Name: Nervo Óptico um modelo murino de lesão por esmagamento Estudo de Sobrevivência de células da retina Gânglio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-25T15:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprenda a realizar lesão por esmagamento do nervo óptico em modelo murino para estudar a sobrevivência de células da retina ganglionar. Este método utiliza marcação retrógrada com corante fluorescente e microscopia de fluorescência.

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Nossa pesquisa é apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do, NIH National Eye Institute.

Todos os equipamentos e reagentes utilizados são estéreis. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal Care e Use Committee (ACUC) no NEI / NIH (animal protocolo de estudo NEI-570), e foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH e regulamentos. 1. Rotulagem de base retrógrada de células ganglionares da retina (RGCs) no dia 1 O objetivo deste procedimento é a rotular as células ganglionares da retina retrogradamente pela injeção de um corante traçador neural no colículo superior dos camundongos três dias antes da lesão do nervo óptico esmagamento. O corante será retrogradamente tomadas pelas células ganglionares da retina e proporciona um marcador para o RGCs vivos (Figura 1). Esta abordagem produz rotulagem reprodutível de RGCs viável, com pouca variação 1-5. <ol><li> Profundamente anestesiar o mouse. Limpar o cabelo no alto da cabeça. Posicione o mouse em um pequeno aparelho estereotáxico. Oinment protetora é aplicada em ambos os olhos. Desinfectar a pele da cabeça três vezes cada um usando um iodóforo e um matagal álcool 70%. </li><li> Faça uma incisão na pele para expor o crânio, e mantê-lo seco e limpo com água oxigenada de 3%. </li><li> Identificar e marcar o bregma. Faça um furo acima do colículo superior a 2,9 mm do bregma e 0,5 mm lateral à linha média de cada hemisfério 7. Durante a perfuração, aplicar soro fisiológico para o local onde o buraco é perfurado para evitar lesões de calor secundário. </li><li> Usando um dispositivo de medição estereotáxica e uma seringa de Hamilton, injetar o traçador corante FluoroGold neural (1 ml de 3% em solução salina Fluorocromo) muito lentamente no colículo superior de cada hemisfério, a uma profundidade de 1,6 mm da superfície óssea do cérebro. </li><li> Sutura no local da incisão. Dar uma injeção subcutânea de buprenorfina para analgesia. </li><li> Mova o mouse para uma área quente e seco e monitorá-lo até que ele é capaz de manter uma postura ereta, e devolvê-lo à sua gaiola. Para os três primeiros dias após o procedimento de rotulagem, analgésicos sistêmicos (por exemplo, buprenorfina) e pomada antibiótica tópica são dadas duas vezes por dia eo mouse é acompanhado de perto. </li></ol> 2. Lesão por esmagamento do nervo óptico no dia 4 Neste procedimento, vamos aplicar uma lesão por esmagamento do nervo óptico para causar um dano primário ao axônios (Figura 2), o que levará a uma morte gradual das células ganglionares da retina. <ol><li> Três dias após a aplicação de corante traçador, o mouse é profundamente anestesiado. Usando um microscópio de dissecação, a conjuntiva de um olho é incisada mais ou menos na posição das 4 horas usando uma tesoura primavera. </li><li> Suavemente desviar os músculos orbitais e colocá-los de lado. Expor o nervo óptico branco em sua saída do globo ocular. Tome muito cuidado para não danificar qualquer vasos sanguíneos. </li><li> Com a ajuda de um par de cruz ação fórceps, aplicar uma lesão por esmagamento do nervo óptico em cerca de 2 mm do globo ocular por aproximadamente 3 segundos. Tome muito cuidado para não danificar a artéria oftálmica para causar sangramento. </li><li> Após a conclusão da lesão por esmagamento, a incisão é suturada. </li><li> Antes o mouse recupera da anestesia, dar uma injeção subcutânea de buprenorfina para analgesia. </li><li> Mova o mouse para uma área quente e seco e monitorá-lo, até que ele é capaz de manter uma postura ereta e devolvê-lo à sua gaiola. Para os três primeiros dias após o procedimento lesão por esmagamento, analgésicos sistêmicos (por exemplo, buprenorfina) e pomada antibiótica tópica são dadas duas vezes por dia eo mouse é acompanhado de perto. </li></ol> 3. Colher as retinas e analisar Survival RGC No Dia 11 O objetivo deste procedimento é a colheita do retinaeto analisar a sobrevivência das células ganglionares da retina. <ol><li> No dia 11 (dia 7 após ONC), o mouse é sacrificado por infusão de CO 2 e deslocamento cervical. </li><li> Olhos são enucleados com a ajuda de uma pinça, aplicando pressão para a órbita. </li><li> Os olhos são fixados em solução de paraformaldeído a 4% por duas horas e lavados com PBS por três vezes. Dissecar a retina. O procedimento de dissecção retina já foi publicado anteriormente por Jove em 2010 por Gustmann, S. et al. 6, e, portanto, não serão descritas aqui. </li><li> Imagens dos sobreviventes células ganglionares da retina são tomadas através de um microscópio de fluorescência em regiões definidas da retina, ea densidade de células ganglionares da retina pode ser contado. Um resultado representativo da fluorescência marcado células ganglionares da retina com ou sem lesão do nervo óptico esmagar é mostrado na Figura 3. </li></ol> 4. Resultados representativos: Para analisar a sobrevivência das células ganglionares da retina, sete dias após a lesão do nervo óptico esmagar, a retina foram colhidos, fixo, achatada e montado. Imagens da retina foram tiradas com um microscópio fluorescente. Comparado com o r ileso normaisetina (esquerda, Normal), o número de RGCs viáveis ​​(verde, retrogradamente marcados pelo corante FluoroGold traçador neural injetado no colículo superior) é significativamente menor na retina com uma lesão do nervo óptico paixão (direita, ONC) (Figura 3) . <img src="/files/ftp_upload/2685/2685fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rotulagem de base retrógrada das células ganglionares da retina , A fim de contar o viáveis ​​células ganglionares da retina em diferentes momentos após a lesão do nervo óptico esmagar, as células ganglionares da retina são rotulados retrogradamente pela injeção de um traçador neural corante (cor verde) para o colículo superior no cérebro, três dias antes do nervo óptico ( vermelho paixão) lesão. Uma vez que os axônios das células ganglionares da retina residir no colículo superior, o corante traçador será retomada pelo RGCs retrogradamente e fornece um marcador para o RGCs vida. <img src="/files/ftp_upload/2685/2685fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Lesão por esmagamento do nervo óptico A fim de analisar o status de sobrevivência de células ganglionares da retina, uma lesão por esmagamento é aplicada ao nervo óptico (vermelho) para causar um dano primário ao axônios. Isto levará a uma morte gradual das células ganglionares da retina. Três dias após a injeção de corante marcador (verde), o mouse está anestesiado. Conjuntiva de um olho é incisada. Desviar os músculos orbitais e colocá-los de lado. Expor o nervo óptico em sua saída do globo ocular. Aplique uma lesão por esmagamento do nervo óptico em cerca de 2 mm do globo ocular por aproximadamente 3 segundos usando um par de cruz ação fórceps. <img src="/files/ftp_upload/2685/2685fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Fluorescência marcado células ganglionares da retina com ou sem lesão do nervo óptico esmagar Para analisar a sobrevivência das células ganglionares da retina, sete dias após a lesão do nervo óptico esmagar, a retina foram colhidos, fixo, achatada e montado. Imagens da retina foram tiradas com um microscópio fluorescente. Comparado com o retina ileso normal (esquerda, Normal), o número de RGCs viáveis ​​(verde, retrogradamente marcados pela neural FluoroGold traçador corante injetado no colículo superior) foi significativamente menor na retina com uma lesão do nervo óptico paixão (direita, ONC ) (Figura 3). Barra de escala: 50 mm

<ol><li>Yoles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM1+reduces+injury-induced+metabolic+deficits+and+degeneration+in+the+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 33, 3586-3591 (1992).</li>
<li>Fisher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+for+neuroprotection+in+the+mouse+optic+nerve%3A+implications+for+optic+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies.</a> J Neurosci. 21, 136-142 (2001).</li>
<li>Levkovitch-Verbin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGC+death+in+mice+after+optic+nerve+crush+injury%3A+oxidative+stress+and+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 41, 4169-4174 (2000).</li>
<li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-B+inhibits+apoptosis+via+VEGFR-1-mediated+suppression+of+the+expression+of+BH3-only+protein+genes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 913-923 (2008).</li>
<li>Tang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+effect+of+PDGF-CC+rescues+neurons+from+apoptosis+in+both+brain+and+retina+by+regulating+GSK3beta+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation.</a> The Journal of experimental medicine. 207, 867-880 (2010).</li>
<li>Gustmann, S., Dunker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo-like+organotypic+murine+retinal+wholemount+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego. (1997).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O nervo óptico modelo de lesão por esmagamento murino é útil para estudar o processo de morte RGC e sobrevivência. Este modelo é também muitas vezes utilizado para investigar os efeitos de diferentes reagentes e genes na apoptose RGC e sobrevivência. Uma vantagem deste modelo é que ele tem um alto grau de reprodutibilidade, com variações mínimas. No entanto, cuidados especiais são necessários vários passos neste modelo. Em primeiro lugar, ao fazer a lesão por esmagamento do nervo óptico, é e...

<table><tbody><tr><td>Aparelho estereotáxico</td><td>ASI Instruments</td><td>SAS-4100</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PZMIV-BS</td><td></td></tr><tr><td>Porta-lâmina de bisturi</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi nº 15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Micromotor com broca</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de sutura</td><td>Fine Science Tools</td><td>12050-03</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>16144-13</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont nº 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton</td><td>Hamilton Co</td><td>88400</td><td></td></tr><tr><td>Espumas de gaze</td><td>Office Depot</td><td>674889</td><td></td></tr><tr><td>Fluorocromo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39286</td><td></td></tr><tr><td>Álcool</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>70%</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3410</td><td>3%</td></tr></tbody></table>

nervo Óptico um modelo murino de lesão por esmagamento estudo de sobrevivência de células da retina gânglio

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Lesão do nervo óptico pode levar à degeneração axonal, seguido de uma morte gradual de células ganglionares da retina (RGCs), o que resulta em perda de visão irreversível. Exemplos de tais doenças em humanos incluem neuropatia óptica traumática e degeneração do nervo óptico no glaucoma. É caracterizada por alterações típicas na cabeça do nervo óptico, degeneração progressiva do nervo óptico e perda de células ganglionares da retina, se não controlada, levando à perda de visão e cegueira. O esmagamento do nervo óptico (ONC) modelo do rato é um modelo de lesão importante doença experimental de neuropatia óptica traumática, glaucoma, etc Neste modelo, a lesão por esmagamento do nervo óptico leva a gradual da retina apoptose de células ganglionares. Este modelo de doença pode ser usado para estudar os processos gerais e aos mecanismos de morte neuronal e sobrevivência, que é essencial para o desenvolvimento de medidas terapêuticas. Além disso, as abordagens farmacológica e molecular pode ser utilizada neste modelo para identificar e testar o potencial terapêutico reagentes para tratar diferentes tipos de neuropatia óptica. Aqui, fornecemos uma demonstração passo a passo (I) rotulagem de base retrógrada das células ganglionares da retina (RGCs) no dia 1, (II) lesão por esmagamento do nervo óptico no dia 4, (III) Colheita da retina e analisar a sobrevivência RGC no dia 11, e (IV) Resultado Representante.

Este protocolo mostra como retrogradamente rótulo células ganglionares da retina, e como posteriormente fazer uma lesão por esmagamento do nervo óptico, a fim de analisar a sobrevivência das células ganglionares da retina e apoptose. É um modelo de doença experimental para diferentes tipos de neuropatia óptica, incluindo glaucoma.

Nervo Óptico um modelo murino de lesão por esmagamento Estudo de Sobrevivência de células da retina Gânglio

A lesão do nervo óptico pode levar à degeneração axonal, seguida pela morte gradual das células ganglionares da retina (CGRs), o que resulta em ... irreversível

Este procedimento demonstra a lesão por esmagamento do nervo óptico e a subsequente análise da sobrevivência das células ganglionares da retina em um modelo murino. Isso é realizado mediante injeção de um corante fluorescente no colículo superior. No primeiro dia, o DI é transportado de forma retrógrada até as células ganglionares da retina, rotulando essa população celular como segundo passo.Uma lesão por esmagamento do nervo óptico é realizada no quarto dia para provocar a degeneração do nervo óptico, o que levará à morte gradual das células ganglionares da retina. No décimo primeiro dia, a retina é dissecada com o objetivo de investigar a sobrevivência das células ganglionares da retina. O resultado deste procedimento mostra o número de células ganglionares da retina viáveis remanescentes, com base na contagem de células ganglionares da retina marcadas com flora Gold realizada por meio de microscopia de fluorescência.Olá, sou do laboratório do Dr. no Instituto Nacional de Olho, NIH. Agora vou mostrar como realizar o modelo de lesão por esmagamento do nervo óptico em camundongos. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece uma maneira simples, estável e eficiente de rotu

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Noventa por cento das células ganglionares da retina (RGCs) cujos axônios são completamente seccionado (axotomia) morrem dentro de 14 dias após a axotomia. Esse modelo se adequa facilmente a manipulações experimentais e altamente reprodutível.

Transecção do nervo óptico: Um Modelo de Apoptose Neuron Adultos no Sistema Nervoso Central

Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Este modelo é ideal para a realização de uma série de manipulações experimentais que visam a retina globalmente ou diretamente a população-alvo feridos neuronal de células ganglionares da retina.

Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos

Este vídeo ilustra um método, usando um scanner T clínica 3, por MR com contraste de imagem da projeção visual ingênuo do mouse, para estudos in vivo repetitivos e longitudinais de degeneração do nervo óptico associados com lesão por esmagamento do nervo óptico aguda e degeneração do nervo óptico crônica em camundongos knock-out (KO p50).

Imagem in vivo da fibra óptica Nerve Integrity por ressonância magnética com contraste em Ratos

O objetivo deste protocolo é para induzir fotoquimicamente lesão isquêmica ao nervo óptico posterior em ratos. Este modelo é fundamental para estudos de fisiopatologia da neuropatia óptica isquêmica posterior e abordagens terapêuticas para essa e outras neuropatias ópticas, bem como de outras doenças isquêmicas do sistema nervoso central.

Modelo de Rato Induzida fotoquimicamente posterior neuropatia óptica isquémica

O glaucoma é caracterizado por danos às células ganglionares da retina. A indução de glaucoma em modelos animais pode fornecer informações sobre o estudo desta doença. Aqui, descrevemos um procedimento que induz a perda de RGCs em um modelo de rato in vivo e demonstra a preparação de retinas de montagem inteira para análise.

Glaucoma de indução de Procedimento em um<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de Rato e Whole mount-Retina Preparação

Este artigo descreve um processo para induzir a lesão de isquemia-reperfusão da retina pela pressão intra-ocular elevada em ratos. lesão de isquemia-reperfusão da retina pela pressão intra-ocular elevada serve para modelar patologias humanas caracterizadas por oxigénio e entrega de nutrientes comprometida na retina, permitindo aos investigadores para examinar os mecanismos celulares e potenciais tratamentos para doenças humanas da unidade neurovascular da retina.

Um modelo de mouse Retinal isquemia-reperfusão Através elevação da pressão intra-ocular

Secundária degeneração das células ganglionares da retina (RGCs) comumente ocorre no glaucoma. Este estudo descreve uma abordagem inovadora e operativa para transecção parcial nervo óptico. O uso dessa abordagem operativa de economia de espaço amplia gama de aplicação do modelo e permite a exploração dos mecanismos de lesão secundária em RGCs de uma maneira nova.

Transecção parcial nervo óptico em ratos: um modelo estabelecido com uma nova abordagem operativa para avaliar secundária degeneração das células ganglionares da retina

Este artigo apresenta instruções detalhadas para realizar o esmagamento do nervo óptico em um modelo de coelho usando técnicas cirúrgicas oftálmicas padrão.

Uma abordagem cirúrgica para esmagamento do nervo óptico em um modelo de coelho

Este artigo fornece uma descrição de como dissecar e registro da preparação isolada da retina em mouse. Em particular, descrevemos como luz para gravar as respostas de uma população fluorescente etiquetado células ganglionares e, posteriormente, identificar e analisar a sua morfologia.

Uma preparação isolada da retina para gravar Resposta Luz geneticamente identificadas células ganglionares da retina

A injeção direta no nervo óptico do rato é útil para a pesquisa regenerativa. Demonstramos uma técnica minimamente invasiva para injeção direta em um nervo óptico de rato que não envolve a abertura do crânio. Usando este método, as complicações cirúrgicas são minimizadas e a recuperação é mais rápida.

Técnica minimamente invasiva para a injeção em Rat Optic Nerve

Aprenda a realizar lesão por esmagamento do nervo óptico em modelo murino para estudar a sobrevivência de células da retina ganglionar. Este método utiliza marcação retrógrada com corante fluorescente e microscopia de fluorescência.

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