Medição da Indução Espontânea de Fagos em Bactérias Lisogênicas ao Longo do Tempo

Colete uma cultura de crescimento noturno de uma bactéria lisogênica, na qual a maioria das células abriga DNA de fago em estado latente integrado ao seu genoma.

Inocule-o em meio fresco e incube.

Algumas bactérias sofrem indução espontânea, entrando no ciclo lítico, no qual o DNA do fago é excisado, replicado e as proteínas virais são produzidas.

Fagos infecciosos recém-montados são liberados através da lise celular.

Coletar amostras de cultura em intervalos definidos.

Para quantificar os lisogênicos viáveis não induzidos, aplique diluições seriadas de cada amostra em uma placa de ágar e incube.

Conte as colônias para calcular as unidades formadoras de colônia (UFCs).

Para quantificar fagos infectivos, aplique as mesmas diluições em uma placa de ágar com antibiótico previamente semeadas com células hospedeiras indicadoras resistentes ao antibiótico. Como os lisogênicos são sensíveis ao antibiótico, apenas os hospedeiros resistentes podem crescer.

Os fagos infectam e lisam células, formando placas claras.

Conte as placas para calcular as unidades formadoras de placa (UFPs). Valores mais baixos de UFPs indicam menos eventos de indução espontânea.

Trace as UFCs e UPFs ao longo do tempo. Durante a fase exponencial inicial do crescimento bacteriano, as UPFs são as menores em relação às UFCs, indicando indução espontânea mínima de fagos.

Para começar, prepare culturas frescas de lisogênio e de hospedeiro indicador inoculando as culturas mantidas durante a noite em 100 mililitros de LB na proporção de 1:100. Incube a 37 graus Celsius com agitação a 180 rpm.

Para monitorar o crescimento do lisogênico, colete uma amostra de um mililitro a cada hora a partir do momento da inoculação, durante oito horas. Dilua a cultura seriamente, adicionando 100 microlitros em 900 microlitros do meio LB. Vortexe na velocidade máxima e continue a série de diluições de 10 elevado a menos um até 10 elevado a menos nove.

Deposite 10 microlitros da diluição necessária em uma placa de ágar LB. Deixe secar e incube a 30 graus Celsius por 18 a 24 horas. Após a incubação, conte o número de colônias e calcule o número de células bacterianas viáveis utilizando a fórmula fornecida.

Em seguida, para enumerar as partículas de fago infectivas na amostra temporal, adicione 100 microlitros de células hospedeiras indicadoras resistentes à rifampicina em fase logarítmica ao ágar superior fundido, juntamente com rifampicina. Aplique 10 microlitros da cultura do lisogênio diluída em série sobre a camada de ágar superior inoculada. Deixe secar e incube a 37 graus Celsius por 18 a 24 horas.

Após a incubação, conte o número de placas e calcule as partículas de fago infecciosas utilizando a fórmula fornecida.