Quantificando o alginato bacteriano usando um ensaio imunoenzimático baseado em anticorpos

Pegue uma microplaca com uma amostra contendo alginato, um exopolissacarídeo protetor produzido pela bactéria Pseudomonas aeruginosa.

Preparar uma diluição em série de um padrão derivado do alginato para quantificar a concentração de alginato da amostra.

Adicione um tampão de revestimento e incube para facilitar a aderência das moléculas à superfície do poço.

Lave para remover moléculas não ligadas.

Incubar com um agente bloqueador para mascarar locais de ligação não específicos.

Lave e incube com anticorpos primários específicos para alginato.

Lave novamente e incube com anticorpos secundários conjugados com enzimas que têm como alvo os anticorpos primários.

Lave e incube com um substrato cromogênico, que a enzima oxida para produzir um produto colorido.

Adicione uma solução ácida que interrompa a reação e melhore a cor para permitir a detecção colorimétrica.

Usando um leitor de microplacas, meça a intensidade da cor.

Crie uma curva padrão a partir das intensidades das diluições padrão e represente graficamente a intensidade da amostra para determinar a concentração de alginato.

Usando uma micropipeta, adicione 50 microlitros da amostra coletada a uma placa de 96 poços não tratada.

Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de revestimento ELISA aos poços. Incube a placa a 37 graus Celsius por duas horas. Usando uma garrafa de esguicho, lave os poços da placa duas vezes com PBS-T, enchendo os poços e drenando-os virando a placa.

Adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio aos poços com uma micropipeta e incube a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave o prato duas vezes com PBS-T como antes. Em seguida, adicione 100 microlitros de anticorpo primário diluído aos poços e incube a 37 graus Celsius por uma a duas horas.

Após a incubação, lave os poços da placa três vezes com PBS-T como antes. Em seguida, adicione 100 microlitros de anticorpo secundário diluído aos poços e incube a 37 graus Celsius por uma a duas horas. Depois de lavar a placa novamente três vezes, use uma micropipeta para adicionar 100 microlitros de solução TMB ELISA.

Incube o prato em temperatura ambiente por 30 minutos no escuro, colocando-o em uma gaveta ou embrulhando em papel alumínio. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de parada. Use um leitor de placas para medir o diâmetro externo em 450 nanômetros.

Produzir uma curva-padrão medindo a DO₄₅₀ de diluições em série de concentrações conhecidas de ácido d-manurónico. Repita as medições duas vezes e extraia uma equação linear. Calcular a concentração de alginato em cada amostra utilizando a curva-padrão e dividir a concentração de alginato da equação linear por OD₆₀₀ para obter a quantidade total de alginato por OD₆₀₀.