Name: Fabricação de um dispositivo micro para a compartimentação de Neuron Soma e axônios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprenda a fabricar dispositivos microfluídicos de PDMS para compartimentalizar somas e axônios de neurônios em cultura. Esta técnica de litografia flexível permite estudar regeneração neural com precisão.

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Parte 1: Preparando o dispositivo neurônio microfluídicos <ol><li> A 3 &quot;wafer de silício com um padrão feito de SU-8 por fotolitografia é usado para lançar o Polidimetilsiloxano molde (PDMS) microfluídicos. Referimo-nos à SU-8 padrão wafer de silício como moldes mestre, ou&quot; mestres &quot;. </li><li> PDMS é misturado com agente de cura em aw / w proporção de 10:1, ou seja, para 10 gramas de PDMS, 1 grama de agente de cura é adicionado a ele. </li><li> O PDMS é então misturado bem e derramou sobre o wafer de silício. O wafer de silício é contido dentro de um prato de poliestireno de 10 centímetros de Petri. Demora cerca de 12 g a 15 g de PDMS para cobrir o mestre com uma espessura de cerca de 4 mm. </li><li> O mestre com o PDMS é então colocada em um dessecador a vácuo com a tampa da placa de Petri, e de vácuo é aplicado. Isto é feito para ajudar a remover bolhas de ar do PDMS que foram introduzidas durante a mexer no do agente de cura. Demora cerca de 15 minutos para as bolhas de ar a ser removido. </li><li> O mestre com PDMS é removido do dessecador. Uma pistola de ar com um filtro de 0,45 hm é usado para remover as bolhas restantes. </li><li> O mestre é então colocado em uma placa de 80 ° C quente por uma hora para a cura. </li></ol> Nota: Se um dessecador a vácuo não estiver disponível, o mestre pode ser deixado em temperatura ambiente por várias horas. As bolhas de ar eventualmente se dissipar por conta própria. Se um prato quente não está disponível, o PDMS cura à temperatura ambiente após 24 horas. Nota: Também é importante certificar-se que o mestre é o nível durante o processo de cura. Parte 2: Cortar o neurônio dispositivo micro <ol><li> Uma vez que o PDMS é curado no mestre, ele é levado para uma capa limpa. </li><li> Usando uma lâmina cirúrgica, um círculo é cortado em todo o perímetro dos dispositivos. Quando alguém insere a lâmina para o PDMS, é importante fazer contato com o wafer de silício, mas para não colocar demasiada pressão sobre a bolacha, senão o mestre crack. </li><li> Com um círculo cortado a toda a volta os dispositivos (existem 4 dispositivos por cada 3 Mestre do Silício &quot;), o PDMS é cuidadosamente levantado do mestre. Isto pode ser iniciado por gentilmente torcendo a lâmina cirúrgica, uma vez que é inserido no corte antes . </li><li> Em seguida, os reservatórios são perfurados para o dispositivo usando um 8 milímetros de tecido da biópsia do perfurador. </li><li> Os dispositivos são, então, esquartejado e PDMS excesso aparado para que o dispositivo vai caber perfeitamente na tampa do Vidro de Corning (No. 1) 24 mm x 40 mm. Nitrogênio do ar é usado para afastar qualquer excesso de detritos. Os restos teimosos também pode ser removido usando 3M Scotch Marca fita de vinil 471. </li></ol> Parte 3: Plasma ligação a dispositivos para lamínulas de vidro. <ol><li> Cleaner plasma é usado para colar A Harrick os dispositivos neurônio para o lamínulas. Resumidamente, os dispositivos são colocados no limpador de plasma e uma bomba de vácuo é usada para evacuar o ar da câmara. </li><li> Após a pressão de vácuo atingiu 300 milliTorr, o poder está ligado à bobina elétrica e ajustada para alta. </li><li> A bobina elétrica cria um plasma &quot;, um gás parcialmente ionizado constituído de elétrons, íons e átomos ou moléculas neutras&quot; - <a href="http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php">http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php</a> , fora das moléculas de ar remanescente na câmara. O plasma gera espécies reativas na superfície do vidro e do dispositivo, que quando colocados juntos formam uma ligação permanente. O plasma também torna as superfícies hidrofílicas, o que ajuda a facilitar a adição de líquidos. Além disso, o aspirador de plasma esteriliza os dispositivos. A superfície do PDMS dispositivo que contém o dispositivo micro é colocado virado para cima no limpador de plasma, juntamente com as lâminas de vidro. Superfícies a plasma tratado do vidro e dispositivo micro são montados em contato uns com os outros em uma bancada limpa e, em seguida colocado em pratos estéril 60 mm. As superfícies tratadas formar uma ligação apertada irreversível. </li><li> Dentro de 10 minutos de plasma de ligação a dispositivos de vidro, Poly-L-lisina (PLL) é adicionado para o dispositivo. Após 10 minutos, a hidrofilicidade do dispositivo irá diminuir o que torna difícil para o PLL para entrar no dispositivo. Nota: É importante verificar se há bolhas de ar no dispositivo após a adição de PLL. Bolhas de ar no canal principal são indesejáveis, como eles oxidam as células. Um método fácil de remover quaisquer bolhas de ar existentes é a utilização de uma pipeta P200 cheio com 150 ul de líquido (neste caso PLL), coloque a ponta diretamente na abertura do canal principal, e pressione o P200 com força. Este pode ter de ser repetido várias vezes, mas acabou a força da pipeta irá conduzir as bolhas para fora. </li><li> Dispositivos que contêm PLL estão autorizados a incubar durante a noite em um padrão de cultura de tecidos incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> No dia seguinte, o devícios são lavadas duas vezes rapidamente com dH2O autoclavado. Durante este processo, o líquido nunca é totalmente removido os canais principais, apenas a partir dos reservatórios. Remover líquido de os principais canais irá introduzir bolhas. Após 2 lavagens rápidas, os dispositivos são preenchidos com dH2O autoclavados e colocados de volta na incubadora por um período mínimo de 3 horas, ou durante a noite. </li><li> No dia seguinte, os dispositivos são novamente lavados duas vezes rapidamente com dH2O autoclavado. Então, media neural basal, contendo os suplementos necessários B27 e Glutamax para os neurônios de cultura primária de ratos, é adicionado aos dispositivos. Os dispositivos são colocados de volta na incubadora para uso futuro. Os dispositivos estão prontos para a semeadura de neurônios. </li></ol>

<ol><li>Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research.%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nat Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
</ol>

Neste vídeo demonstramos como fazer e preparar um PDMS dispositivo micro que usamos para os neurônios cultura pol O dispositivo permite a obtenção de uma fração pura axonal separados por microgrooves do compartimento contendo uma mistura de corpos celulares, dendritos e axônios . Estes dispositivos permitem ao pesquisador estudar os efeitos de vários tratamentos, bem como fornecer uma plataforma para realizar dano físico no axônios e observar os efeitos que estes tratamentos têm sobre os neurônios. O dispositivo também fornece um nível de cultura a fim de neurônios que ajuda a facilitar os estudos de transportes. Além disso, o microgrooves, que separam o compartimento de cultura de células do compartimento do axônio, permite o isolamento do fluídica entre os dois compartimentos tornando possível tratar uma parte lateral do dispositivo sem afetar o outro lado do dispositivo diretamente com o tratamento. Esta propriedade permite ao pesquisador estudar os efeitos, como transdução de sinal e transporte que resultam do tratamento.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Reagente</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 com agente de cura. Consulte a Dow Corning para encontrar um fornecedor próximo a você</td></tr><tr><td>Limpeza por Plasma</td><td>Ferramenta</td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td></td><td>http://www.harrickplasma.com/</td></tr><tr><td>Meio Neural Básico</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td>O Meio Neural Básico é obtido pela Invitrogen em sua linha Gibco de reagentes para cultura celular.</td></tr><tr><td>B27</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>O B27 é um suplemento proprietário disponível pela Invitrogen em sua linha Gibco de reagentes para cultura celular.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>O Glutamax está disponível pela Invitrogen em sua linha Gibco de reagentes para cultura celular.</td></tr><tr><td>Vidro de Cobertura Corning No. 1</td><td>vidro de cobertura</td><td>Corning</td><td>Corning No. X2935 244</td><td>Disponível pela Fisher Scientific, número do catálogo Fish 12-531D</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 60 mm</td><td>Ferramenta</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13A</td><td>Placas de Petri estéreis de poliestireno de 60 mm são usadas para acomodar o dispositivo ligado ao vidro.</td></tr><tr><td>Tubo BD Falcon de 50 ml</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352098</td><td>Disponível pelo catálogo da Fisher Scientific número 14-959-49A</td></tr><tr><td>Tubo BD Falcon de 15 ml</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td>Falcon No. 352097</td><td>Disponível pelo catálogo da Fisher Scientific número 14-959-70C</td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1274</td><td></td></tr><tr><td>Novo Item</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de um dispositivo micro para a compartimentação de neuron soma e axônios

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

Neste vídeo, demonstramos a técnica da litografia macia com polydimethyl siloxano (PDMS) que usamos para fabricar um dispositivo micro para os neurônios cultura. Anteriormente, uma bolacha de silício foi modelado com o projeto para o dispositivo neurônio microfluídicos usando SU-8 e fotolitografia para criar um molde mestre, ou o que nós simplesmente nos referimos como &quot;mestre&quot;. Em seguida, despeje o polímero de silicone PDMS em cima do mestre que é então curado pelo aquecimento do PDMS a 80 ° C por 1 hora. O PDMS forma um molde negativo do dispositivo. O PDMS é, então, cuidadosamente cortadas e levantou longe do mestre. Buracos são perfurados em que os reservatórios serão PDMS eo excesso aparadas longe do dispositivo. O nitrogênio é usado para afastar qualquer excesso de detritos a partir do dispositivo. Neste ponto os dispositivos estão prontos para usar e pode tanto ligado a Corning Glass cobrir No. 1 com um plasma esterilizador / limpador ou podem ser reversivelmente ligado à tampa de vidro, basta colocar o dispositivo na parte superior da tampa de vidro. A ligação reversível de que o dispositivo de vidro é coberto por um vídeo em separado e exige, primeiro, que o dispositivo seja esterilizado ou com álcool 70% ou em autoclave. Plasma tratar esteriliza os dispositivos de forma que nenhum tratamento adicional é necessário. É, no entanto, importante, quando plasma-tratamento dos dispositivos, para adicionar líquido para os dispositivos dentro de 10 minutos do tratamento de plasma, enquanto as superfícies são ainda hidrofílico. Esperando mais de 10 minutos para adicionar líquido para o dispositivo torna difícil para o líquido para entrar no dispositivo. Os dispositivos são tipicamente neurônio plasma obrigado a tampa de vidro e 0,5 mg / ml poli-L-lisina (PLL) em tampão borato pH 8,5 é imediatamente adicionado ao dispositivo. Após um mínimo de três horas de incubação com o PLL, os dispositivos são lavados com água dH2O um mínimo de 3 vezes, com pelo menos 15 minutos entre cada lavagem. Em seguida, a água é removida e novas mídias é adicionado ao dispositivo. Neste ponto, o dispositivo está pronto para uso. É importante lembrar, neste ponto, nunca remover toda a mídia do dispositivo. Sempre deixe a mídia no canal principal.

Neste vídeo podemos demonstrar a técnica da litografia macia com polydimethyl siloxano (PDMS) que usamos para farbricate um dispositivo micro para os neurônios cultura.

Fabricação de um dispositivo micro para a compartimentação de Neuron Soma e axônios

Neste vídeo, demonstramos a técnica de litografia suave com polidimetilsiloxano (PDMS), que utilizamos para fabricar um dispositivo microfluídico para ...

Bem-vindo ao laboratório do Dr. Newly John. O Laboratório John especializa-se na engenharia de plataformas microfluídicas para aplicações biológicas. Neste vídeo, demonstraremos a produção e utilização de um dispositivo microfluídico projetado para compartimentalizar e cultivar neurônios primários.O dispositivo neuronal foi publicado pela primeira vez na Nature Methods em agosto de 2005. Desde sua introdução, o dispositivo neuronal tem sido amplamente utilizado por colaboradores em todo o mundo. O dispositivo neuronal consiste em um pedaço de PDMS que foi moldado sobre uma pastilha de silício contendo um padrão de SUA do dispositivo, previamente criado por fotolitografia.O dispositivo possui três características principais, quatro reservatórios, oito milímetros de diâmetro, dois canais principais, cada um com 1,5 milímetro de largura, sete milímetros de comprimento e cem mícrons de altura, e microcanais, que têm 10 mícrometros de largura e três mícrometros de altura, conectando os dois canais principais. Os microcanais podem variar em comprimento de 150 mícrons a 900 mícrons, embora o comprimento padrão escolhido seja de 450 mícrons. Observando o dispositivo de modo que os canais principais e os microcanais estejam na vertical, podemos ver que os reservatórios à esquerda dos canais estão conectados por meio dos canais principais, assim como os reservatórios à direita.Este recurso permite que o líquido flua através do canal principal, uma característica importante que torna possível o carregamento de células e a troca de meio. O dispositivo neuronal apresenta três grandes vantagens em comparação com as plataformas tradicionais de cultura de tecidos. Primeiro, permite a compartimentalização separada dos corpos celulares ou somas e dos axônios. Com o dispositivo neuronal, é possível obter frações axonais puras.O tamanho e o comprimento das micro-ranhuras permitem que os axônios atravessem o outro canal principal, ao mesmo tempo que impedem os corpos celulares de atravessar. Em segundo lugar, devido ao design do dispositivo e aproveitando a pressão hidrostática, é possível submeter o lado celular e/ou o lado axonal do dispositivo a tratamentos separados, bastando manter o volume e os reservatórios mais altos em um lado do dispositivo em comparação ao outro. E em terceiro lugar, a fração pura de axônios do dispositivo pode ser coletada por sucção a vácuo, permitindo ao pesquisador estudar e observar a regeneração axonal.A pesquisadora Hina Lee demonstrará agora o preparo do dispositivo microfluídico de neurônios. Um substrato de silício de três polegadas com um padrão feito de SU-8 por fotolitografia é usado para moldar o molde microfluídico de PDMS (poli-dimetil-siloxano). Referimo-nos ao substrato de silício com padrão de SU-8 como moldes-mestre ou simplesmente mestres.O PDMS é misturado com agente de cura numa proporção de peso para peso de 10 para 1. Ou seja, por exemplo, 15 gramas de PDMS para 1,5 gramas de agente de cura. O PDMS é então bem misturado e despejado sobre a lâmina de silício.O wafer de silício está contido em uma placa de Petri de poliestireno de 10 centímetros. São necessários aproximadamente 12 gramas a 15 gramas de PDMS para cobrir as MAs com uma espessura de cerca de quatro milímetros. O molde com o PDMS é então colocado em um dessecador a vácuo com a tampa da placa de Petri removida e aplica-se vácuo.Isso é feito para ajudar a remover bolhas de ar do PDMS que foram introduzidas durante a agitação do agente de cura. Leva aproximadamente 15 minutos para que as bolhas de ar sejam removidas. O molde com PDMS é removido do dessecador após 15 minutos no dessecador a vácuo.Ainda existem algumas bolhas remanescentes no molde de PDMS. Uma pistola de ar com filtro de 0,45 mícron é utilizada para remover quaisquer bolhas residuais. Em seguida, o molde é colocado em uma placa aquecida a 80 graus por uma hora para cura.Se um dessecador a vácuo não estiver disponível, o molde pode ser deixado em temperatura ambiente por várias horas. As bolhas de ar eventualmente desaparecerão por si só. Se não houver placa aquecedora disponível, a PDMS curará em temperatura ambiente após 24 horas.É importante garantir que o molde esteja nivelado durante o processo de cura. Uma vez que a PDMS esteja curada sobre o molde, ela é levada para uma cabine limpa usando uma lâmina cirúrgica. É feito um corte circular ao redor do perímetro dos dispositivos.É importante que, ao inserir a lâmina no PDMS para fazer contato com a lâmina de silício, não se aplique muita pressão sobre a lâmina, pois, caso contrário, o molde se romperá com um corte circular ao redor dos dispositivos. Há quatro dispositivos por cada molde de silício de três polegadas. O PDMS é cuidadosamente removido do molde.Isso pode ser iniciado girando suavemente a lâmina cirúrgica enquanto ela é inserida no corte anterior. É muito fino com os dispositivos de PDMS no molde. Os reservatórios com face voltada para cima são perfurados no dispositivo usando um punch de biópsia de tecido de oito milímetros.O resíduo deixado no furador é empurrado para fora com uma haste. Os dispositivos são então divididos em quartos e o excesso de PDMS é aparado, de modo que o dispositivo se encaixe perfeitamente em uma lamínula Corning. Um vidro número um de 24 milímetros por 40 milímetros é usado com jato de ar de nitrogênio para remover qualquer resíduo em excesso.Detritos teimosos também podem ser removidos utilizando fita de vinil 3M Scotch Brand 4 7 1. Os dispositivos limpos estão agora prontos para ligação por plasma. Um limpador de plasma Herrick é usado para ligar brevemente os dispositivos neuronais às lamínulas.Os dispositivos e as lamínulas são colocados em uma bandeja, e a bandeja será então colocada no limpador de plasma e uma bomba de vácuo será usada para evacuar o ar da câmara. É importante observar que os dispositivos de PDMS são colocados com a face voltada para cima. Ou seja, com o desenho voltado para cima, para que fiquem expostos ao gás de plasma.Após a pressão de vácuo atingir 300 millitorr, a energia é ligada na bobina elétrica e ajustada para o máximo. Abre-se ligeiramente a porta para permitir a entrada de um pouco de ar na câmara, o que ajudará a gerar o plasma. Os dispositivos e o vidro de cobertura são tratados com plasma por dois minutos.Observe a cor roxa na câmara. Isso é o plasma real. A bobina elétrica cria plasma, que é um gás parcialmente ionizado composto por elétrons, íons e átomos ou moléculas neutros.O plasma cria espécies reativas na superfície do vidro e do dispositivo, que, quando colocados juntos, formarão uma ligação permanente. O plasma também torna a superfície hidrofílica, o que ajuda a facilitar a adição de líquidos. O limpador de plasma também esteriliza os dispositivos.Após o tratamento com plasma por dois minutos, a potência no vácuo é desligada e o ar é conduzido para dentro da câmara. As superfícies tratadas com plasma do vidro e do dispositivo microfluídico são montadas em contato uma com a outra em uma bancada limpa. Os dispositivos são então colocados em placas estéreis de 60 milímetros.As superfícies do vidro e do dispositivo tratadas com plasma formam uma ligação apertada e irreversível. Dentro de 10 minutos após a ligação por plasma, o dispositivo recebe poliol lisina. Após 10 minutos, a hidrofilicidade do dispositivo diminuirá.Tornando difícil a entrada do PLL no dispositivo. É importante verificar a presença de bolhas de ar no dispositivo após a adição do PLL. Um método simples para remover bolhas de ar existentes é usar uma pipeta P200 preenchida com 100 microlitros de líquido.Neste caso, pipete o PLL colocando a ponteira diretamente na abertura do canal principal, em seguida pressione com força a pipeta P-200. Isso pode precisar ser repetido várias vezes, mas eventualmente a força da pipeta expulsará as bolhas. Os dispositivos contendo PLL são deixados em incubação durante a noite em um incubador padrão de cultura de tecidos a 37 graus com 5% de CO2.Após 24 horas de incubação com PLL, os dispositivos são lavados duas vezes rapidamente com água desionizada autoclavada. Durante esse processo, o líquido nunca é completamente removido dos canais principais, apenas dos reservatórios. Remover o líquido dos canais principais introduzirá bolhas.Após duas lavagens rápidas, os dispositivos são preenchidos novamente com água desionizada autoclavada e recolocados no incubador por um mínimo de três horas ou durante a noite. No dia seguinte, após os dispositivos terem sido incubados com água durante a noite ou por um mínimo de três horas, eles são novamente levados para a cabine de segurança biológica e lavados duas vezes com água desionizada. Em seguida, adiciona-se aos dispositivos o meio basal neural contendo os suplementos necessários, B 27 e glutamato, para o cultivo de neurônios primários de rato.Os dispositivos são então colocados novamente no incubador para uso futuro. Os dispositivos estão agora prontos para receber os neurônios. Neste vídeo, demonstramos a técnica de litografia suave, que utilizamos para fabricar nossos dispositivos neuronais.Esses dispositivos podem ser usados para cultivar neurônios e outros tipos celulares de interesse. A principal vantagem desses dispositivos é a capacidade de separar e compartimentalizar o cultivo dos corpos celulares dos neurônios em um lado do dispositivo de uma fração pura de axônios no outro lado do dispositivo. No próximo vídeo, mostraremos como preparamos neurônios corticais fetais de E 18 e como carregamos as células no dispositivo.Então é isso do Laboratório John. Obrigado por assistir.

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Biologia

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