Detecção de Atividade Neu1 sialidase em Regulação Toll-like receptor de ativação

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar a indução da atividade celular da nova enzima sase em resposta à ligação do ligante ao seu receptor específico. Isso é realizado primeiramente cultivando células em lâminas de vidro circulares de 12 milímetros em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços durante 24 horas. Como segundo passo, as células vivas aderidas à lâmina de vidro são colocadas diretamente em contato com uma mistura previamente preparada de substrato de sase e ligante do receptor, com ou sem inibidores específicos, sobre uma lâmina de microscópio a seguir.

O lâmina de microscópio é imediatamente colocada sob um microscópio de fluorescência para visualizar e capturar digitalmente as imagens fluorescentes. Com o tempo, são obtidos resultados que mostram alterações na atividade da nova enzima na superfície celular associada a células vivas tratadas com ligante, com base na intensidade da fluorescência azul ao redor das células sob microscopia de fluorescência epiluminiscente.

A principal vantagem do uso desta técnica em comparação com métodos existentes, como a análise espectrofotométrica, é o menor consumo de reagentes. Também é possível observar e capturar imagens da atividade da sase em células vivas. Este método pode ser utilizado para responder perguntas fundamentais na área de imunologia, como investigar possíveis interações novas entre ligantes e receptores, além de analisar os efeitos de inibidores específicos de enzimas ou proteínas sobre a ativação de receptores.

O procedimento será demonstrado pelo Dr. Ray Amit e pela Dra. PT Gath, ex-alunos de doutorado do meu laboratório que utilizam este ensaio em seus estudos de pesquisa. Antes de ressuscitar as células de macrófagos congeladas, prepare o meio de cultura utilizando o meio de Eagle modificado estéril filtrado, suplementado com 10% de soro bovino fetal e cinco microgramas por mililitro do antibiótico plasmina. Em seguida, adicione quatro mililitros do meio de cultura a um frasco de cultura celular de 25 centímetros quadrados para cada ampola de células congeladas, retire a ampola de células congeladas do freezer a menos 80 graus Celsius e descongele rapidamente aquecendo com as mãos na capela de contenção de risco biológico estéril.

Isso levará cerca de dois a três minutos. Assim que as células forem descongeladas, utilize uma pipeta estéril de um mililitro para transferi-las rapidamente para o frasco de cultura celular contendo o meio condicionado. Coloque o frasco contendo as células em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, utilizando um microscópio invertido.

Verifique as células diariamente quanto ao crescimento e aderência até que atinjam de 75% a 90% de confluência alguns dias antes do plaqueamento das células para o ensaio SASE. Prepare as lâminas de vidro circulares de 12 milímetros nas quais as células serão semeadas. Dentro do gabinete de contenção de risco biológico.

Coloque as lâminas em uma grande placa de Petri de vidro e esterilize-as mergulhando em etanol 100% por uma hora. Remova o álcool e deixe as lâminas de vidro úmidas expostas ao fluxo de ar estéril filtrado no gabinete sob luz UV por 24 horas ou até que estejam secas para semeadura. Primeiro, esterilize completamente uma pinça curva de aço inoxidável serrilhada de quatro polegadas por meio da chama.

Em seguida, utilize a pinça para colocar cuidadosamente um único lamínula circular estéril em cada poço de uma placa de poliestireno tratada para cultura de tecidos, com fundo plano e 24 poços. Usando uma pipeta estéril de cinco mililitros, remova o meio condicionado DMEM do frasco contendo as células de macrófagos aderentes. Lave as células uma vez com solução salina tamponada com tris estéril 1 x, pH 7,4, para remover qualquer meio contendo soro.

Em seguida, adicione um mililitro de solução salina tamponada com fosfato livre de fosfato e com cálcio, com pH 7,4. Incube as células a 37 graus Celsius por aproximadamente 10 minutos ou até que as células comecem a destacar-se do frasco. Uma vez que as células tenham se destacado, adicione três mililitros de meio condicionado DMEM às células em suspensão.

Em seguida, transfira 0,5 mililitros da suspensão com aproximadamente 500 mil células para cada lâmina circular de vidro de 12 milímetros na placa de 24 poços e incube a placa de cultura de tecidos contendo as células de macrófago a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 24 horas para permitir que as células adiram às lâminas circulares de vidro. O ensaio de atividade de sase será realizado em três condições diferentes em três lâminas separadas de microscópio. Na primeira lâmina, que serve como controle negativo.

Células-controle são expostas ao meio de montagem. O substrato de neuraminidase para ANA e salina tamponada com tris, mas não o ligante do receptor tipo toll LPS. No segundo lâmina, as células são expostas ao meio de montagem da ANA, ao ligante do receptor tipo toll LPS e à salina tamponada com tris.

No terceiro lâmina, as células são expostas ao meio de montagem formado por ANA, LPS Tris, salina tamponada e o inibidor de neuraminidase Tamiflu. Demonstraremos o procedimento apenas para o segundo ensaio, já que os três ensaios diferem somente pela mistura de compostos na lâmina do microscópio. Coloque a lâmina do microscópio sobre a bancada do laboratório e adicione os seguintes compostos em ordem sequencial.

Um microlitro de meio de montagem seguido por um microlitro de forma dois microlitros de LPS e, por fim, três microlitros de solução salina tamponada com tris, pH 7,4. Em seguida, remova o meio de um poço da placa de 24 poços contendo as células. O próximo passo é o aspecto mais difícil deste procedimento, pois você precisa remover o lamínula de vidro circular do poço da placa de cultura de tecidos com a pinça sem quebrá-lo usando uma pinça de quatro polegadas.

Levante suavemente a lamínula circular até o canto do poço e, em seguida, remova-a cuidadosamente e coloque-a com as células voltadas para baixo na mistura da solução. No porta-objetos, leve imediatamente o preparado a um microscópio epifluorescente ajustado para o filtro UV e equipado com câmera digital para captura de imagens fluorescentes. Focalize o microscópio em contraste de fase até visualizar as células e, então, mude para o modo fluorescente.

Adquira imagens das células em modo fluorescente após um minuto, dois minutos e três minutos. Além disso, adquira uma única imagem das células em representação de contraste de fase. Os resultados de um experimento de ensaio sase são mostrados aqui.

Primeiro, como controle negativo, células vivas aderidas a uma lâmina de vidro foram colocadas em contato direto com uma mistura de meio de montagem e substrato de formação de IP. Caso houvesse atividade de sase, o substrato seria hidrolisado para produzir etil lumbeona livre, que apresenta emissão fluorescente em 450 nanômetros após excitação em 365 nanômetros, medida dois minutos após a adição do substrato.

Esta imagem fluorescente mostra ausência de atividade sase ao redor das células. Esta próxima imagem mostra os resultados de um ensaio SASE positivo, no qual células vivas aderidas a uma lâmina de vidro foram colocadas em contato direto com uma mistura contendo meio de montagem, quatro substratos e o ligante LPS do TLR4. O substrato foi hidrolisado pela enzima sase, produzindo etil lumbeona livre, e a imagem fluorescente obtida dois minutos após a adição do substrato e do LPS indica altos níveis de atividade sase ao redor das células.

No entanto, quando células vivas foram colocadas em contato direto com uma mistura de meio de montagem contendo o substrato nano, o ligante do TLR4 LPS e o inibidor da neuraminidase Tamiflu, a atividade da sase foi grandemente reduzida ou não detectada, dependendo da concentração do inibidor. Por fim, este gráfico mostra a concentração inibitória 50% do Tamiflu e do carboxilato de oseltamivir, determinada pela plotagem da redução na atividade da sase em função do log da concentração do agente; a fluorescência média ao redor das células de cada grupo foi medida. Utilizando o software Image J, ao tentar este procedimento, é importante lembrar de cultivar as células em lamínulas circulares de vidro em placas de cultura de tecidos de 24 poços por 24 horas antes de iniciar o ensaio Sade.

Além disso, todos os reagentes utilizados neste ensaio devem ser preparados antes de iniciar o ensaio.