Name: Um ensaio de PCR Duplex Digital para a simultânea Quantificação da Enterococcus spp. Ea Human Fecal-associado HF183 marcador no Waters (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 14 s
Description: Aprenda a realizar PCR digital duplex para quantificar simultaneamente Enterococcus spp. e o marcador HF183 em águas recreativas. Este método elimina curvas padrão, reduzindo vieses e variabilidade na análise da qualidade da água.

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Os autores não têm agradecimentos.

1. Ensaio da preparação da mistura <ol><li> Faça concentrações 100 mmol / L de ações para todos os iniciadores em água de grau molecular e sondas em tampão TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3]. Nota: Sondas para os dois alvos são fluorescente etiquetado com diferentes fluoróforos 7 como indicados na Lista de materiais / equipamentos. </li><li> Prepare mistura principal misturando, por reacção planejado, 12 ul digital de mistura de PCR (2x de ações, ver Lista de materiais / equipamentos), 0,216 mL cada um para a frente e primer, 0,06 mL cada sonda fluorescente reversa e 5.016 mL de água livre de nuclease (concentração final : 900 nm cada iniciador, 250 nM cada sonda). Pipeta cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar ao tomar cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução. </li><li> Pipeta de 18 mL mix master (a partir do passo 1.2) para um tubo de PCR regular ou placa, misturando no modelo de DNA 6 ul (extraído como descrito Previously 13) para fazer mistura de ensaio para a geração de gotículas. Se a execução de amostras em duplicado, pipeta 36 ul de mistura principal e 12 molde de ADN em cada poço. Deixe os poços em duplicado correspondentes vazio sobre o prato. Incluir controlos positivos (ver lista de materiais / equipamentos) e não há controles de modelo (NTC) (ou seja, com água de grau molecular usado como modelo). Nota: O controlo positivo é necessário para assegurar que o ensaio é executado correctamente e o CNT é necessário para assegurar que não há contaminação dentro do prato e para definir a linha de base fluorescente mais tarde na análise de dados. usuários de primeira vez são recomendados para usar ambas as amostras de DNA não diluídas e diluídas. </li></ol> 2. Geração Gota e configuração da placa PCR <ol><li> Misture as misturas de ensaio pipetando cima para baixo aproximadamente 15 vezes usando uma pipeta multicanal. Certifique-se de que a ponta da pipeta permanece dentro líquido para evitar que bolhas em excesso dentro da mistura. </li><li> inscartucho de ert 1 (contendo 8 poços) em um suporte de cartucho branco e clique no suporte do cartucho fechada. Cartucho 1 é agora firmemente no lugar e não pode ser desalojado do suporte enquanto que a geração de gotículas. Usando uma pipeta multicanal, gentilmente transferir 20 l de mistura de ensaio para a posição do meio do cartucho marcado &quot;amostra&quot; sem a introdução de bolhas de ar. </li><li> Pipetar em 70 ul de óleo de geração de gotículas para o lado esquerdo do cartucho (marcado &quot;Óleo&quot;). </li><li> cartucho de tampa com uma junta de vedação para garantir que a junta de vedação é realizada de forma uniforme e plana por a quatro carraças na direcção da extremidade do cartucho. Pressione o botão de luz verde sobre o gerador de gotículas de abrir e coloque o cartucho. Pressione o botão verde iluminado novamente para fechar o gerador. Nota: Uma vez que a porta se fecha, o botão fica esmaecido, a porta não pode ser reaberto e geração de gota começa imediatamente continuando por cerca de 1 min. </li><li> Se fazendo mais de 8 reações, lugar de cartuchos 2 em um segundoo suporte do cartucho e branco preparar da mesma maneira como um cartucho enquanto a geração de gotículas está em andamento para economizar tempo total de instalação. </li><li> Abra a porta do gerador de gotículas quando o botão dim iluminada fica verde, indicando a conclusão da geração de gotículas. Retire o suporte do branco cartucho contendo cartucho 1, posta de lado, eo cartucho de lugar 2 para o gerador de gota. </li><li> Remova a junta de cartucho 1 e descarte. Suavemente transferir o volume total (aproximadamente 40 ul) de gotículas geradas a partir da terceira coluna do cartucho (marcado &#39;Gotas&#39;) para uma placa de PCR final (mantido à temperatura ambiente) durante o ciclo térmico. Nota: Não desmarque suporte do cartucho de branco como a ação pode quebrar as gotículas recém-gerados; abrir apenas o suporte do cartucho após as gotículas de ter sido transferido para a placa de final. </li><li> Repita os passos de 2,1-2,7 para amostras adicionais. </li><li> Quando todas as gotículas são na placa de PCR final, colocar uma perfurávelcobertura de alumínio em cima do prato e coloque-o sobre o selador de placa. Definir o cimento a 180 ° C, prima &#39;Play&#39; no selador e deixe selo para 10 seg. </li></ol> 3. ciclos térmicos e Leitura Gota <ol><li> Colocar a placa selada no termociclador, um compatível com a placa de PCR final utilizada no passo 2.7, e uma velocidade de rampa de temperatura de 2,0 ° C / seg. </li><li> Executar programa térmico como se segue: 10 min a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de 30 seg a 94 ° C e 60 segundos a 60 ° C, seguido de 10 minutos de espera em 98 ° C (opcional: preensão final em 4 ou 15 ° C). </li><li> Após a conclusão dos ciclos, transferir a placa para um leitor de gota para a medição automática da fluorescência em cada gota em cada poço. Alternativamente, armazenar a placa a 4 ° C durante até 3 dias antes da leitura das gotículas. Certifique-se as gotas são à temperatura ambiente antes de prosseguir com a leitura. <ol><li> Abra o software que acompanha a configuração da leitura gota. Dentroo menu padrão &#39;Setup&#39; contendo um esquema de uma placa de 96 poços vazios, clique duas vezes no poço A1 para abrir o menu que contém três seções: &quot;amostra&quot;, &quot;Ensaio 1 &#39;e&#39; Ensaio 2. &#39; </li><li> Na seção &#39;Sample&#39; digite o ID da amostra na caixa chamada &quot;Nome&quot; e pressione enter ou marque a caixa à direita marcado &quot;Aplicar&quot;. Em seguida, clique no menu drop-down rotulados &#39;Experiment&#39; e escolha &#39;RED&#39; (detecção evento raro) e clique em entrar. </li><li> Mover para a seção indicada &quot;Ensaio 1. &#39; Na seção &#39;Nome&#39; preencher o ensaio (por exemplo, Enterococcus) e clique em entrar. Na caixa abaixo &#39;Tipo&#39; rotulado clique no menu drop-down e escolha &quot;Canal 1 Desconhecido&quot; e clique em entrar. </li><li> Mover para a seção indicada &quot;Ensaio 2. &#39; Na seção &#39;Nome&#39; preencher o ensaio (por exemplo, HF183) e clique em entrar. Na caixa abaixo rotulados &#39;Tipo&#39;, clique no menu suspenso um menud Escolha &#39;Canal 2 Desconhecido &quot;e clique em entrar. Toda a informação de Passos 3.3.2 a 3.3.4 está presente em bem A1. </li><li> Nome todos os poços subsequentes contendo gotículas. Para economizar tempo total de instalação, clique em &quot;Shift&quot; ou &quot;Ctrl&quot;, para escolher vários poços simultaneamente. </li><li> Quando a representação digital do prato espelha a placa física, pressione &quot;OK&quot; na parte inferior direita do menu. No novo menu que aparece no topo do esquema placa, na seção &#39;Modelo&#39; escolha &#39;Salvar como&#39; e o nome e salvar o prato. </li><li> À esquerda da tela, clique em &quot;Executar&quot; e escolha apropriada Set Dye em pop-out janela &quot;Opções de Execução&quot; o. A recolha de dados inicia e é exibida em tempo real no software. </li></ol></li></ol> 4. Análise de Dados e Relatórios <ol><li> Quando o leitor está terminada e uma caixa será exibida informando &#39;Run Complete&#39;, clique em &#39;OK&#39;. Nota: O softWare exibe o arquivo de dados final na seção &quot;Analisar&quot; do software. Neste ponto de vista, o software tem todos os poços na placa selecionados e padrões para trama de dados do &#39;2D Amplitude&#39;. </li><li> Verifique a separação entre as gotículas positivos e negativos. Assegure-se que a fluorescência em todas as gotículas nos poços NTC estão perto da linha de base. </li><li> Clique no botão &#39;Eventos&#39;. À direita do histograma apresentado clique na caixa chamada &quot;Total&quot; ea caixa com o nome &quot;único&quot; na parte inferior para exibir o número total de gotículas aceites por poço. Excluir quaisquer poços contendo &lt;10.000 gotículas 7, mantendo a tecla Ctrl e clicando sobre o bem (s) a ser excluído. </li><li> Clique no botão indicado como &#39;1D Amplitude&#39; para definir o limiar de fluorescência a cerca de um desvio padrão (500-700 unidades de fluorescência) acima das gotas negativos em poços NTC para ambas as metas. No lado esquerdo do ecrã under &quot;Analisar Auto &#39;o que mostra dois botões de limite, escolha o ícone à direita que tem uma linha horizontal rosa contínuo que passa por ele. </li><li> Clique na caixa à esquerda de &quot;Threshold Definir &#39;no âmbito de cada um dos gráficos de amplitude e digite os valores de limite de fluorescência apropriados. As concentrações de alvo em cópia por reacção uL são então calculados automaticamente. Nota: Os limiares não precisam ser idênticas para os diferentes alvos. </li><li> Exportar os resultados em um arquivo .csv, clicando no botão &quot;Exportar&quot; no canto superior esquerdo na tela do 1D Amplitude. No arquivo .csv, multiplicar a concentração alvo exportados por 4 a convertê-lo de cópia do alvo (23S gene de Enterococcus spp., Ou o marcador HF183) por reacção ul para copiar da meta per l modelo de DNA. </li></ol>

<ol><li>Recreational Water Quality Criteria. EPA. , Office of Water. Washington, DC. 820-F-12-058. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/">http://water.epa.gov/scitech/swguidance/standards/criteria/health/recreation/</a> (2012).</li>
<li>Boehm, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+forty-one+microbial+source+tracking+methods%3A+A+twenty-seven+lab+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).</li>
<li>Layton, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+human+fecal+anaerobe-associated+PCR-based+assays+in+a+multi-laboratory+method+evaluation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study.</a> Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platform%2C+reference+material%2C+and+quantification+model+on+enumeration+of+Enterococcus+by+quantitative+PCR+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods.</a> Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).</li>
<li>Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPN+estimation+of+qPCR+target+sequence+recoveries+from+whole+cell+calibrator+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples.</a> J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Digital+MIQE+Guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
<li>Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+for+simultaneous+quantification+of+general+and+human-associated+fecal+indicators+for+water+quality+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment.</a> Water Res. 70, 337-349 (2015).</li>
<li>Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Digital+PCR+for+Absolute+DNA+Quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification.</a> Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).</li>
<li>Whale, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microfluidic+digital+PCR+and+conventional+quantitative+PCR+for+measuring+copy+number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation.</a> Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+food+and+feed+aamples+with+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR.</a> PLoS One. 8 (5), e62583(2013).</li>
<li>Method 1611: Enterococci in Water by TaqMan® Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) Assay. EPA. , Office of Water. Washington, DC. EPA-821-R-12-008. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf">http://water.epa.gov/scitech/methods/cwa/bioindicators/upload/Method-1611-Entercocci-in-Water-by-TaqMan-Quantitative-Polymerase-Chain-Reaction-qPCR-Assay.pdf</a> (2012).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+molecular+community+analysis+methods+for+discerning+fecal+sources+and+human+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste.</a> Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Existem algumas etapas críticas do protocolo. Em primeiro lugar, a mistura das misturas de ensaio pode ser difícil, porque a mistura principal é mais viscoso do que misturas principais qPCR convencionais. vórtex simples pode levar a uma mistura insuficiente, o que conduz por sua vez à distribuição não uniforme de moldes de ADN nas misturas de ensaio e posteriormente nas gotículas. A técnica de mistura-por-pipetagem descrito no protocolo deve ser seguido para garantir a quantificação precisa dPCR. Em segundo lugar, é imp...

Os métodos quantitativos de PCR (qPCR) têm sido amplamente utilizados para a monitorização da qualidade da água de recreio e aplicações de monitorização de origem microbiana, porque eles são mais rápidos, mais flexível e específica em comparação com os métodos baseados em cultura tradicionais. Consequentemente, qPCR é recomendado para a obtenção de resultados de monitorização das águas rápidas para os indicadores fecais gerais, tais como Enterococcus spp. Nos critérios de qualidade revistos USEPA águas de recreio 1. Muitos ensaios qPCR também têm sido desenvolvidos e validados para a identificação de fontes de contaminação fecal em águas ambientais 2. Entre estes, os ensaios HF183 marcadores estão entre os mais utilizados para identificar a contaminação fecal associada a 3 humano. No entanto, os resultados qPCR muitas vezes pode ser tendenciosa, porque dependem de curvas padrão para a quantificação. qPCR quantifica concentrações desconhecidas do alvo em amostras por interpolação seu ciclo de quantificação (CQ) de um standard curva que descreve uma relação linear entre a quantidade Cq e logarítmica de um conjunto de padrões diluído seriadamente. Falta de material de referência confiável e consistente pode, portanto, viés bastante resultados qPCR. Estudos mostraram que os resultados qPCR diferiram em aproximadamente metade de um log usando padrões de diferentes fornecedores 4 e por 2 vezes utilizando diferentes lotes de padrões do mesmo fornecedor 5. A tecnologia digital PCR (dPCR) quantifica uma amostra desconhecida, contando a frequência de positivos em grande número de PCRs em miniatura que são gerados pelo particionamento de um qPCR em massa para milhares ou milhões de nanoliter uniforme ou reações picolitros 6. É referido como PCR gota digitais (isto é, neste artigo) ou PCR câmara digital de, respectivamente, se as divisórias são água-em-óleo de gotículas (isto é, neste artigo) ou pequenas câmaras sobre um chip. A concentração da amostra mais elevada resultará na presença de ADN alvo(PCR daí positiva), numa proporção superior das divisórias, uma relação aproximada pela distribuição de Poisson. Como tal, os resultados binários (PCR positiva ou negativa) são registados e a frequência de gotículas de positivos é usado para calcular as concentrações das amostras desconhecidas directamente através de Poisson aproximação, eliminando a necessidade de uma curva padrão como no qPCR. Esta natureza binária de quantificação PCR digital proporciona vantagens adicionais sobre qPCR 7. Uma vez que a amplificação atrasada pode ainda produzir um PCR positivo, dPCR quantificação seja mais robusto contra inibição que reduz a eficiência de amplificação. Da mesma forma, dPCR quantificação não é afectado pela variabilidade em valores Cq como é qPCR, levando a uma maior precisão da dPCR em comparação com 8-10 qPCR. Além disso, o processo de particionamento garante uma muito pequena quantidade de ADN presente alvo em cada gotícula, minimizando eficazmente competição pelo substrato (durante amplification de alvos diferentes de DNA) que são obstáculos comuns para alcançar duplex (ou seja, um ensaio mede simultaneamente dois alvos de ADN) em qPCR. Como tal, se executado em duplex ou simplex (ou seja, um alvo é medido em um único ensaio) dPCR produz quantificação quase indistinguível de ambos os alvos 7,11. O objetivo do ensaio de PCR digitais (EntHF183 dPCR) descrito neste artigo é a obtenção de quantificação direta simultânea do indicador fecal geral Enterococcus spp. E o marcador HF183 humano-fecal associada a uma melhor precisão, reprodutibilidade e robustez contra a inibição em comparação com seu qPCR homólogos. Este ensaio tem sido usado com sucesso para quantificar a contaminação fecal no ambiente de água doce, água do mar, e vários material fecal 7, mas também pode ser aplicado a quaisquer outros tipos de águas e águas residuais. Este ensaio é uma grande promessa para a análise de sedimentos ou solos devido a eles elevada tolerância à inibição, mas mais testes é necessária devido às complexidades de inibidor mistura nestes tipos de amostras.

<table><tbody><tr><td>Microtubos de baixa ligação</td><td>Costar</td><td>3207</td><td>Para armazenamento de reagentes, amostras/produção de misturas mestras</td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>FisherSci</td><td>BP2484-50</td><td></td></tr><tr><td>TE Tampão de pH 8</td><td>FisherSci</td><td>BP2473-100</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços Hardshell</td><td>BioRad</td><td>HSP-9601</td><td>Para mistura mestre inicial e inoculação de amostras</td></tr><tr><td>Filme</td> <td>de vedação de alumínioBioRad</td><td>359-0133</td><td>Para selar a placa de amostra</td></tr><tr><td>Gerador de gotículas</td><td>BioRad</td><td>186-3002</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de geração de gotículas</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Cartucho</td><td>BioRad</td><td>186-4008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Suporte de cartucho</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>Junta</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>20 &#956; l pontas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>Para tansferring sample/master mix para cartidge</td></tr><tr><td>200 &#956; l pontas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>Para transferência de gotículas para a placa final Twin.Tec Placa</td></tr><tr><td>Twin.Tec 96 Well Plate</td><td>Eppendorf</td><td>951020320</td><td>Para ciclagem térmica de gotículas finais e leitura</td></tr><tr><td>Folha de selagem térmica perfurável</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td>Para selar a placa Twin.Tec antes do ciclo térmico</td></tr><tr><td>PX1 PCR Plate Sealer</td><td>BioRad</td><td>181-4000</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Thermalcycler</td><td>BioRad</td><td>CFX96 e C1000</td><td>Apenas o termociclador é necessário, sem óptica</td></tr><tr><td>Leitor de gotículas QX100</td><td>Óleo de</td> leitor de gotículas BioRad <td>186-3001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>PCR de gotículas Supermix&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3024</td><td>ou seja a mistura de PCR digital no manuscrito</td></tr><tr><td>Software QuantaSoft (v1.3.2)</td><td>Quantasoft&nbsp;</td><td>QX100&nbsp;</td><td>Para visualizar, analisar e exportar dados ddPCR</td></tr><tr><td>Entero Forward Primer (Ent F1A)</td><td>Operon</td><td>GAGAAATTCCAAACGAACTTG</td><td>Fornecedor alternativo pode ser usado</td></tr><tr><td>Entero Reverse Primer (Ent R1)</td><td>Operon</td><td>CAGTGCTCTACCTCCATCATT</td><td>Fornecedor alternativo pode ser usado</td></tr><tr><td>Entero Probe (GPL813TQ)</td><td>Operon</td><td>[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]</td><td>Fornecedor alternativo pode ser usado, mas o floróforo deve ser FAM</td></tr><tr><td>HF183 Forward Primer ( HF183-1)</td><td>Operon</td><td>ATCATGAGTTCACATGTCCG</td><td>Fornecedor alternativo pode ser usado</td></tr><tr><td>HF183 Reverse Primer (BthetR1)</td><td>Operon</td><td>CGTAGGAGTTTGGACCGTGT</td><td>Fornecedor alternativo pode ser usado</td></tr><tr><td>Sonda HF183 (BthetP1)</td><td>Operon</td><td>[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]</td><td>Fornecedor alternativo pode ser usado, mas o floróforo deve ser HEX (se estiver usando VIC, a compensação matricial apropriada deve ser escolhida. &nbsp;</td></tr><tr><td>Controle positivo</td><td></td><td></td><td>Mistura de DNA genômico E. faecalis e plasmídeo padrão HF183 (encomendado ao IDT). Para métodos detalhados de cultura E. faecalis e sequências do plasmídeo HF183 ordenado, consulte Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Os padrões de ADN Enterococcus (ATCC 29212Q-FZ) também podem ser utilizados no controlo positivo em vez do ADN genómico E. faecalis preparado em laboratório.</td></tr></tbody></table>

um ensaio de pcr duplex digital para a simultânea quantificação da<em&gt; enterococcus spp.</em&gt; ea human fecal-associado hf183 marcador no waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Este manuscrito descreve um ensaio de PCR digitais duplex (EntHF183 dPCR) para a quantificação simultânea de Enterococcus spp. E o marcador HF183 fecal-associado humana. O EntHF183 duplex dPCR (referido como EntHF183 dPCR hereon) ensaio utiliza as mesmas sequências de Iniciador e Sonda como as suas congéneres PCR quantitativo (qPCR) individuais publicados. Da mesma forma, os mesmos procedimentos de filtragem de água e extração de DNA como realizados antes da qPCR são seguidos antes de executar dPCR. No entanto, o ensaio dPCR duplex tem várias vantagens sobre os ensaios de qPCR. Mais importante, o ensaio dPCR elimina a necessidade de execução de uma curva padrão e, por conseguinte, a polarização e variabilidade associada, por quantificação directa dos seus alvos. Além disso, embora a impressão duplex (isto é quantificação simultânea) Enterococcus e HF183 em qPCR muitas vezes leva a subestimação grave do alvo menos abundantes em uma amostra, dPCR fornece quantificação consistente de ambos os alvos, aguçarela quantificada individualmente ou simultaneamente na mesma reacção. O ensaio dPCR também é capaz de tolerar concentrações de inibidor de PCR que são uma a duas ordens de magnitude maior do que as toleradas por qPCR. Estas vantagens tornam o ensaio EntHF183 dPCR particularmente atraente porque fornece simultaneamente informações precisas e repetíveis em ambos contaminação geral e associada humano-fecal em águas ambientais, sem a necessidade de executar dois ensaios qPCR separadas. Apesar das suas vantagens sobre qPCR, o limite de quantificação do ensaio superior dPCR com instrumentação actualmente disponível é aproximadamente quatro ordens de grandeza menor do que a alcançável por qPCR. Por conseguinte, a diluição é necessário para a medição de concentrações elevadas de organismos alvo, tais como aqueles tipicamente observado após a derrames de esgoto.

Um bom EntHF183 duplex dPCR execução deve resultar em número relativamente elevado de gotículas aceites (cerca de 10,000-17,000) e diferença relativamente grande (cerca de 5,000) entre os valores de fluorescência para gotas negativos e positivos 7. Invulgarmente baixo número de gotículas provavelmente indica problemas no processo de geração de gotículas, e um limite de exclusão de 10.000 gotículas é sugerida com base em dados empíricos do sistema dPCR gotícul...

Este manuscrito descreve um ensaio de PCR digital duplex que pode ser utilizado para quantificar simultaneamente Enterococcus spp. E os marcadores genéticos HF183 como indicadores de contaminação fecal humana em geral e associada-em águas de recreio.

Um ensaio de PCR Duplex Digital para a simultânea Quantificação da<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ea Human Fecal-associado HF183 marcador no Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

O objetivo geral deste Ensaio de PCR Duplex Digital é quantificar simultaneamente a contaminação fecal geral e associada ao ser humano em águas. Este ensaio pode ajudar a responder perguntas fundamentais no monitoramento da qualidade da água recreativa, como, por exemplo, quanto indicador fecal geral, ou seja, Enterococcus, e, mais importante, qual a quantidade do marcador HF183 associado a fezes humanas está presente nas águas.A principal vantagem deste ensaio é que ele quantifica dois alvos em uma única reação e, em comparação com a qPCR, elimina a necessidade de executar curvas-padrão e, portanto, os vieses e variabilidades associados. O procedimento será demonstrado por Meredith Raith, nossa Técnica Sênior de Pesquisa. Para iniciar este procedimento, prepare primeiramente concentrações estoque de 100 micromol por litro para todos os iniciadores em Água Grau Molecular e para as sondas em Tampão TEPH 8, conforme descrito no texto do protocolo.Em seguida, prepare uma Mistura Mestra misturando as quantidades apropriadas de mistura de PCR digital, iniciadores direto e reverso, a sonda fluorescente e água livre de nucleases. Pipete para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para homogeneizar, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução. Como a Mistura Mestra de dPCR é mais viscosa do que a Mistura Mestra convencional de qPCR, é necessário utilizar a técnica de mistura por pipetagem para obter uma solução homogênea.Isso permite uma quantificação precisa por dPCR na etapa seguinte. Para preparar a Mistura de Ensaios para Geração de Gotas para execução das amostras em duplicata, pipete 36 microlitros da Mistura Mestra em uma placa PCR comum. Em cada uma das Misturas Mestras de 36 microlitros, adicione 12 microlitros de molde de DNA, deixando os poços correspondentes para as réplicas vazios na placa.Inclua controles positivos para garantir que o ensaio esteja funcionando corretamente. Inclua controles sem molde (No Template Controls ou NTCs) para assegurar que não haja contaminação na placa e para definir posteriormente a linha de base da fluorescência na análise de dados. Antes de preparar o Gerador de Gotas, misture as soluções de ensaio utilizando uma pipeta multicanal para pipetar as misturas para cima e para baixo aproximadamente 15 vezes.Certifique-se de que a ponta da pipeta permaneça dentro do líquido para evitar a formação de bolhas de ar na mistura. Em seguida, insira o cartucho um, contendo oito poços, em um suporte branco para cartucho e feche o suporte com um clique. O cartucho um está agora firmemente fixado e não pode ser deslocado do suporte durante a geração de gotículas.Usando uma pipeta multicanal, transfira suavemente 20 microlitros da Mistura de Ensaio para a posição central do cartucho marcada como amostra, sem introduzir bolhas de ar. Pipete 70 microlitros de óleo para Geração de Gotas para o lado esquerdo do cartucho marcado como óleo. Cubra o cartucho com uma junta, certificando-se de que a junta esteja plana e firmemente fixada pelos quatro marcadores na borda do cartucho.Pressione o botão iluminado em verde no Gerador de Gotas para abrir a porta e inserir o cartucho. Pressione o botão novamente para fechar o gerador. Assim que a porta se fecha, o botão verde é atenuado e a porta não pode ser reaberta.A geração de gotículas começará imediatamente e continuará por aproximadamente um minuto. Enquanto a geração de gotículas estiver em andamento, coloque o cartucho dois em um segundo suporte branco para cartucho e prepare-o da mesma maneira que o cartucho um. Quando a geração de gotículas for concluída, o botão fracamente iluminado ficará verde.Abra a porta do Gerador de Gotas, remova o suporte branco do cartucho contendo o cartucho um e coloque-o de lado. Coloque o cartucho dois no Gerador de Gotas. Remova a junta do cartucho um e descarte-a.Não desencaixe o suporte branco do cartucho, pois essa ação pode romper as gotículas recém-geradas. Usando uma pipeta multicanal ajustada para 40 microlitros, insira as ponteiras na terceira coluna do cartucho marcada como gotículas em um ângulo de 45 graus e pipete lentamente todas as gotículas. Transfira-as para a placa final de PCR colocando a ponteira da pipeta contra a parede do poço aproximadamente na metade da altura e expelindo as gotículas lentamente.Da mesma forma, quando a geração de gotículas para o cartucho dois estiver concluída, remova a junta do cartucho dois e transfira as gotículas geradas para a placa final de PCR. Coloque uma tampa de folha perfurável sobre a placa e posicione-a em um selador de placas. Ajuste o selador para 180 graus Celsius, pressione o botão de reprodução no selador e realize a vedação por 10 segundos.Para iniciar este procedimento, coloque a placa final de PCR selada no termociclador. Utilize um termociclador compatível com a placa final de PCR e com velocidade de rampa de temperatura de dois graus Celsius por segundo. Execute o seguinte programa térmico: dez minutos a 95 graus Celsius, seguidos por 40 ciclos de 30 segundos a 94 graus Celsius e 60 segundos a 60 graus Celsius, seguidos por uma etapa de espera de dez minutos a 98 graus Celsius.Após a conclusão do ciclo térmico, transfira a placa para um Droplet Reader para medição automática da fluorescência em cada gotícula de cada poço. Certifique-se de que as gotículas estejam à temperatura ambiente antes de prosseguir com a leitura de gotículas. Comece abrindo o software acompanhante para configurar a leitura de gotículas.No menu de configuração padrão que contém um esquema de uma placa de 96 poços vazia, clique duas vezes no poço A1 para abrir o menu contendo três seções: Amostra, Ensaio 1 e Ensaio 2. Na seção Amostra, digite o ID da amostra na caixa rotulada como Nome e marque a caixa à direita indicada como Aplicar. Em seguida, clique no menu suspenso rotulado como experimento, escolha RED para Detecção de Eventos Raros e clique em Enter.Dirija-se à seção denominada Ensaio 1. Na seção Nome, preencha o campo Ensaio e clique em Enter. Na caixa abaixo rotulada Tipo, clique no menu suspenso, escolha Canal 1 Desconhecido e clique em Enter.Dirija-se à seção denominada Ensaio 2. Na seção Nome, preencha o Ensaio e clique em Enter. Na caixa abaixo rotulada como Tipo, clique no menu suspenso, escolha Canal 2 Desconhecido e clique em Enter.Todas as informações das etapas anteriores estão agora presentes no poço A1. Nomeie todos os poços subsequentes que contêm gotículas. Para reduzir o tempo total de configuração, clique em shift ou control para selecionar múltiplos poços simultaneamente. Quando a representação digital da placa espelhar a placa física, pressione OK no canto inferior direito do menu.No novo menu que aparece na parte superior do esquema da placa, em Modelo, escolha Salvar Como, dê um nome e salve a placa. À esquerda da tela, clique em Executar e selecione o Conjunto de Corantes apropriado na janela pop-up Opções de Execução. A coleta de dados será iniciada e será exibida em tempo real no software.Quando o leitor terminar e uma caixa aparecer informando que a execução foi concluída, clique em OK. Verifique a separação entre as gotas positivas e negativas. Certifique-se de que os sinais de fluorescência em todas as gotas nos poços de NTC estejam próximos da linha de base. Clique no botão denominado Eventos.Na parte inferior, clique na caixa denominada Único e, à direita do Histograma apresentado, clique na caixa denominada Total para exibir o número total de microgotas aceitas por poço. Exclua quaisquer poços contendo menos de 10.000 microgotas mantendo a tecla de controle pressionada e clicando nos poços a serem excluídos. Clique no botão denominado Amplitude 1D para definir o limiar de fluorescência em aproximadamente um desvio padrão das microgotas negativas nos poços de controle negativo para ambos os alvos.No extremo esquerdo da tela, abaixo do Auto Analyze, que mostra dois botões de limite, escolha o ícone à direita que possui uma linha horizontal rosa sólida atravessando-o. Clique na caixa à esquerda de Definir Limite em cada um dos Gráficos de Amplitude e insira os valores apropriados de limite de fluorescência. As concentrações-alvo em cópias por microlitro de reação são então calculadas automaticamente.Exporte os resultados em um arquivo CSV clicando no botão Exportar no canto superior esquerdo da tela de Amplitude 1D. No arquivo CSV, multiplique a concentração do alvo exportada por quatro para convertê-la de cópia do alvo por microlitro de reação para cópia do alvo por microlitro de molde de DNA. Esta figura compara os formatos duplex e simplex do ensaio de PCR Digital.Os painéis esquerdo e direito exibem, respectivamente, a quantificação de Enterococcus e HF183, com os coeficientes de correlação correspondentes entre os resultados de duplex e simplex. As linhas contínuas indicam as linhas de regressão e o sombreamento cinza indica os erros padrão correspondentes. Diferentes tipos de amostras são indicados pelos símbolos.Os resultados são altamente consistentes e frequentemente indistinguíveis, independentemente de Enterococcus e HF183 serem medidos simultaneamente em uma única reação ou separadamente em duas reações. O ensaio de PCR Digital também pode tolerar inibidores em concentrações um a duas ordens de magnitude superiores àquelas toleradas pelos seus equivalentes em qPCR. Esta figura mostra a quantificação por qPCR e por PCR Digital do marcador HF183 em DNA de esgoto limpo adicionado com concentrações crescentes de ácido húmico, que inibe a PCR.A quantificação esperada de HF183 na ausência de inibidores é definida como uma faixa de confiança de 95% entre as duas linhas tracejadas horizontais. A PCR digital, indicada por triângulos, continua fornecendo quantificação precisa até uma concentração de ácido húmico de 15 nanogramas por microlitro da reação, enquanto a qPCR, indicada por cruzes, começa a subestimar a partir de um nanograma por microlitro e torna-se completamente inibida a cinco nanogramas por microlitro. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar este ensaio entérico de Duplex Droplet Digital PCR para HF183 ou outros ensaios semelhantes utilizando diferentes primers e sondas.Desde o desenvolvimento deste Ensaio Duplex, publicado na revista water research em 2015, desenvolvemos e validamos uma série de outros Ensaios de PCR Digital que visam bactérias indicadoras fecais gerais, marcadores de rastreamento microbiano e patógenos veiculados pela água. Esses Ensaios permitem a quantificação direta e imparcial de seus alvos e estão se tornando alternativas úteis aos ensaios de qPCR no campo de testes de qualidade da água.

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Ambiente

Nós descrevemos um método multiplex para a detecção de microorganismos em uma amostra usando oligonucleotídeos-coupled partículas fluorescentes. Amplicon de todos os organismos dentro de uma amostra é hibridizada com um painel de sonda acoplada contas. Um instrumento Luminex ou Bio-Plex é usado para consultar cada grânulo para o tipo de grânulo e sinal de hibridização.

Detecção de multiplex de bactérias em amostras clínicas e Complexo Ambiental utilizando Oligonucleotídeos-coupled microesferas fluorescentes

Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá...

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Papel colorimétrico à base de Detecção de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. E<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; A partir de grandes volumes de água Agrícola

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