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Microbiologia
0 vistas • 4:19 min • February 2nd, 2026
Pegue uma placa de cultura com larvas de Caenorhabditis abrigando as bactérias de interesse que colonizam seu lúmen intestinal.
O prato contém uma cepa bacteriana conhecida como alimento. Deixe as minhocas passar fome para que elas consumam todas as bactérias e entrem em uma fase dormente.
Adicione um substrato e transfira as minhocas para um tubo.
Centrifuge e descarte o sobrenadante.
Adicione uma solução detergente, agite para remover bactérias aderidas à superfície, centrifuge novamente e descarte o sobrenadante.
Repita a lavagem e depois transfira as minhocas para uma placa de cultivo fresco.
Permita que o rastejamento remova bactérias alimentares frouxamente ligadas da superfície e do lúmen intestinal, mantendo as bactérias de interesse que colonizam o intestino de forma estável.
Repita a etapa de transferência e de rastejar para garantir a remoção completa das bactérias alimentares.
Adicione o meio, transfira os vermes para um vidro de relógio e dissece para expor seus intestinos.
Dissecar os intestinos que contêm as bactérias de interesse, coletá-los em tubos cheios de água e congelar para uso futuro.
Para privar os vermes e reduzir o número de bactérias OP50-1, incube os nematoides a 20 graus Celsius por três a quatro dias. Adicione 5 mililitros do meio M9 à placa de minhocas recentemente famintas, e então transfira o meio e os vermes M9 para um tubo centrífugo estéril de 15 milímetros para girar a 1.000 vezes g por 30 segundos em temperatura ambiente.
Remova o sobrenadante antes de lavar as minhocas cinco vezes com 10 mililitros do M9 contendo 0,05% Triton X-100 em um Nutator por 20 minutos. Após a última lavagem, remova o sobrenadante sem perturbar o pellet em 100 microlitros da solução e transfira o M9 e as minhocas para uma placa NGM de 6 centímetros sem semeadura. Deixe o prato secar enquanto as minhocas se movem por 20 minutos para ajudar a remover o OP50-1 da cutícula e do intestino.
Quando a placa estiver seca, repita o procedimento adicionando 250 microlitros do M9 e transferindo as minhocas para uma nova placa NGM de 6 centímetros sem semear para permitir que as minhocas rastejem enquanto a placa seca.
Após 20 minutos, adicione 250 microlitros do M9 à placa e transfira 100 microlitros do M9 junto com minhocas para um vidro de relógio limpo.
Depois, decapite os nematoides usando uma agulha de seringa calibre 26 enquanto segura a minhoca com outra agulha de seringa calibre 26.
Uma vez decapitado, o intestino, uma massa granular e a gônada transparente naturalmente se afastam do corpo do nematoide, então cortam um pedaço do intestino exposto e transferem um único intestino dissecado para um tubo de PCR de 0,5 mililitros contendo 10 microlitros de água estéril. Repita o procedimento para coletar intestinos de pelo menos cinco animais diferentes em tubos PCR.
Congele os tubos de PCR a menos 80 graus Celsius por no mínimo 5 minutos. Descongele as amostras intestinais antes de prosseguir com PCR e sequenciamento para identificação.