcus spp. E o marcador HF183 humano-fecal associada a uma melhor precisão, reprodutibilidade e robustez contra a inibição em comparação com seu qPCR homólogos. Este ensaio tem sido usado com sucesso para quantificar a contaminação fecal no ambiente de água doce, água do mar, e vários material fecal 7, mas também pode ser aplicado a quaisquer outros tipos de águas e águas residuais. Este ensaio é uma grande promessa para a análise de sedimentos ou solos devido a eles elevada tolerância à inibição, mas mais testes é necessária devido às complexidades de inibidor mistura nestes tipos de amostras.

<table><tbody><tr><td>Microtubos de baixa ligação</td><td>Costar</td><td>3207</td><td>Para armazenamento de reagentes, amostras/produção de misturas mestras</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>FisherSci</td><td>BP2484-50</td><td></td></tr><tr><td>TE Tampão de pH 8</td><td>FisherSci</td><td>BP2473-100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços Hardshell</td><td>BioRad</td><td>HSP-9601</td><td>Para mistura mestre inicial e inoculação de amostras</td></tr><tr><td>Filme</td> <td>de vedação de alumínioBioRad</td><td>359-0133</td><td>Para selar a placa de amostra</td></tr><tr><td>Gerador de gotículas</td><td>BioRad</td><td>186-3002</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de geração de gotículas</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Suporte de cartucho</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>Junta</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>20 &#956; l pontas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>Para tansferring sample/master mix para cartidge</td></tr><tr><td>200 &#956; l pontas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>Para transferência de gotículas para a placa final Twin.Tec Placa</td></tr><tr><td>Twin.Tec 96 Well Plate</td><td>Eppendorf</td><td>951020320</td><td>Para ciclagem térmica de gotículas finais e leitura</td></tr><tr><td>Folha de selagem térmica perfurável</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td>Para selar a placa Twin.Tec antes do ciclo térmico</td></tr><tr><td>PX1 PCR Plate Sealer</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Thermalcycler</td><td>BioRad</td><td>CFX96 e C1000</td><td>Apenas o termociclador é necessário, sem óptica</td></tr><tr><td>Leitor de gotículas QX100</td><td>Óleo de</td> leitor de gotículas BioRad <td>186-3001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>PCR de gotículas Supermix&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3024</td><td>ou seja a mistura de PCR digital no manuscrito</td></tr><tr><td>Software QuantaSoft (v1.3.2)</td><td>Quantasoft&nbsp;</td><td>QX100&nbsp;</td><td>Para visualizar, analisar e exportar dados ddPCR</td></tr><tr><td>Entero Forward Primer (Ent F1A)</td><td>Operon</td><td>GAGAAATTCCAAACGAACTTG</td><td>Fornecedor alternativo pode ser usado</td></tr><tr><td>Entero Reverse Primer (Ent R1)</td><td>Operon</td><td>CAGTGCTCTACCTCCATCATT</td><td>Fornecedor alternativo pode ser usado</td></tr><tr><td>Entero Probe (GPL813TQ)</td><td>Operon</td><td>[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]</td><td>Fornecedor alternativo pode ser usado, mas o floróforo deve ser FAM</td></tr><tr><td>HF183 Forward Primer ( HF183-1)</td><td>Operon</td><td>ATCATGAGTTCACATGTCCG</td><td>Fornecedor alternativo pode ser usado</td></tr><tr><td>HF183 Reverse Primer (BthetR1)</td><td>Operon</td><td>CGTAGGAGTTTGGACCGTGT</td><td>Fornecedor alternativo pode ser usado</td></tr><tr><td>Sonda HF183 (BthetP1)</td><td>Operon</td><td>[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]</td><td>Fornecedor alternativo pode ser usado, mas o floróforo deve ser HEX (se estiver usando VIC, a compensação matricial apropriada deve ser escolhida. &nbsp;</td></tr><tr><td>Controle positivo</td><td></td><td></td><td>Mistura de DNA genômico E. faecalis e plasmídeo padrão HF183 (encomendado ao IDT). Para métodos detalhados de cultura E. faecalis e sequências do plasmídeo HF183 ordenado, consulte Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Os padrões de ADN Enterococcus (ATCC 29212Q-FZ) também podem ser utilizados no controlo positivo em vez do ADN genómico E. faecalis preparado em laboratório.</td></tr></tbody></table>

um ensaio de pcr duplex digital para a simultânea quantificação da<em&gt; enterococcus spp.</em&gt; ea human fecal-associado hf183 marcador no waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Este manuscrito descreve um ensaio de PCR digitais duplex (EntHF183 dPCR) para a quantificação simultânea de Enterococcus spp. E o marcador HF183 fecal-associado humana. O EntHF183 duplex dPCR (referido como EntHF183 dPCR hereon) ensaio utiliza as mesmas sequências de Iniciador e Sonda como as suas congéneres PCR quantitativo (qPCR) individuais publicados. Da mesma forma, os mesmos procedimentos de filtragem de água e extração de DNA como realizados antes da qPCR são seguidos antes de executar dPCR. No entanto, o ensaio dPCR duplex tem várias vantagens sobre os ensaios de qPCR. Mais importante, o ensaio dPCR elimina a necessidade de execução de uma curva padrão e, por conseguinte, a polarização e variabilidade associada, por quantificação directa dos seus alvos. Além disso, embora a impressão duplex (isto é quantificação simultânea) Enterococcus e HF183 em qPCR muitas vezes leva a subestimação grave do alvo menos abundantes em uma amostra, dPCR fornece quantificação consistente de ambos os alvos, aguçarela quantificada individualmente ou simultaneamente na mesma reacção. O ensaio dPCR também é capaz de tolerar concentrações de inibidor de PCR que são uma a duas ordens de magnitude maior do que as toleradas por qPCR. Estas vantagens tornam o ensaio EntHF183 dPCR particularmente atraente porque fornece simultaneamente informações precisas e repetíveis em ambos contaminação geral e associada humano-fecal em águas ambientais, sem a necessidade de executar dois ensaios qPCR separadas. Apesar das suas vantagens sobre qPCR, o limite de quantificação do ensaio superior dPCR com instrumentação actualmente disponível é aproximadamente quatro ordens de grandeza menor do que a alcançável por qPCR. Por conseguinte, a diluição é necessário para a medição de concentrações elevadas de organismos alvo, tais como aqueles tipicamente observado após a derrames de esgoto.

Um bom EntHF183 duplex dPCR execução deve resultar em número relativamente elevado de gotículas aceites (cerca de 10,000-17,000) e diferença relativamente grande (cerca de 5,000) entre os valores de fluorescência para gotas negativos e positivos 7. Invulgarmente baixo número de gotículas provavelmente indica problemas no processo de geração de gotículas, e um limite de exclusão de 10.000 gotículas é sugerida com base em dados empíricos do sistema dPCR gotícul...

Este manuscrito descreve um ensaio de PCR digital duplex que pode ser utilizado para quantificar simultaneamente Enterococcus spp. E os marcadores genéticos HF183 como indicadores de contaminação fecal humana em geral e associada-em águas de recreio.

Um ensaio de PCR Duplex Digital para a simultânea Quantificação da<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ea Human Fecal-associado HF183 marcador no Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

O objetivo geral deste Ensaio de PCR Duplex Digital é quantificar simultaneamente a contaminação fecal geral e associada ao ser humano em águas. Este ensaio pode ajudar a responder perguntas fundamentais no monitoramento da qualidade da água recreativa, como, por exemplo, quanto indicador fecal geral, ou seja, Enterococcus, e, mais importante, qual a quantidade do marcador HF183 associado a fezes humanas está presente nas águas.A principal vantagem deste ensaio é que ele quantifica dois alvos em uma única reação e, em comparação com a qPCR, elimina a necessidade de executar curvas-padrão e, portanto, os vieses e variabilidades associados. O procedimento será demonstrado por Meredith Raith, nossa Técnica Sênior de Pesquisa. Para iniciar este procedimento, prepare primeiramente concentrações estoque de 100 micromol por litro para todos os iniciadores em Água Grau Molecular e para as sondas em Tampão TEPH 8, conforme descrito no texto do protocolo.Em seguida, prepare uma Mistura Mestra misturando as quantidades apropriadas de mistura de PCR digital, iniciadores direto e reverso, a sonda fluorescente e água livre de nucleases. Pipete para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para homo

a-duplex-digital-pcr-assay-for-simultaneous-quantification

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Ambiente

Nós descrevemos um método multiplex para a detecção de microorganismos em uma amostra usando oligonucleotídeos-coupled partículas fluorescentes. Amplicon de todos os organismos dentro de uma amostra é hibridizada com um painel de sonda acoplada contas. Um instrumento Luminex ou Bio-Plex é usado para consultar cada grânulo para o tipo de grânulo e sinal de hibridização.

Detecção de multiplex de bactérias em amostras clínicas e Complexo Ambiental utilizando Oligonucleotídeos-coupled microesferas fluorescentes

Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá...

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Este protocolo descreve o uso de um tangencial de fibra oca de sistema de ultrafiltração de fluxo concentração da amostra e uma dissociação de calor como passos alternativos para a detecção de...

Uma variante do método EPA 1623 que usa fluxo tangencial ultrafiltração de fibra oca e Passos de calor de dissociação para detectar Waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; E<em&gt; Giardia spp.</em

Neste vídeo, demonstramos a técnica de PCR digital duplex (ddPCR) - uma modificação da técnica tradicional de PCR que é útil na detecção de dois marcadores genéticos diferentes simultaneamente. Uma única reação de PCR é particionada em gotículas emulsionadas do tamanho de nanolitros que são amplificadas independentemente, e a detecção de sinais de amplificação de fluorescência de cores diferentes da fração de gotículas é usada para calcular a concentração inicial das sequências alvo.

PCR digital duplex para quantificação simultânea de marcadores genéticos duplos

Um ensaio de qPCR foi desenvolvido para a detecção de Escherichia coli O157: H7 alvo um marcador genético único, Z3276. A qPCR foi combinado com propidium monoazide (PMA) o tratamento para a detecção de células vivas. Este protocolo foi modificado e adaptado a um formato de placa de 96 poços para uma fácil manipulação e consistente de numerosas amostras...

Detecção de Vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 Células por PMA-qPCR

Um protocolo envolvendo concentração integrada, enriquecimento e detecção colorimétrica de ponto final de patógenos transmitidos por alimentos em grandes volumes de água agrícola é apresentado aqui.  A água é filtrada através de Swabs de Moore modificados (MMS), enriquecidos com meios seletivos ou não seletivos, e a detecção é realizada usando dispositivos analíticos baseados em papel (μPAD) embutidos com substratos colorimétricos indicativos bacterianos.

Papel colorimétrico à base de Detecção de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. E<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; A partir de grandes volumes de água Agrícola

Aqui apresentamos um procedimento para quantificar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis usando PCR quantitativo de transcrição reversa. A recuperação média do vírus das águas subterrâneas com este procedimento padronizado do Método EPA 1615 foi de 20% para o poliovírus e 30% para o norovírus murino.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

O objetivo geral do presente protocolo é para sintetizar nanosensors funcional para o portátil, econômica, e rápida detecção de direcionado especificamente bactérias patogênicas através de uma combinação de relaxação magnética e as modalidades de emissão de fluorescência.

Patógeno de origem alimentar rastreio usando Nanosensor Magneto-fluorescente: Rápida detecção de Escherichia Coli O157: H7

Os ensaios de DNA ambiental requerem um design rigoroso, testes, otimização e validação antes que a coleta de dados de campo possa começar. Aqui, apresentamos um protocolo para levar os usuários através de cada etapa de projeto de um ensaio qPCR específico da espécie, baseado em sonda para a detecção e quantificação de dna de uma espécie-alvo a partir de amostras ambientais.

Desenvolvimento e teste de ensaios quantitativos de PCR específicos para aplicações de DNA ambiental

Este protocolo descreve como construir um sistema de cadeia polimerase de fluxo contínuo baseado em um chip microfluídico e como construir um sistema de eletroforese capilar em laboratório. Apresenta um método simples para a análise de ácidos nucléicos em laboratório.

Amplificação de Escherichia coli em um chip microfluídico de PCR em fluxo contínuo e sua detecção com um sistema de eletroforese capilar

Aprenda a realizar PCR digital duplex para quantificar simultaneamente Enterococcus spp. e o marcador HF183 em águas recreativas. Este método elimina curvas padrão, reduzindo vieses e variabilidade na análise da qualidade da água.

Um ensaio de PCR Duplex Digital para a simultânea Quantificação da Enterococcus spp. Ea Human Fecal-associado HF183 marcador no Waters (Vídeo) | JoVE Journal

Um ensaio de PCR Duplex Digital para a simultânea Quantificação da

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