Name: Produção de Extrato de embrião de galinha para o cultivo de células-tronco neurais murino Crest (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprenda a preparar extrato de embrião de galinha de 11 dias para cultivo de células-tronco de crista neural murino. Este protocolo padronizado inclui maceração, centrifugação e filtração para garantir alta qualidade.

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O apoio e aconselhamento de Markus Pajtler Bohrer e Robert foram inestimáveis ​​para a visualização deste protocolo.

Os autores afirmam que experiências em animais foram realizados de acordo com as Comunidades Europeias Directiva do Conselho (86/609/CEE), seguindo as orientações do NIH sobre o cuidado e uso de animais em procedimentos experimentais e os regulamentos estabelecidos pelo animal Institucional Cuidado e Uso Committee (IACUC) da Universidade de Duisburg-Essen (Alemanha). Parte 1: Configurando (não mostrado no vídeo) PREPARAÇÃO DE MATERIAIS E SOLUÇÕES (antes de tomar os ovos da incubadora) <ul><li> Os ovos devem ser incubados em incubadora umidificada por 11 dias a 37 ° C (100 ° F). </li><li> Spray de etanol 70%, placas limpas, precisas pinças limpas, 4 ° C (40 ° F) DMEM estéril frio no gelo e 60 mL seringas esterilizadas </li><li> 50 mL tubos estéreis corning têm de ser half-filled com 4 ° C frio DMEM para misturar os embriões macerados em uma proporção de 1:1 (massa maceradas: DMEM). Assim que os ovos são retirados da dissecção da incubadora embriões de galinha tem que ser iniciado. </li><li> Esterilizar instrumentos de dissecação em autoclave ou no dia da dissecção, mergulhe as ferramentas em etanol 70% por 20 minutos. </li></ul> Parte 2: Dissecção da embriões de galinha (demonstrado no vídeo) <ol><li> Wet os ovos incubados com um spray de etanol 70% por pelo menos 30 segundos e seque-os cuidadosamente com toalhas de papel macio limpo, enquanto não apertar os ovos em excesso. Nota: Recomendamos não dissecar mais de 60 embriões de galinha simultaneamente. </li><li> Abra os ovos com cuidado com o rápido contra uma borda afiada e retirar o embrião com cuidado de não destruir o saco vitelino ou o embrião de galinha em si. </li><li> Pesquisa para o início do cordão umbilical de forma rápida e abrir o embrulho clara, sem destruir o saco vitelino ou qualquer vasinhos. Então dissecar o cordão umbilical com uma pinça precisa limpar. </li><li> Leve o embrião fora do saco vitelino. Nota: Os embriões devem ser decapitado rapidamente (não mostrado no vídeo). </li><li> Coletar os embriões em meio essencial mínimo a 4 ° C. </li></ol> Parte 3: maceração do embriões de galinha <ol><li> Pegue o êmbolo de uma seringa de 60 ml estéril. </li><li> Transferência de cerca de 10 embriões em uma seringa de 60 mL. </li><li> Coloque o êmbolo com cuidado para a seringa para não arriscar perder o material macerado. </li><li> Macerar empurrando o êmbolo. </li><li> Coletar a massa maceradas nos tubos preparados corning half-filled com DMEM, na proporção de 1:1 (massa maceradas: DMEM). Usando 10 embriões um volume de aproximadamente 25 mL é produzido. </li><li> Coloque a mistura em um agitador por 45 min a 4 ° C. </li></ol> Parte 4: A centrifugação do embrião de galinha - Suspensão DMEM <ol><li> Transferir o embrião de galinha - suspensão DMEM nos tubos de centrifugação. </li><li> Adicionar hialuronidase estéril a uma concentração de 1 mg por 25 mg de embrião. </li><li> Tara os tubos de centrifugação com muita precisão. Nota: Esta etapa deve ser realizada com cautela, de centrifugação é executado em alta g-force e danos materiais ou centrífuga poderia ocorrer se usar tubos de desequilibrado. Com alta precisão de acordo com peso do equipamento, quanto as três posições após o ponto decimal para todos os tubos devem ser recebidos, ajustando o montante em falta com DMEM. </li><li> Reduzir a temperatura da centrífuga a 4 ° C. Nota: Além disso, o rotor de centrifugação deve ser armazenado em uma câmara de refrigeração ou geladeira durante a noite. </li><li> Centrífuga 6 horas pelo menos para 180,000 xgx h. Nota: Para resultados superiores em relação à separação das fases de uso único 266,000 xgx h. Se possível, use o ajuste de vácuo. </li></ol> Parte 5: Filtração do Extrato de embrião de galinha Após a centrifugação, três fases podem ser notados: A fase líquida superior dingy com fragmentos de gordura, a fase de líquidos claros no meio e do sedimento no fundo do tubo de centrifugação. Nota: vibração ou movimento rápido da mistura centrifugada tem que ser evitado, pois isso destruiria o resultado da etapa de centrifugação por perder a fase de líquido claro central. Nota: Todos os seguintes passos devem ser realizados em condições estéreis usando um fluxo de ar laminar de bancada: <ol><li> Pipeta a fase clara líquido em um sistema de filtro com poros de 0,45 mM. Em seguida, ligue a bomba de vácuo conectada. Nota: Não toque na pelota no fundo. Isso levaria a uma contaminação do extrato e um bloqueio do sistema de filtragem. </li><li> Transfira o extrato de pré-em um sistema de filtro com poros de 0,22 mm e ligar a bomba de vácuo ligada novamente. </li><li> Alíquota do extrato do embrião atingido pintoestéril em tubos de 15 mL corning. </li><li> Armazenar rapidamente as alíquotas a -80 ° C (-62 ° F). Nota: A CEE durar até dois anos se armazenado a -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+reveals+multipotency+of+some+avian+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells.</a> Nature. 335, 161-164 (1988).</li>
<li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li>
<li>Rao, M. S., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+controlled+in+vitro+differentiation+of+murine+multipotent+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells.</a> J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).</li>
<li>Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+glial+fate+acquisition+of+neural+crest+cells+are+regulated+by+an+interplay+between+the+transcription+factor+Sox10+and+extrinsic+combinatorial+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling.</a> Cell. 128, 3949-3961 (2001).</li>
<li>Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX10+maintains+multipotency+and+inhibits+neuronal+differentiation+of+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells.</a> Neuron. 38, 17-31 (2003).</li>
<li>Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+determination+and+the+control+of+neuronal+identity+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest.</a> Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).</li>
<li>Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+and+cell+fate+specification+in+premigratory+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Review+Bioessays%22%5BJournal%5D)">Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest.</a> Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).</li>
<li>Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+controlling+lineage+specification+in+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Factors controlling lineage specification in the neural crest.</a> Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).</li>
<li>Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+crest+stem+cells%3A+control+of+neural+crest+cell+fate+and+plasticity+by+endothelin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3.</a> Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).</li>
<li>Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+controlled+differentiation+of+neural+crest+stem+cell+lines+using+conditional+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis.</a> Differentiation. 75, 890-891 (2007).</li>
<li>Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+stem+and+precursor+cells+from+fetal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue.</a> Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo é baseado em modificações de procedimentos que têm sido descritas 10,11 no passado. Além de publicações antigas que aqui mostram os passos individuais diferentes do processo mais expandida. Isto suporta o experimentador com detalhes importantes assegurando corretos procedimentos e resultados confiáveis. Além disso, como o processo de dissecção é uma parte essencial de extração CEE descrevemos o procedimento de tomar os embriões fora do saco vitelino em cada detalhe. Há vários pontos importantes...

<table><tbody><tr><td>Ovos de galinha incubados por 11 dias</td><td>Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aspersão desinfetante alcoólica</td><td>Sch&amp;#252;lke Mayr GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEMGlutamax</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa estéril (60 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos estéreis (50; 15 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta estéreis</td><td>Starlab GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase tipo IV-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milipore stericups estéreis (0.45; 0.22 &amp;mu;l)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas estéreis (25; 10; 5 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga L5-50</td><td>Tipo de rotor Ti-45</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

produção de extrato de embrião de galinha para o cultivo de células-tronco neurais murino crest

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

A crista neural surge a partir da neuro-ectoderma durante a embriogênese e persiste apenas temporariamente. Os primeiros experimentos já corrigido células progenitoras pluripotentes a ser parte integrante da crista neural 1. Fenotipicamente, as células-tronco da crista neural (NCSC) são definidos por, simultaneamente, expressando p75 (low-affine nervo receptor do fator de crescimento, LNGFR) e SOX10 durante a sua migração da crista neural 2,3,4,5. Estas células progenitoras podem se diferenciar em células musculares lisas, células cromafins, neurônios e células gliais, bem como a cartilagem melanócitos e osso 6,7,8,9. Para cultivar NCSC in vitro, um especial da crista neural meio de células-tronco (NCSCM) é necessária 10. A parte mais complexa do NCSCM é a preparação de extrato de pinto embrião (CEE), que representa uma fonte essencial de fatores de crescimento para o NCSC, bem como para outros tipos de explantes neural. Outros ingredientes NCSCM lado CEE estão disponíveis comercialmente. Produzindo CCE usando equipamentos de laboratório padrão é de grande importância para saber sobre os detalhes desafiador como o isolamento, maceração, centrifugação, filtração e processos. Neste protocolo, descrevemos técnicas precisas para produzir uma quantidade maximizada de puro e de alta qualidade CEE.

Para cultivar células-tronco da crista neural (NCSC) in vitro, um meio especial (NCSCM) é necessária. Parte essencial da NCSCM é extrair pinto embrião (CEE). Nós aqui descrever as técnicas precisas para produzir uma quantidade maximizada de puro e de alta qualidade CEE, incluindo detalhes como o isolamento, maceração, centrifugação, filtração e processos.

Produção de Extrato de embrião de galinha para o cultivo de células-tronco neurais murino Crest

A crista neural surge a partir do neuroectoderme durante a embriogênese e persiste apenas temporariamente. Experimentos precoces já comprovaram a pluripotência...

Olá, meu nome é Annaa, do laboratório da Professora Ika Egar, do Departamento de Oncologia Pediátrica do Hospital Pediátrico Universitário de Essen, Alemanha. Hoje vamos mostrar um procedimento para preparar extratos de pintinhos embrionários pré-natais com 11 dias de idade. Coloque o DMEM em gelo para resfriá-lo até pelo menos quatro graus Celsius.Utilizamos DMEM com glutamato da GIB co preparado em tubos estéreis, preenchendo-os pela metade. Com o MEM, lave os ovos com etanol a 70% E, utilizando X que foram incubados por 11 dias a 100 graus Fahrenheit em incubadora umidificada. Certifique-se de deixar o etanol ser absorvido por pelo menos 30 segundos.Após aplicar cuidadosamente, seque os ovos com toalhas de papel macias. Limpe uma placa de plástico ou vidro com etanol. Abra os ovos.Coloque cuidadosamente o embrião na placa. Não destrua as EC nem os pequenos vasos. Use conjuntos de agulhas finas e limpas para dissecar os embriões.Primeiro, procure o cordão umbilical. Novamente, não destrua o YAC nem quaisquer vasos pequenos ao procurar o cordão umbilical. Uma vez encontrado o cordão umbilical, siga até sua origem e dissecione-o.Após abrir a embalagem transparente acima do embrião, retire cuidadosamente o embrião do EC sem destruí-lo. Coloque os embriões em meio mínimo essencial estéril sobre gelo. Utilizamos DMEM com glutamato da gyp Co. Retire o êmbolo de uma seringa estéril de 60 mililitros.Coloque aproximadamente 10 embriões de cada vez na seringa. Insira o êmbolo na seringa. Amadureça os embriões empurrando o êmbolo para baixo.Tenha cuidado para não usar muita pressão, caso contrário você perderá o material maturado. Colete os embriões maturados nos tubos preparados na proporção de um embrião para cada 10 embriões MEM. Deve produzir aproximadamente 25 mililitros de volume.Agite a mistura na proporção de um para um de embriões para EMEM durante 45 minutos a quatro graus Celsius. Transfira cuidadosamente a mistura para os tubos de centrífuga. Adicione os dias de hialuronidase rile.Utilizamos os dias R Hay de testículo de bovino da Sigma. Pese os tubos de centrífuga com uma balança analítica especial de alta precisão. É muito importante atentar para as três casas decimais após o ponto.Eles devem ser iguais. Caso contrário, há o risco de problemas com a centrífuga devido à alta velocidade necessária para centrifugar a mistura. Se necessário, corrija as diferenças pipetando a quantidade faltante do MEM. O rotor deveria ter permanecido dentro de uma geladeira ou câmara de resfriamento durante a noite para atingir a temperatura de quatro graus Celsius.Os tubos de centrifugação devem ser fechados muito bem. Caso contrário, há risco de ter problemas para removê-los do rotor. Após a centrifugação, encha o rotor com os tubos e feche-o muito bem com antecedência.Resfrie a centrífuga até quatro graus Celsius. Use vácuo em todos os casos. Aguarde até que o rotor atinja sua velocidade final.Se algo estranho acontecer, pare imediatamente a centrífuga. Pressione o botão de freio para interromper a centrifugação. Isso ocorre após um rotor TI I 45 ter funcionado por seis horas a uma velocidade de 45.000 voltas por minuto.Retire cuidadosamente os tubos. Não os agite em hipótese alguma, pois isso poderia causar um aumento da camada superior de líquido turvo no interior dos tubos. Observe as três fases.No topo, há um líquido esbranquiçado com pedaços gordurosos. No meio, há um líquido transparente, e na parte inferior pode-se observar o pellet. Tenha muito cuidado para coletar a fase clara do meio do tubo.Não toque no precipitado em hipótese alguma, pois isso causaria contaminação do extrato e também obstrução do sistema de filtração. Primeiro, utilize um filtro de 0,45 micrômetro conectado a uma bomba de vácuo. Na segunda etapa, filtre o líquido obtido através de um filtro de 0,22 micrômetro. Também conecte ao bomba de vácuo e coloque o extrato em tubos.Finalmente, armazene os tubos a menos 80 graus Celsius.

production-chick-embryo-extract-for-cultivation-murine-neural-crest

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve o método utilizado para o isolamento de neuroprecursors desenvolvimento do córtex de ratos embrionárias. O procedimento para a remoção de embriões do útero, dissecando o tecido cortical, e digerindo o córtex cerebral isolado é mostrado.

Cultura de rato precursores das células-tronco neurais

Indução neural é o primeiro passo na formação do cérebro. É um mecanismo pelo qual o nó de Hensen (organizador), instrui tecido adjacente a adotar um destino neural, ou seja, dar origem ao sistema nervoso. Este vídeo demonstra um ensaio para a indução neural no embrião de galinha.

Ensaio para Indução Neural no embrião de galinha

Isolamento de crista neural embrionário a partir do tubo neural facilita o uso...

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

Este vídeo demonstra um método para a geração in vitro de células progenitoras neurais (NPCs) a partir de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs). As mESCs são cultivadas em suspensão para formar corpos embrióides (EBs), que são então guiados para se diferenciar em NPCs por meio de tratamento com ácido retinóico em uma cultura aderente.

Uma técnica para gerar células progenitoras neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

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Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

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