Um ensaio de PCR Duplex Digital para a simultânea Quantificação da Enterococcus spp. Ea Human Fecal-associado HF183 marcador no Waters

O objetivo geral deste ensaio de PCR digital duplex é quantificar simultaneamente a contaminação fecal geral e humana associada nas águas. Este ensaio pode ajudar a responder a perguntas-chave no monitoramento da qualidade da água recreativa, como quanto indicador fecal geral, ou seja, Enterococcus e, mais importante, marcador HF183 associado a fezes humanas está nas águas.

A principal vantagem deste ensaio é que ele quantifica dois alvos em uma reação e, em comparação com o qPCR, elimina a necessidade de executar curvas padrão e, portanto, o viés e a variabilidade associados. Demonstrando o procedimento estará Meredith Raith, nossa Técnica de Pesquisa Sênior. Para iniciar este procedimento, primeiro prepare as concentrações de estoque de 100 micromoles por litro para todos os primers em água de grau molecular e sondas em tampão TEPH 8, conforme descrito no texto do protocolo.

Em seguida, prepare um Master Mix misturando quantidades apropriadas de mistura de PCR digital, primers diretos e reversos, a sonda fluorescente e água sem nuclease. Pipete para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução. Como o dPCR Master Mix é mais viscoso do que o qPCR Master Mix convencional, é necessário usar a técnica de mistura por pipetagem para criar uma solução homogênea.

Isso permite uma quantificação precisa do dPCR a jusante. Para fazer a mistura de ensaio para geração de gotículas para amostras em duplicata, pipete 36 microlitros do Master Mix em uma placa de PCR regular. Para cada uma das Master Mixes de 36 microlitros, misture 12 microlitros de molde de DNA, deixando os poços replicados correspondentes vazios na placa.

Inclua controles positivos para garantir que o ensaio esteja funcionando corretamente. Não inclua controles de modelo ou NTCs para garantir que não haja contaminação dentro da placa e para definir a linha de base fluorescente posteriormente para análise de dados. Antes de configurar o Gerador de Gotículas, misture as Misturas de Ensaio usando uma pipeta multicanal para pipetar as misturas para cima e para baixo aproximadamente 15 vezes.

Certifique-se de que a ponta da pipeta permaneça dentro do líquido para evitar bolhas de acesso dentro da mistura. Em seguida, insira o cartucho um contendo oito poços em um porta-cartucho branco e clique no porta-cartucho para fechar. O cartucho um agora está firmemente no lugar e não pode ser desalojado do suporte enquanto gera gotículas.

Usando uma pipeta multicanal, transfira suavemente 20 microlitros da mistura de ensaio para a posição central da amostra marcada com cartucho sem introduzir bolhas de ar. Pipete 70 microlitros de óleo Droplet Generation para o lado esquerdo do cartucho marcado com óleo. Cubra o cartucho com uma junta, certificando-se de que a junta esteja plana e mantida uniformemente pelos quatro tiques em direção à borda do cartucho.

Pressione o botão verde no Gerador de Gotículas para abrir a porta e colocar o cartucho. Pressione o botão novamente para fechar o gerador. Assim que a porta se fecha, o botão verde é escurecido e a porta não pode ser reaberta.

A geração de gotículas começará imediatamente e continuará por aproximadamente um minuto. Enquanto a geração de gotículas estiver em andamento, coloque o cartucho dois em um segundo suporte de cartucho branco e prepare-o da mesma maneira que para o cartucho um. Quando a geração de gotículas estiver concluída, o botão mal iluminado ficará verde.

Abra a porta do Gerador de Gotículas, remova o suporte do cartucho branco que contém o cartucho um e coloque-o de lado. Coloque o cartucho dois no Gerador de Gotículas. Remova a junta do cartucho um e descarte.

Não desclique no suporte do cartucho branco, pois a ação pode quebrar as gotículas recém-geradas. Usando uma pipeta multicanal ajustada para 40 microlitros, insira as pontas na terceira coluna das gotículas marcadas com cartucho em um ângulo de 45 graus e pipete lentamente todas as gotículas. Transfira-os para a placa PCR final, colocando a ponta da pipeta contra a parede do poço aproximadamente na metade e expelindo as gotículas lentamente.

Da mesma forma, quando a geração de gotículas para o cartucho dois estiver concluída, remova a junta do cartucho dois e transfira as gotículas geradas para a placa PCR final. Coloque uma tampa de alumínio perfurável em cima da placa e coloque-a em um selador de placas. Defina o selador para 180 graus Celsius, pressione play no selador e sele por 10 segundos.

Para iniciar este procedimento, coloque a placa PCR final selada no termociclador. Use um termociclador compatível com a placa PCR final e com uma velocidade de rampa de temperatura de dois graus Celsius por segundo. Execute o seguinte programa térmico dez minutos a 95 graus Celsius, seguido por 40 ciclos de 30 segundos a 94 graus Celsius e 60 segundos a 60 graus Celsius, seguidos por uma espera de dez minutos a 98 graus Celsius.

Após a conclusão do ciclo, transfira a placa para um leitor de gotículas para medição automática de fluorescentes em cada gota em cada poço. Certifique-se de que as gotículas estejam em temperatura ambiente antes de prosseguir com a leitura de gotículas. Comece abrindo o software que acompanha para configurar a leitura de gotículas.

No menu de configuração padrão que contém um esquema de uma placa vazia de 96 poços, clique duas vezes no poço A1 para abrir o menu que contém três seções, Amostra, Ensaio 1 e Ensaio 2. Na seção Exemplo, digite a ID do exemplo na caixa rotulada Nome e marque a caixa à direita marcada como Aplicar. Em seguida, clique no menu suspenso denominado experimento, escolha VERMELHO para Detecção de eventos raros e clique em Enter.

Mover para a seção denotada Ensaio 1. Na seção Nome, preencha o Ensaio e clique em Enter. Na caixa abaixo rotulada Tipo, clique no menu suspenso, escolha Canal 1 Desconhecido e clique em Enter.

Mover para a seção denotada Ensaio 2. Na seção Nome, preencha o Ensaio e clique em Enter. Na caixa abaixo rotulada Tipo, clique no menu suspenso, escolha Canal 2 Desconhecido e clique em Enter.

Todas as informações das etapas anteriores estão agora presentes no poço A1.Name em todos os poços subsequentes contendo gotículas. Para economizar o tempo total de configuração, clique em shift ou control para escolher vários poços simultaneamente. Quando a representação digital da placa espelhar a placa física, pressione OK no canto inferior direito do menu.

No novo menu que aparece na parte superior do esquema da placa, no Modelo, escolha Salvar como e nomeie e salve a placa. À esquerda da tela, clique em Executar e selecione o Conjunto de Tintura apropriado na janela pop-out Opções de Execução. A coleta de dados será iniciada e exibida em tempo real no software.

Quando o leitor terminar e aparecer uma caixa informando Execução concluída, clique em OK. Verifique a separação entre as gotículas positivas e negativas. Certifique-se de que as lâmpadas fluorescentes em todas as gotículas nos poços NTC estejam próximas da linha de base. Clique no botão rotulado Eventos.

Na parte inferior, clique na caixa chamada Único e à direita do Histograma apresentado, clique na caixa chamada Total para exibir o número total de gotículas aceitas por poço. Exclua quaisquer poços contendo menos de 10.000 gotículas segurando a tecla de controle e clicando nos poços a serem excluídos. Clique no botão denotado 1D Amplitude para definir o limite fluorescente em aproximadamente um desvio padrão das gotículas negativas nos poços NTC para ambos os alvos.

À esquerda da tela, sob a Análise automática mostrando dois botões de limite, escolha o ícone à direita que tem uma linha horizontal rosa sólida passando por ele. Clique na caixa à esquerda de Definir limite em cada um dos gráficos de amplitude e insira os valores de limite de fluorescência apropriados. As concentrações alvo na reação de cópia por microlitro são então calculadas automaticamente.

Exporte os resultados em um arquivo CSV clicando no botão Exportar no canto superior esquerdo da tela Amplitude 1D. No arquivo CSV, multiplique a concentração alvo exportada por quatro para convertê-la de cópia da reação do alvo por microlitro para cópia do modelo de DNA do alvo por microlitro. Esta figura compara os formatos duplex e simplex do Ensaio de PCR Digital.

Os painéis esquerdo e direito exibem a quantificação de Enterococcus e HF183, respectivamente, com os coeficientes de correlação correspondentes entre os resultados duplex e simplex. As linhas sólidas indicam as linhas de regressão e o sombreamento cinza indica os erros padrão correspondentes. Diferentes tipos de amostras são indicados pelos símbolos.

Os resultados são altamente consistentes e muitas vezes indistinguíveis se Enterococcus e HF183 são medidos simultaneamente em uma reação ou separadamente em duas reações. O ensaio de PCR digital também pode tolerar inibidores em concentrações de uma a duas ordens de magnitude mais altas do que as toleradas por seus equivalentes de qPCR. Esta figura mostra qPCR e quantificação de PCR digital do marcador HF183 em DNA de esgoto limpo enriquecido com aumento nas concentrações de ácido húmico que inibe a PCR.

A quantificação esperada de HF183 na ausência de inibidores é definida como uma interdobra de confiança de 95% entre as duas linhas pontilhadas horizontais. A PCR digital denotada por triângulos continua a fornecer quantificação precisa até uma concentração de ácido húmico de 15 nanogramas por reação de microlitro, enquanto a qPCR denotada por cruzamentos começa a subestimar em um nanograma por microlitro e torna-se completamente inibida em cinco nanogramas por microlitro. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar este ensaio de PCR digital de gotículas duplex HF183 enteral ou outro ensaio semelhante usando diferentes primers e sondas.

Desde o desenvolvimento deste ensaio duplex, publicado na Water Research em 2015, desenvolvemos e validamos uma série de outros ensaios de PCR digital que visam bactérias indicadoras fecais gerais, marcadores de rastreamento microbiano e patógenos transmitidos pela água. Esses ensaios fornecem quantificação direta e imparcial de seu alvo e estão se tornando alternativas úteis aos ensaios de qPCR no campo de testes de qualidade da água.