Fabricação de um dispositivo micro para a compartimentação de Neuron Soma e axônios

Bem-vindo ao laboratório do Dr.Newly John. O John Lab é especializado na engenharia de plataformas microfluídicas para aplicações biológicas. Neste vídeo, demonstraremos a produção e utilização de um dispositivo microfluídico projetado para compartimentalização e cultura de neurônios primários.

O dispositivo de neurônio foi publicado pela primeira vez na Nature Methods em agosto de 2005. Desde a sua introdução, o dispositivo neurônio tem sido amplamente utilizado por colaboradores em todo o mundo. O dispositivo de neurônio consiste em um pedaço de PDMS que foi fundido em um wafer de silício contendo um padrão SUA do dispositivo, que foi previamente criado por fotolitografia.

O dispositivo possui três características principais, quatro reservatórios, oito milímetros de diâmetro, dois canais principais cada um com 1,5 milímetro de largura, sete milímetros de comprimento e cem mícrons de altura e micro ranhuras, com 10 micrômetros de largura e três micrômetros de altura que unem os dois canais principais. As micro ranhuras podem variar em comprimento de 150 mícrons a 900 mícrons, embora o comprimento padrão de escolha seja de 450 mícrons. Observando o dispositivo de forma que os canais principais e os micro sulcos fiquem na vertical, podemos ver que os reservatórios à esquerda dos sulcos estão conectados através dos canais principais, assim como os reservatórios à direita.

Esse recurso permite que o líquido flua pelo canal principal, o que é um recurso importante, possibilitando o carregamento de células e a troca de meios. O dispositivo de neurônios tem três grandes vantagens sobre as plataformas tradicionais de cultura de tecidos. Primeiro, permite a compartimentalização de corpos celulares ou soma e os axônios Com o dispositivo de neurônios, é possível obter frações axonais puras.

O tamanho e o comprimento das micro ranhuras permitem que os axônios passem pelo outro canal principal, evitando que os corpos da serra se cruzem. Número dois, devido ao design do dispositivo e aproveitando a pressão hidrostática, é possível submeter o lado da célula e/ou o lado do axônio do dispositivo a tratamentos separados, simplesmente mantendo o volume e os reservatórios mais altos de um lado do dispositivo em relação ao outro. E número três, a fração axonal pura do dispositivo pode ser cortada por sucção a vácuo, permitindo ao pesquisador estudar e observar a regeneração axonal.

A pesquisadora Hina Lee agora demonstrará a preparação do dispositivo de neurônios microfluídicos. Um wafer de silício de três Ang com um padrão feito de SU oito por uma fotolitografia é usado para moldar o molde microfluídico poli dimetil Sloane PDMS. Referimo-nos ao wafer de silício padrão SUA como moldes mestres ou simplesmente mestres.

O PDMS é misturado com agente de cura em uma relação peso por peso de 10 para um. Ou seja, por exemplo, 15 gramas de PDMS por 1,5 gramas de agente de cura. O PDMS é então bem misturado e despejado no wafer de silício.

O wafer de silício está contido em uma placa de Petri de poliestireno de 10 centímetros. São necessários aproximadamente 12 gramas a 15 gramas de PDMS para cobrir os MAs com uma espessura de aproximadamente quatro milímetros. O mestre com o PDMS é então colocado em um desidratado a vácuo com a tampa fora da placa de Petri e o vácuo é aplicado.

Isso é feito para ajudar a remover as bolhas de ar do PDMS que foram introduzidas durante a agitação do agente de cura. Demora aproximadamente 15 minutos para que as bolhas de ar sejam removidas. O mestre com PDMS é removido do dessecador após 15 minutos no dessecador a vácuo.

Ainda existem algumas bolhas restantes no mestre PDMS. Uma pistola de ar com filtro de 0,45 mícron é usada para remover quaisquer bolhas restantes. O mestre é então colocado em uma placa quente de 80 graus por uma hora para curar.

Se um dessecador a vácuo não estiver disponível, o mestre pode ser deixado em temperatura ambiente por várias horas. As bolhas de ar acabarão se dissipando por conta própria. Se nenhuma placa quente estiver disponível, o PDMS curará à temperatura ambiente após 24 horas.

É importante certificar-se de que o mestre está nivelado durante o processo de cura. Uma vez que o PDMS é curado no mestre, ele é levado para um capuz limpo usando uma lâmina cirúrgica. É feito um círculo cortado ao redor do perímetro dos dispositivos.

É importante que, quando se insere a lâmina no PDMS, faça contato com o wafer de silício, mas não coloque muita pressão no wafer ou então o mestre irá rachar com um círculo cortado em toda a volta dos dispositivos. Existem quatro dispositivos para cada mestre de silício de três polegadas. O PDMS é cuidadosamente retirado do mestre.

Isso pode ser iniciado girando suavemente a lâmina cirúrgica à medida que ela é inserida no corte anterior. É muito fino com os dispositivos PDMS no molde. Os reservatórios voltados para cima são perfurados no dispositivo usando um punção de biópsia de tecido de oito milímetros.

Os detritos deixados no perfurador são empurrados para fora com uma haste. Os dispositivos são então esquartejados e o excesso de PDMS cortado para que o dispositivo se encaixe perfeitamente em uma tampa Corning. O vidro número um de 24 milímetros por 40 milímetros de ar nitrogênio é usado para soprar qualquer excesso de detritos.

Detritos teimosos também podem ser removidos usando fita de vinil 3M Scotch Brand 4 7 1. Os dispositivos limpos agora estão prontos para a ligação de plasma. Um limpador de plasma herrick é usado para unir os dispositivos de neurônios às lamínulas brevemente.

Os dispositivos e as lamínulas são colocados em uma bandeja, e a bandeja será então colocada no limpador de plasma e em uma bomba de vácuo usada para evacuar o ar da câmara. É importante observar que os dispositivos PDMS são colocados com a face para cima. Ou seja, com o design voltado para cima para que eles sejam expostos ao gás de plasma.

Depois que a pressão de vácuo atinge 300, a energia militorr é colocada na bobina elétrica e ajustada para alta. Tudo está rachado na porta para deixar um pouco de ar entrar na câmara, o que ajudará a gerar o plasma. Os dispositivos e a lamínula são tratados com plasma por dois minutos.

Observe a cor roxa na câmara. Esse é o plasma real. A bobina elétrica cria plasma, que é um gás parcialmente ionizado que consiste em elétrons, íons e atos ou moléculas neutras.

O plasma cria espécies reativas na superfície do vidro e do dispositivo, que quando colocadas juntas formarão uma ligação permanente. O plasma também torna a superfície hidrofílica, o que ajuda a facilitar a adição de líquidos. O limpador de plasma também esteriliza os dispositivos.

Após o tratamento do plasma por dois minutos, a energia no vácuo é desligada e o ar é conduzido para a câmara. Os serviços tratados com plasma do vidro e do dispositivo microfluídico são montados em contato um com o outro em uma bancada limpa. Os dispositivos são então colocados em um prato estéril de 60 milímetros.

As superfícies tratadas com plasma do vidro e do dispositivo formam uma ligação irreversível apertada. Dentro de 10 minutos após a ligação do plasma, o dispositivo é ao vidro poliol lisina é adicionado ao dispositivo. Após 10 minutos, a hidrofilicidade do dispositivo diminuirá.

Dificultando a entrada do PLL no dispositivo. É importante verificar se há bolhas de ar no dispositivo após a adição de PLL. Um método fácil de remover as bolhas de ar presentes é usar uma pipeta P 200 cheia de 100 microlitros de líquido.

Neste caso, PLL coloque a ponta diretamente na abertura do canal principal e, em seguida, pressione o P 200 com força. Isso pode precisar ser repetido várias vezes, mas eventualmente a força da pipeta expulsará as bolhas. Os dispositivos contendo PLL podem incubar durante a noite e uma incubadora de cultura de tecidos padrão a 37 graus com 5% de CO2.

Após 24 horas de incubação com PLL, os dispositivos são enxaguados duas vezes rapidamente com água deionizada em autoclave. Durante esse processo, o líquido nunca é totalmente removido dos canais principais, apenas dos reservatórios. A remoção do líquido dos canais principais introduzirá bolhas.

Após dois enxágues rápidos, os dispositivos são preenchidos com água deionizada em autoclave mais uma vez e colocados de volta na incubadora por um período mínimo de três horas ou durante a noite. No dia seguinte, depois que os dispositivos foram incubados com água durante a noite ou por um período mínimo de três horas, eles são novamente levados para o gabinete de biossegurança e enxaguados duas vezes com água deionizada. Em seguida, meios basais neurais contendo os suplementos necessários, B 27 e glutamato para cultura de neurônios primários de ratos são adicionados aos dispositivos.

Os dispositivos são então colocados de volta na incubadora para uso futuro. Os dispositivos agora estão prontos para acomodar neurônios. Neste vídeo, demonstramos a técnica de litografia suave, que usamos para fabricar nossos dispositivos de neurônios.

Esses dispositivos podem ser usados para cultivar neurônios e outros tipos de células de interesse. A principal vantagem desses dispositivos é a capacidade de separar e compartimentar a cultura dos corpos celulares dos neurônios de um lado do dispositivo de uma fração axonal pura do outro lado do dispositivo. No próximo vídeo, mostraremos como preparamos os neurônios corticais do rack fetal E 18 e como carregamos as células no dispositivo.

Então é isso do John Lab. Obrigado por assistir.