$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Faça uma cultura da bactéria Pseudomonas aeruginosa em caldo.
Coloque a cultura em ágar de isolamento e incube para promover o crescimento bacteriano e a produção de alginato, um exopolissacarídeo composto de ácidos urônicos.
Adicione solução salina isotônica ao gramado bacteriano e raspe para coletar as células bacterianas junto com o alginato.
Transfira a suspensão para um tubo, vórtice para dispersar o conteúdo e coloque-o no gelo para evitar a degradação enzimática.
Meça a densidade óptica, ou OD, para determinar a densidade bacteriana.
Adicione a suspensão bacteriana à solução de borato ácido e misture para hidrolisar o alginato em monômeros de ácido urônico.
Adicione carbazol, um reagente cromogênico, e incuba. Sob condições ácidas, o reagente reage com ácidos urônicos para formar complexos coloridos.
Meça a absorbância para quantificar os níveis de ácido urônico, que refletem a concentração de alginato.
Usando uma curva padrão, determine a concentração de alginato e, em seguida, divida-a pela densidade celular bacteriana medida para calcular a produção de alginato por unidade de biomassa.
Para iniciar o ensaio de carbazol de ácido urônico, identifique uma única colônia de uma cultura pura da cepa desejada a ser testada e escolha a colônia usando um palito de dente estéril.
Coloque o palito em um tubo de ensaio de cultura contendo cinco mililitros de PIB. Cresça em uma incubadora shaker a 37 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, adicione uma alíquota do caldo PIB cultivado em uma placa PIA pré-aquecida.
Usando um espalhador de células estéril, espalhe o caldo sobre o prato e cresça a 37 graus Celsius por 24 horas. Usando um controlador de pipeta e uma pipeta estéril de 50 mililitros, adicione cloreto de sódio a 0,85% ao gramado adulto e colete a amostra raspando a placa usando um espalhador de células. Aspirar a amostra com uma pipeta nova de 50 ml e transferir para um tubo de recolha de 50 ml.
Vortex a amostra em alta para misturar e colocar as amostras no gelo. Para medir o OD 600 das amostras, primeiro coloque o espectrofotômetro em branco usando um mililitro de cloreto de sódio a 0,85%. Em seguida, adicione um mililitro da amostra a uma nova cubeta descartável e leia a DO. Repita esta etapa duas vezes para obter um triplicado de leituras para cada amostra.
Agora adicione três mililitros da solução de borato de ácido sulfúrico em tubos de cultura e deixe descansar no gelo. Adicione 350 microlitros da amostra coletada lentamente à mistura ácida nos tubos de ensaio. Depois de um breve vórtice em baixa, adicione 100 microlitros de solução de carbazol e etanol a 0,1% à mistura de amostra ácida.
Tampe o tubo e o vórtice na configuração média por cinco segundos. Em seguida, coloque em banho seco a 55 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, agitar os tubos brevemente em alta velocidade e deixar esfriar por cinco minutos.
Use o tubo com cloreto de sódio a 0,85% como um espaço em branco para o espectrofotômetro. Em seguida, adicione um mililitro da mistura a uma cubeta limpa e leia o OD das amostras a 530 nanômetros em um espectrofotômetro. Preparar uma curva-padrão medindo o OD 530 das diluições em série de concentrações conhecidas de ácido d-manurónico.
Repita duas vezes e extraia uma equação linear dessas leituras. Calcular a concentração de alginato em cada amostra utilizando a curva-padrão e dividir a concentração de alginato da equação linear por OD 600 para obter a quantidade total de alginato por OD 600.