Name: Evisceração de Vítreo Mouse e Retina de Análises Proteômica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: Aprenda a eviscerar olhos de camundongo para isolar vítreo, retina e lente usando dissecação e centrifugação. Este método permite análises proteômicas precisas de tecidos oculares em pesquisas de neurociência e oftalmologia.

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O financiamento foi fornecido pelo Fight for Sight and Research para prevenir a cegueira.

1. Dissecção do segmento anterior. <ol><li> Tecido escleral posterior ao limbo é apreendido com uma pinça 0,22 e do globo (globo ocular) é estabilizada. </li><li> Uma lâmina de microcirurgia é usado para fazer uma incisão linear na córnea a partir de limbo a limbo. </li><li> A Colibri 0,12 fórceps é então utilizado para captar a córnea na incisão. </li><li> O fluido da câmara anterior é então absorvida com uma lança Weck-Cel cirúrgico. </li></ol> 2. Evisceração lente. <ol><li> A Colibri 0,12 fórceps segurando a córnea é usada para estabilizar o mundo. </li><li> Um porta-agulha fina curva (ou curvas forceps vestir) é inserido atrás da lente em direção ao aspecto posterior do globo. O porta-agulha é parcialmente fechado, e puxou para frente. A pressão é aplicada usando a pinça na superfície externa da esclera, o que empurra a lente para a frente através da incisão da córnea, deixando a parede do olho intacto. O vítreo aparece como um gel transparente e é parcialmente aderente à lente. </li><li> O tecido vítreo-lente é então colocada em um tubo de centrifugação filtrado contendo 20 microlitros de cocktail inibidor da protease (Roche) dissolvido em PBS. </li></ol> 3. Evisceração retina. <ol><li> Continue para estabilizar o mundo com 0,12 forceps Colibri agarrar a incisão na córnea. </li><li> Um porta-agulha fina curva (ou curvas forceps vestir) é colocado como muito posterior ao globo possível, perto do nervo óptico. O porta-agulha é parcialmente fechado, e puxou para frente. A pressão é aplicada usando a pinça na superfície externa da esclera, que empurra a retina para a frente através da incisão da córnea. O vítreo aparece como um gel transparente aderente à retina. A retina é visualizado como um amarelo tecido vascularizado,. Quaisquer tiras de tecido pigmentada pode ser desfeito, com uma pinça. </li><li> O tecido da retina vítreo é então colocado no tubo de centrifugação filtrada contendo o tecido lente vítrea. </li></ol> 4. Filtrada centrifugação. <ol><li> O tubo de centrifugação filtrado é colocado em uma centrífuga de bancada. Giram a 14.000 x G por 12 minutos. </li><li> Aspirar o eluente da câmara baixa, que é o vítreo. A retina permanece na câmara superior. Essas amostras podem ser utilizados para estudos de proteínas. </li></ol> 5. Resultados representante As amostras vítreas foram analisadas por SDS-PAGE (Figura 2). As amostras também foram utilizados para um ensaio de atividade enzimática (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rato diagrama de olho. Transversal esquemático do olho humano e do rato mostra o volume vítreo relativa menor no olho do rato, devido à sua maior lente. <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Unidimensional SDS-PAGE do vítreo mouse e retina. Perfis de proteínas do vítreo mouse, 13,6 mg / mL (pista 1) e retina, 11,35 mg / mL (faixa 2). Eletroforese em gel foi realizada em 150 kV por 45 minutos, corados com Flamingo gel fluorescente mancha e visualizado através de um sistema de VersaDoc Imaging (BioRad, Hercules, CA). <img src="/files/ftp_upload/2795/2795fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Superóxido dismutase atividade enzimática (SOD) no rato e vítreo humano. Medição da atividade SOD total (SOD atividade colorimétrico aasay kit, # AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) foi realizada em vítreo e retina coletados por evisceração de camundongos DBA e albino. Este resultado foi comparado à atividade SOD no núcleo vítreo humano e retina humana coletados de post-mortem olhos de doadores humanos para determinar a atividade relativa. Diluído amostras de núcleo vítreo foram aspirados manualmente utilizando uma agulha 23 gauge, 11 e retina foram coletados por floração o olho e cortar o tecido de distância do complexo EPR ​​/ coróide. Embora o ensaio não faz distinção entre as isoformas da SOD, a atividade SOD vítreo é provável que refletem SOD3, uma vez que é apenas a isoforma extracelular 12 A atividade de SOD retina é susceptível de reflectir todas as isoformas da SOD três:. SOD1 intracelular, SOD2 mitocondrial, e extracelulares SOD3. 12 Porque altamente sensível ensaios enzimáticos, incluindo este ensaio SOD, a possibilidade de contaminação cruzada de proteínas é possível e requer um estudo mais aprofundado. Barras de erro representam SEM.

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<li>Ciechanowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+synthesis+is+not+the+reason+for+decreased+activity+of+extracellular+superoxide+dismutase+in+patients+with+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes.</a> Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Associação para a Investigação e Visão em Oftalmologia declaração para o uso de animais em oftálmica e Vision Research.

Camundongos transgênicos são um importante modelo para a investigação de doenças da retina e vítreo-retinianas. 6-10 O corpo vítreo mouse, no entanto, compreende uma proporção significativamente menor do olho em relação ao vítreo humano devido ao grande lente no olho do rato. 5 Isso faz com que difícil isolar e purificar o vítreo mouse. Compreensão das mudanças proteína associada com o vítreo durante doenças como a retinopatia diabética proliferativa, relacionadas com a idade degeneração macular, uveíte e descolamento de retina vai dar dicas sobre os mecanismos pelos quais o progresso. Este protocolo experimental visualizadas fornece um meio para obter e purificar o corpo vítreo do mouse e maximizar a produção de proteína para as análises enzimáticas e proteômica.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> 15 °, BD Beaver Microsurgical Lâmina </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 0,22 Fine-Pinça Castroviejo Sutura </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0,12 Colibri forceps </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> 2 / 132 </td><td></td></tr><tr><td> Microcontrolador Centrífuga Filtro Ultracel YM-100 ou YM-50 </td><td> Millipore </td><td> 42412, 42415 </td><td></td></tr><tr><td> Atividade SOD Kit de Ensaio Colorimétrico </td><td> Abcam </td><td> Ab65354 </td><td></td></tr><tr><td> Weck-Cel cirúrgica lanças </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td><td></td></tr><tr><td> Protease cocktail inibidor </td><td> Roche </td><td> 11 836 170 001 </td><td></td></tr><tr><td> Flamingo gel fluorescente mancha </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-04910 </td><td></td></tr></tbody></table>

evisceração de vítreo mouse e retina de análises proteômica

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

Enquanto a retina do rato tem emergido como um importante modelo genético para a doença hereditária da retina, o vítreo do mouse continua a ser explorado. O vítreo é uma matriz extracelular altamente aquosa que recobre a retina, onde intra-ocular, bem como proteínas extraocular acumulam durante a doença. 1-3 interações anormais entre vítreo e retina subjazem diversas doenças, como descolamento de retina, retinopatia diabética proliferativa, uveíte e Vitreorretinopatia proliferativa 1. , 4 O volume vítreo relativa do mouse é significativamente menor do que o vítreo humano (Figura 1), uma vez que a lente do mouse ocupa quase 75% do seu olho. 5 Isso fez com que estudos bioquímicos do vítreo do mouse desafiador. Neste artigo de vídeo, apresentamos uma técnica para dissecar e isolar o vítreo da retina do rato, que vai permitir o uso de modelos de ratos transgênicos para definir mais claramente o papel dessa matriz extracelular no desenvolvimento de doenças vítreo-retinianas.

A técnica de dissecção ilustra a evisceração do vítreo, retina, ea lente do olho do rato, a separação por centrifugação, e caracterização de proteínas com os ensaios.

Evisceração de Vítreo Mouse e Retina de Análises Proteômica

Embora a retina de camundongo tenha emergido como um modelo genético importante para doenças retinianas hereditárias, o vítreo do camundongo ainda carece de exploração. O vítreo é...

O olho humano é preenchido por uma matriz extracelular líquida chamada vítreo no olho do camundongo. Esse espaço é preenchido principalmente pela lente. Para isolar o vítreo e a retina, primeiro precisamos dissecar o segmento anterior, estabilizar o olho com pinças e usar uma lâmina extremamente afiada para fazer um único corte através da córnea.Uma lâmina romba pode rasgar a córnea e exigir várias passadas. Uma esponja de células WEX é usada para absorver o fluido na câmara anterior. As setas indicam onde vamos comprimir a lente e o vítreo com uma pinça, fechar parcialmente a pinça e puxar para frente.A lente tem aparência de uma esfera transparente e, logo atrás dela, estará o gel vítreo. Neste exemplo, o vítreo permanece aderido à parte posterior da lente; para isolá-lo, pinças para retina são posicionadas mais atrás, próximas ao nervo óptico, pressionam suavemente e puxam para frente. A retina apresenta-se como um material amarelado e gelatinoso.Em alguns casos, a retina, o vítreo e o cristalino sairão como um único tecido. O próximo passo é isolar e separar esses três tecidos utilizando um dispositivo de filtração por centrifugação. O pedaço de filtro é colocado na parte superior de um tubo einor e adicionamos um pouco de solução salina tamponada com fosfato.À medida que cada um dos tecidos é isolado, eles são colocados no poço superior contendo o filtro. As lentes no canto superior esquerdo e a vítreo-retina estão no canto inferior direito. Os tubos em uma centrífuga micro são girados a 14.000 Gs por 12 minutos.O vítreo irá girar até o fundo da lente do tubo einor, e a retina permanecerá na parte superior. Usaremos pinça para separar a lente da retina, em seguida isolaremos a retina do poço superior. Todos esses tecidos podem ser colocados em tubos einor e depois processados para análises de proteômica.

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Este vídeo mostra uma técnica eficaz para diferenciar e dissecando os vários semi-transparente das estruturas do corpo humano na pós vítreos olhos mortem.

Dissecção da Human Elements Corpo Vítreo para Análise Proteômica

A tripsina é uma compilação dos métodos mais utilizados para analisar a vasculatura retiniana. Este manuscrito descreve o método em detalhes, incluindo alterações importantes para otimizar a técnica e remover o tecido não-vascular, preservando a arquitetura geral dos vasos.

Tripsina Digest protocolo para analisar a vascularização da retina de um rato modelo

Nós desenvolvemos uma preparação fatia horizontal da retina de mamífero adulto com o plano de corte paralelo à superfície da retina. campos dendríticos de neurônios da retina orientados nonradially não foram truncados, permitindo o estudo do processamento de sinal com técnicas de patch-clamp e de imagem.

Preparação de horizontais Fatias de rato adulto Retina de Estudos eletrofisiológicos

Este protocolo apresenta duas técnicas para isolar os compartimentos subcelulares de fotorreceptores de haste murina para análise de proteínas. O primeiro método utiliza papel filtro de retina viva e celulose para separar segmentos externos da haste, enquanto o segundo emprega retina liofilizada e fita adesiva para descascar camadas internas e externas do segmento.

Dois métodos de descascamento para o isolamento de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas

A retinopatia diabética é uma das principais causas de cegueira. Histologia, ensaio de quebra da barreira hemorrânica e angiografia de fluorescência são técnicas valiosas para entender a fisiopatologia da retina, o que poderia aumentar ainda mais o rastreamento eficiente de drogas contra a retinopatia diabética.

Avaliação fisiofisiológica da retina em um modelo de rato

Este protocolo descreve um método para o isolamento de células endoteliais da retina pós-natais murinas otimizado para o rendimento, pureza e viabilidade celular. Essas células são adequadas para abordagens de sequenciamento de próxima geração.

Isolamento de células endoteliais da retina murinas para sequenciamento de próxima geração

Um ensaio de proteção foi desenvolvido para monitorar a resiliência da vasculatura retiniana à morte por diabetes/insultos relacionados à retinopatia diabética, como estresse oxidativo e citocinas.

Um ensaio para detectar a proteção da vasculatura retiniana contra a morte relacionada ao diabetes em camundongos

Este protocolo descreve as etapas detalhadas para preparar amostras de retina para microscopia eletrônica de volume, com foco nas características estruturais dos terminais fotorreceptores da retina.

Preparação de amostras de retina para microscopia eletrônica de volume

Os pericitos na vasculatura retiniana foram examinados por coloração imunofluorescente com receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β após injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate. A retina marcada foi posteriormente tratada com o método de limpeza de tecido e toda montada para visualizar as vistas tridimensionais dos pericitos ao redor da vasculatura retiniana sob um microscópio confocal.

Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração 

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Aprenda a eviscerar olhos de camundongo para isolar vítreo, retina e lente usando dissecação e centrifugação. Este método permite análises proteômicas precisas de tecidos oculares em pesquisas de neurociência e oftalmologia.

Evisceração de Vítreo Mouse e Retina de Análises Proteômica

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