iCLIP - Transcriptoma-wide Mapeamento das Interações Proteína-RNA com a Resolução Nucleotide Individual

O objetivo geral do experimento a seguir é obter um mapa amplo do transcriptoma dos locais de ligação de uma proteína de ligação ao RNA na resolução de nucleotídeos individuais. Isso é obtido por irradiação UV de células vivas para proteínas e RNA de reticulação covalente in vivo como uma segunda etapa. A proteína de ligação ao RNA é imunopurificada sob condições rigorosas para recuperar os fragmentos de RNA reticulados.

Em seguida, a transcrição reversa gera CDNAs que freqüentemente truncam no peptídeo anexado, o que preserva as informações sobre a posição de reticulação dentro do RNA Os resultados são obtidos que mostram todos os locais de ligação dentro do transcriptoma com base no sequenciamento de alto rendimento da biblioteca de cDNA. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia do RNA, como a interação de diferentes proteínas rônicas de RNA regula o processamento de RNA. A principal vantagem desta técnica é que aumentamos o desempenho e a resolução de nossos mapas amplos de transcriptoma de interações de RNA de proteínas Para iniciar o procedimento de células de cultura de tecidos de reticulação UV.

Remova o meio de uma placa de 10 centímetros de células curativas. Adicione seis mililitros de PBS gelado e coloque os pratos no gelo. Uma placa é suficiente para três experimentos.

Remova a tampa e irradie as células. Uma vez a 254 nanômetros com 150 milijoules por centímetro quadrado, colha as células raspando-as das placas com um elevador de células, transfira dois mililitros de suspensão celular para cada um dos três microtubos para pellet as células. Gire-os em velocidade máxima por 10 segundos a quatro graus Celsius.

Em seguida, remova o encaixe supinado, congele os grânulos de células em gelo seco e armazene até 80 graus Celsius negativos até o uso. Adicione 100 microlitros de proteína, uma dyna beads por experimento a um microtubo fresco. Se estiver trabalhando com anticorpos de camundongo ou cabra, use grânulos de proteína G dyna.

Lave as contas duas vezes com tampão de lise, que pode ser encontrado no protocolo escrito que acompanha. Ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão de lise com dois a 10 microgramas de anticorpo. Gire o tubo em temperatura ambiente por 30 a 60 minutos.

Em seguida, lave as esferas três vezes com 900 microlitros de tampão de lise e deixe-as na última lavagem até que esteja pronto para prosseguir. Para imunoprecipitação Thor palácio de células no gelo. Resus suspenso em um mililitro de tampão de lise e transfira-o para um microtubo de 1,5 mililitro.

Prepare uma diluição de um a 500 de RNAs um. Em seguida, adicione 10 microlitros junto com dois microlitros de DNAs turbo à célula. Lisado. Incubar as amostras durante exactamente três minutos a 37 graus Celsius, agitando a 1 100 rotações por minuto, transferir imediatamente para o gelo.

Em seguida, gire as amostras a quatro graus Celsius e 22.000 vezes a gravidade por 20 minutos para limpar o lisado e coletar cuidadosamente o SUP natant, deixando cerca de 50 microlitros de lisado com o pellet para imunoprecipitar as contas. Remova o tampão de lavagem e adicione os lisados celulares preparados. Gire as amostras por duas horas a quatro graus Celsius.

Descarte o agente SUP e lave as esferas duas vezes com 900 microlitros de tampão com alto teor de sal, que pode ser encontrado no protocolo escrito que acompanha. Por fim, lave as contas duas vezes com 900 microlitros de tampão de lavagem. Em seguida, prossiga para desfosforilar e adicione um ligante às três extremidades primárias do RNA.

Para rotular o RNA, cinco extremidades primárias trabalhando atrás de um escudo de plexiglass. Remova o supinato da última lavagem da reação de ligadura do ligante e suspenda novamente os grânulos em oito microlitros de mistura PNK quente. Incube por cinco minutos a 37 graus Celsius.

Remova a mistura PNK quente e reus. Suspenda os grânulos em 20 microlitros de um tempo de buffer de carregamento de página nova. Em seguida, incube a amostra em um misturador térmico a 70 graus Celsius por 10 minutos.

Coloque imediatamente a amostra em um ímã para precipitar as contas vazias. Carregue as amostras em uma página nova de quatro a 12%. Biss gel de acordo com as instruções do fabricante.

Além disso, carregue cinco microlitros de um marcador de tamanho de proteína prestado. Execute o gel por 50 minutos a 180 volts. Transferir os complexos de RNA proteico do gel para uma membrana de nitrocelulose utilizando o aparelho de transferência húmida NOVA de acordo com as instruções do fabricante.

Após a transferência, enxágue a membrana em tampão PBS. Em seguida, embrulhe-o em filme plástico e exponha-o ao filme a 80 graus Celsius negativos. Realize exposições por 30 minutos, uma hora e durante a noite.

Em seguida, isole a região da membrana de acordo com os complexos de RNA de proteína dos RNAs baixos. Experimente usar a radiografia automática como máscara. Recupere o RNA da membrana com digestão de proteinase K e extração de clorofórmio de fenol.

Transcreva o RNA usando um dos primers AYP para purificar o CDNA em gel. Misture seis microlitros de amostra de CDNA com seis microlitros de tampão de carga de ureia TBE duas vezes. Pouco antes de carregar as amostras em um gel.

Aqueça as amostras a 80 graus Celsius por três minutos. Em seguida, carregue as amostras em um gel de ureia pré-moldado a 6% TBE junto com um marcador de baixo peso molecular. Deixe o gel funcionar por 40 minutos a 180 volts, conforme descrito pelo fabricante, usando o corante superior e as marcas no suporte de gel de plástico para guiar a excisão.

Corte três bandas em 120 a 200 nucleotídeos, 85 a 120 nucleotídeos e 70 a 85 nucleotídeos. Observe que o primer labial de arco e a sequência L três juntos representam 52 nucleotídeos da sequência de clipe. Adicione 400 microlitros de te e esmague a fatia de gel em pedaços pequenos.

Usando um êmbolo de seringa de um mililitro, incube os pedaços de gel com agitação a 1.100 rotações por minuto por duas horas a 37 graus Celsius. Coloque dois pré-filtros de vidro de um centímetro em uma coluna spinx CoStar. Transferir a porção líquida da amostra para a centrifugação da coluna durante um minuto a 13 000 rotações por minuto para um tubo de 1,5 mililitros.

Adicione 0,5 microlitros de azul de glico e 40 microlitros de acetato de sódio pH 5,5. Em seguida, misture a amostra. Adicione um mililitro de etanol 100%.

Misture novamente e precipite a amostra durante a noite a 20 graus Celsius negativos. Finalmente, circularize as moléculas de CD NA para anexar a região do adaptador às cinco extremidades principais. Em seguida, linearize e a PCR amplifique de acordo com o protocolo escrito que acompanha antes do sequenciamento da biblioteca de clipes oculares, o sucesso do experimento pode ser monitorado em duas etapas.

O gráfico de auto-rádio do complexo de RNA de proteína após a transferência de membrana e a imagem de gel dos produtos de PCR na auto-radiografia das amostras de baixo RNA, radioatividade difusa devem ser vistas acima do peso molecular da proteína para amostras de alto RNA. Essa radioatividade é focada mais perto do peso molecular da proteína. Quando nenhum anticorpo é usado na imunoprecipitação, nenhum sinal deve ser detectado.

Outros controles importantes para a especificidade da imunoprecipitação emitem irradiação UVE ou usam células que não expressam a proteína de interesse. A imagem em gel dos produtos de PCR deve demonstrar uma faixa de tamanho que corresponda à fração de CD NA. Observe que os primers de PCR, P três Celexa e P cinco Celexa introduzem 76 nucleotídeos adicionais ao tamanho do CD NA. Se nenhum anticorpo for usado durante a imunoprecipitação, nenhum produto de PCR correspondente deve ser detectado.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que cada uma das 64 etapas é crítica e deve ser executada com cem por cento de precisão. Os dados ICL podem ser integrados computacionalmente com ensaios funcionais de todo o transcrito. Isso pode, por exemplo, obter insights sobre a regulação dependente da posição do processamento de RNA.

Para análise de dados computacionais, gostaríamos de nos referir às nossas publicações recentes em colaboração com o Nicholas KA European Bioinformatics Institute e bla zupan na Universidade de Liana. E agora é hora de você começar seus próprios experimentos. Divertir-se.