Name: Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Aprenda a utilizar células-tronco perivasculares humanas para regeneração óssea em modelos ectópicos e ortotrópicos. Este método demonstra ossificação completa em oito semanas com enxertos de PSCs.

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Este trabalho foi financiado pelo Prêmio de Pesquisa Translacional CIRM precoce II TR2-01821, NIH / NIDCR (subvenções R21 DE0177711 e RO1 DE01607), UC Discovery Grant 07-10677, AWJ e RKS têm T32 bolsas de formação prêmios (5T32DE007296-14), JNZ tem uma bolsa de formação CIRM (TG2-01169).

1. Isolamento de células-tronco perivascular Isto é descrito em detalhes no artigo adjacente "Purificação de Células-Tronco perivasculares do tecido adiposo humano Branco", de M. Corselli et al. 2. Andaime Criação <ol><li> Os andaimes são feitos sob medida por protocolo publicado anteriormente a partir de poli (ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA, Burmingham Polymer) com revestimento de hidroxiapatita 4-6. Andaimes apatite revestidos são fabricados a partir de PLGA 85/15 PLGA por evaporação de solvente e um processo de lixiviação em partículas. Andaimes são criados em uma forma esférica (2 mm de diâmetro) para implantação músculo bolsa, uma forma discóide (4 mm de diâmetro) para implantação calvária, ou cilíndrica (4 mm de diâmetro, 6 mm de comprimento) para femorais defeitos segmentais. </li><li> Resumidamente, PLGA / clorofórmio soluções misturadas com sacarose (polímero / rácio de sacarose 5/95, w / w) são expressos em um 200-300 mícrons de diâmetro de molde de Teflon para criar as desvantagens feitos por medidatruct. Após liofilização durante a noite, andaimes são removidos a partir do molde de Teflon e imerso em ddH2O para dissolver a sacarose. Andaimes são desinfectados por imersão em etanol a 70% durante 30 min, seguido de três lavagens da DDQ 2 O. </li><li> Para o revestimento de apatite, um corpo simulado solução de fluido (SBF) é preparado por dissolução de sequencialmente CaCl2, MgCl2 • 6H 2 O, NaHCO3, e K 2 HPO 4 • 3H 2 O na DDQ 2 O. O pH da solução é reduzido para 6 pela adição de ácido clorídrico 1M para aumentar a solubilidade. Na2SC @ 4, KCl, e NaCl são adicionados eo pH final é ajustado para 6,5 (SBF 1). </li><li> Mg2 + e HCO 3 - livre SBF (SBF 2) é preparado por adição de CaCl2 e K 2 HPO 4 • 3H 2 O na ddH2O e pH é reduzido para 6. KCl e NaCl são adicionados eo pH final é ajustado a 6,8. Todas as soluções são estéreis filtrada através de um Membr iM 0,22 PESane (Nalgene). Imediatamente antes do processo de revestimento, os suportes de PLGA secas são submetidos a descarga luminescente de árgon plasma condicionamento (Harrick Scientific) para melhorar a molhagem e uniformidade de revestimento. </li><li> Andaimes causticado são então incubadas em SBF 1 para 12 h, e alterada para Mg2 + e HCO 3 - SBF livre 2 para um outro h 12 a 37 ° C sob agitação suave. Andaimes revestidas são lavadas com ddH2O para remover o excesso de iões e liofilizado antes para estudos posteriores. </li></ol> 3. A implantação do modelo muscular Bolsa <ol><li> 100 ul de uma suspensão PSC em PBS (solução salina tamponada com fosfato) são suavemente cair sobre o implante de PLGA-Based esférica imediatamente antes da implantação. Células foram pré-rotulados por inserção lentiviral de luciferase do pirilampo, de modo a permitir in vivo após a implantação de seguimento. A densidade celular é de 2,5 x 10 5 por implante. </li><li> SCID (grave imunodeficiente combinado) ratinhos são utilizados com 6 semanas de idade. Os animais são anestesiadosthetized por inalação de isoflurano e pré-medicados com buprenorfina (Bedford Labs). Após a preparação Betadine padrão, incisões bilaterais nos membros posteriores são feitas (longitudinal e 2 mm de comprimento). </li><li> Bolsos são cortados nos músculos bíceps femoral por dissecção romba paralela ao eixo da fibra muscular longo. Para cada rato, o implante de PLGA-baseada com PSCs é inserido, e no painel frontal que cobre o músculo é suturada com 5-0 Vicryl (Ethicon). </li><li> A pele é fechada com 5-0 próxima Vicryl num padrão subcuticular. Os animais são tratados com buprenorfina no pós-operatório, durante 48 horas e TMP / SMX (Trimetoprim / sulfametoxazol; Qualitest) durante 10 dias. </li></ol> 4. A implantação do modelo calvária Defeito <ol><li> Após anestesia com isoflurano de ratinhos SCID (12-14 semanas de idade), o cabelo é cortado ea pele desinfectada com betadine por protocolo. </li><li> A incisão na pele de 8 mm é feita ao longo da sutura médio-sagital da calota mouse. Em seguida, o calvarial periósteo é gentilmente removido por Q-tip aplicação. </li><li> Em seguida, usando bits de diamante revestidos trefina em uma broca de alta velocidade dental, uma 4-milímetros defeito osso parietal é criado. O defeito é espessura total - no entanto o cuidado é tomado para não lesar a dura-máter subjacente. </li><li> O feito por medida do implante de PLGA-baseada com PSCs enxertados é então colocado suavemente no local do defeito. A densidade celular é de 2,5 x 10 5 por implante. Finalmente, a pele é suturada com 6-0 Vicryl. Os animais são tratados com buprenorfina no pós-operatório, durante 48 horas e TMP / SMX durante 10 dias. </li></ol> 5. A implantação do modelo Femoral segmentar Defeito <ol><li> Ratos atímicos (12-14 semanas de idade) são anestesiados sob inalação de isoflurano. O fêmur é limpo e preparado por protocolo padrão com betadine (Figura 1). </li><li> Uma incisão de 27-30 mm longitudinal é feita sobre o aspecto ântero-lateral do fêmur. O eixo femoral é, então, exposta através da separação da lat vastuseralis e bíceps femoral (Figura 2). </li><li> Para maximizar a consistência de regeneração óssea, o periósteo sobrejacente o defeito femoral é completamente removido com o segmento ressecado femoral. </li><li> Uma placa de polietileno (comprimento, 23 mm, largura, 4 mm, altura, 4 mm) é colocado sobre a superfície anterolateral do fémur. A placa contém seis orifícios pré-perfurados para acomodar 0,9 mm de diâmetro fios roscados Kirschner (Zimmer). Tomando a placa como um modelo, seis fios roscados Kirschner são perfurados através da placa e ambos os córtices (Figura 3). </li><li> Em seguida, com uma lâmina de serra oscilante pequena (Stryker, MI), um 6-milímetros defeito meados de diafisária é criado. Defeitos segmentais são então tratados através da inserção de implantes de PLGA base que tenham sido carregados com células como por protocolo (Figura 4). </li><li> O músculo sobrejacente e fáscia são fechados com Vicryl 4-0 suturas absorvíveis para fixar o implante no lugar, ea pele é suturada. </li> 6. Testes in vivo <ol><li> Avaliações radiográficas são realizadas de forma longitudinal, tanto de alta resolução e alta resolução XR μCT (micro tomografia computadorizada) análise. Para μCT análise (SkyScan 1172F), as imagens são digitalizadas com uma resolução de 19.73 mM (100 kV e 100 mA fonte de radiação, usando um filtro de alumínio 0,5 milímetros). As imagens são analisadas utilizando DataViewer, Recon, CTAN, e softwares CTVol. </li><li> Imagiologia bioluminescência é também feito de uma forma de série para avaliar células enxerto, a viabilidade de proliferação, e não incluem a migração para fora do local do implante. Imagiologia bioluminescência é realizada utilizando um dispositivo de IVIS Lumina II (Caliper Life Sciences). Saídas de luz são quantificados utilizando software imagem viva (Xenogen). Saída total de luz é registrada em fótons por segundo / cm ² / esterradiano. </li><li> A análise histológica e histomorfométrica é feita pós-morte. Colorações de rotina empregados incluem tricrômico de Masson, azul de anilina, pentachrome, e Picrosirius vermelho. A análise histomorfométrica é realizada facilmente com qualquer anilina azul ou manchas pentachrome, em que aparece osteóide azul escuro e amarelo, respectivamente. Pixels por campo de alta potência são calculadas usando a ferramenta varinha mágica no Adobe Photoshop. </li></ol> 7. Os resultados representativos Como ambos os defeitos calvária e femoral são críticos porte, não há cura significativa deve-se esperar sem o tratamento com fatores de crescimento ou de células-tronco exógenas. Em termos de manobras cirúrgicas, a dissecção bolsa muscular deve ser ao longo dos planos fasciais e, portanto, sangramento mínimo deve ser encontrado. Mesmo que o modelo de bolsa muscular é realizada bilateralmente, o rato deveria estar andando com facilidade no dia pós-operatório 1. Para o defeito calvária, sangramento é encontrado, mas pode ser embebido com um Q-ponta. Extremo cuidado deve ser tomado para não lesar a dura-máter subjacente - como isso irá interferircom cura normal. Para o modelo de FSD, toma-se cuidado para não ferir os vasos sanguíneos principais de modo a não causar sangramento excessivo ou o nervo femoral para evitar danos neurológicos. Os fios de Kirschner são perfurados com uma ligeira pressão de modo a não danificar o osso cortical no processo. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1."> Figura 1. Preparo pré-operatório para defeito segmentar Femoral (FSD) em ratos atímicos. Ratos machos (12-14 semanas de idade) são anestesiados sob inalação de isoflurano. O fêmur é limpo e preparado por protocolo padrão com betadine. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2."> Figura 2. Exposição cirúrgica para Femoral segmentar Defeito criação (FSD). Uma incisão longitudinal 27-30 milímetros é feita sobre o aspecto ântero-lateral do fêmur. O aspecto lateral do eixo femoral é, então, exposta através da separação da vasto laterale bíceps femoral. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3."> Figura 3. Fixação Femoral para segmentar Defeito criação (FSD). Uma placa de polietileno (comprimento, 23 mm, largura, 4 mm, altura, 4 mm) é colocado sobre a superfície anterolateral do fémur. A placa contém seis orifícios pré-perfurados para acomodar 0,9 mm de diâmetro fios roscados Kirschner. Tomando a placa como um modelo, seis fios roscados Kirschner são perfurados através da placa e ambos os córtices. Em seguida, um defeito 6 mid-diafisária milímetros é criado. Uma vez que esta é realizada, um andaime feito por medida, que está directamente inserido exactamente se encaixa no local do defeito (não mostrado). <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/2952/2952fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4."> Figura 4. Exemplo de defeito ósseo craniano pós-operatória. A 4 mm, defeito circular calvária é criado no osso parietal direito em ratinhos atímicos. Imaged aqui é um local do defeito implantados comPSCs em 8 semanas pós-operatórias. Note-se a presença de osso novo dentro do local do defeito. </ol>

<ol><li>Crisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3, 01-13 (2008).</li>
<li>Chen, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+multi-lineage+progenitor+cells+in+human+organs%3A+regenerative+units%2C+cytokine+sources+or+both%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: regenerative units, cytokine sources or both.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 20, 429-434 (2009).</li>
<li>Corselli, M., Chen, C. W., Crisan, M., Lazzari, L., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+ancestors+of+adult+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Perivascular ancestors of adult multipotent stem cells.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 1104-1104 (2010).</li>
<li>Zara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nell-1+enhances+bone+regeneration+in+a+rat+critical+sized+femoral+segmental+defect+model%5BTitle%5D)+AND+%22Plast.+Reconstr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Nell-1 enhances bone regeneration in a rat critical sized femoral segmental defect model.</a> Plast. Reconstr. Surg. , Forthcoming (2010).</li>
<li>James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleterious+Effects+of+Freezing+on+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells+In+Vitro+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Deleterious Effects of Freezing on Osteogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stromal Cells In Vitro and In Vivo.</a> Stem Cells Dev. 20, 427-439 (2011).</li>
<li>Lee, M., Chen, T. T., Iruela-Arispeb, M. L., Wu, B. M., Dunn, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+protein+delivery+from+modular+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of protein delivery from modular polymer scaffolds.</a> Biomaterials. 28, 1862-1870 (2007).</li>
<li>Aghaloo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+role+of+nell-1+gene+modified+goat+bone+marrow+stromal+cells+in+promoting+new+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">A study of the role of nell-1 gene modified goat bone marrow stromal cells in promoting new bone formation.</a> Mol. Ther. 15, 1872-1880 (2007).</li>
<li>Levi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells+Stimulate+Autogenous+Skeletal+Repair+via+Paracrine+Hedgehog+Signaling+with+Calvarial+Osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human Adipose-Derived Stromal Cells Stimulate Autogenous Skeletal Repair via Paracrine Hedgehog Signaling with Calvarial Osteoblasts.</a> Stem Cells Dev. 20, 243-257 (2011).</li>
<li>Leucht, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+and+Hox+status+determine+progenitor+cell+fate+during+adult+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin and Hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration.</a> Development. 135, 2845-2854 (2008).</li>
<li>Rajashekhar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFATS+collection%3A+Adipose+stromal+cell+differentiation+is+reduced+by+endothelial+cell+contact+and+paracrine+communication%3A+role+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IFATS collection: Adipose stromal cell differentiation is reduced by endothelial cell contact and paracrine communication: role of canonical Wnt signaling.</a> Stem Cells. 26, 2674-2681 (2008).</li>
<li>Zuk, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Mol Biol Cell. 13, 4279-4295 (2002).</li>
</ol>

KT, BP e CS são inventores de perivasculares de células-tronco relacionadas com patentes depositadas pela UCLA. Drs. KT, e CS são fundadores da Scarless Laboratories Inc. que sublicenças perivasculares de células-tronco relacionadas com patentes da UC Regents. Dr. Chia Soo também seja um diretor de Scarless Laboratories, Inc.

O isolamento de PSCs é bem descrito em outro lugar 1-3, incluindo uma publicação JOVE separadamente submetidos especificamente endereçamento protocolos de isolamento PSC e métodos. O objetivo específico deste artigo é descrever e demonstrar 3 protocolos para PSC in vivo pedido de formação óssea / regeneração. A bolsa muscular SCID mouse é um modelo comumente descrito para a formação óssea ectópica humana 7. Existem diferenças importantes entre ectópicos e ortotópico (defeito) modelos para osso, incluindo a interacção com parácrina hospedeiras células formadoras de osso 8, bem como uma abundância de factores osteogénicos sinalização presentes no microambiente defeito esquelético. Dois defeitos são apresentados aqui, um defect8 calvária e defeito segmentar femoral 4. Ambos estão bem documentados para ser crítico empresas (ou seja, não vai curar a sua própria). Diferenças interessantes entre existem defeitos de calvárias e femoral. Primeiro, ocelular: interação celular entre PSCs xenografted e células endógenas é muito diferente. Em termos de um defeito calvária, PSCs interagir com a dura-máter subjacente (a camada mais externa das meninges), bem como os osteoblastos e células periosteais circunscrevem o local do defeito. Importante, a interacção entre as células implantadas e osteoblastos circundantes 8, ou células implantadas e dura subjacente (Levi et ai., No prelo) são críticos para células estaminais normais mediada osteogénese para prosseguir. Em termos do defeito femoral segmentar (FSD), PSCs xenografted são expostos a uma célula muito diferente e ambiente de citoquinas. Por exemplo, o local de FSD é composto da medula e que acompanha as células estaminais mesenquimais, bem como o endósteo, periósteo e de ossos longos osteoblastos. Teoricamente, cada célula tem sua própria reação à injúria, e cada um pode ter celular: interações celulares com xenoenxertos PSC. Outras diferenças claras entre calváriae defeitos femorais. Os ossos calvárias inicialmente formar através de ossificação intramembranosa, enquanto que os ossos longos formar através de um intermediário de cartilagem (ossificação endocondral). Além disso, o processo de reparação pós-lesão também imita estas origens de desenvolvimento. Pós-FSD, cartilagem formação de calo é observada, ao passo que nenhum intermediário cartilagem é formado dentro de um defeito do osso parietal. Finalmente, a origem embrionária do crânio podem diferir do que a dos ossos longos. A maioria do crânio (incluindo células perivasculares - pericitos - em toda a região da cabeça) é derivado a partir da crista neural (mesectoderm), enquanto o esqueleto apendicular é de derivação mesoderme paraxial 9. Todas essas diferenças podem resultar em diferenças significativas em termos de PSC-mediada reparação óssea. A utilização de PSCs tem várias vantagens sobre tradicionais derivadas de tecido adiposo células do estroma (ASC). PSCs não requerem cultura e são uma população purificada de células which não inclui outras células do estroma que não participam - ​​e pode até mesmo regular negativamente - a diferenciação osteogênica, como as células endoteliais 10. Em contraste, por exemplo, análises clonais de ASC mostram que apenas uma subpopulação são capazes de sofrer diferenciação in vitro osteogénico 11. Em última análise, os esforços de engenharia de tecidos esqueléticos provavelmente incorporar um células estaminais osteocompetent (tais como PSCs) com factores de crescimento exógenos e um andaime osteocondutor (tais como HA-PLGA utilizado nos presentes métodos) de modo a melhor curar defeitos do esqueleto.

uso de células-tronco humanas perivasculares para regeneração Óssea

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Células estaminais perivascular (PSC) pode ser isolado em números suficientes de tecidos múltiplas para fins de esquelético de engenharia de tecidos 1-3. CPPs são uma população FACS-classificada de &quot;pericitos&quot; (CD146 + CD34-CD45-) e de células adventícias &#39;(CD146-CD34 + CD45-), cada qual temos anteriormente relatados para ter propriedades de células-tronco mesenquimais. PSCs, como MSCs, são capazes de sofrer diferenciação osteogénico, bem como secretam pró-osteogénico 1,2 citocinas. No presente protocolo, demonstramos a osteogenicity de PSCs em diversos modelos animais, incluindo uma bolsa de implantação muscular em SCID (Severe Combined imunodeficientes) camundongos SCID, um rato de defeito ósseo craniano e um defeito femoral segmentar (FSD) em ratos atímicos. O modelo de bolsa muscular na coxa é utilizado para avaliar a formação óssea ectópica. Defeitos de calvárias estão centradas no osso parietal e são standardly 4 mm de diâmetro (tamanho crítico) 8. FSDs são bicortical e são estabilizados comuma barra de polietileno e K-fios 4. O FSD descrita é também um defeito de tamanho crítico, o que não significativamente curar a si própria 4. Em contraste, se as células estaminais ou factores de crescimento são adicionados ao local do defeito, a regeneração óssea significativa pode ser apreciada. O objectivo geral do xeno-enxerto PSC é demonstrar a capacidade osteogénico deste tipo de célula em modelos de regeneração tanto ectópicos e ortotópico ósseas.

As células-tronco perivascular (PSC) é um romance classe de células-tronco para a regeneração do tecido ósseo semelhante a células-tronco mesenquimais (MSCs). PSCs pode ser isolado por FACS (classificação de células activadas por fluorescência) a partir de tecido adiposo adquiridos durante procedimentos padrão lipoaspiração, então combinada com um andaime osteoindutora para alcançar a formação de osso<em&gt; In vivo</em&gt;.

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

As células-tronco perivasculares (PSCs) humanas podem ser isoladas em quantidades suficientes de múltiplos tecidos para fins de engenharia de tecido esquelético1-3. As PSCs são ...

O objetivo geral do experimento a seguir é observar os efeitos da implantação de células-tronco perivasculares em modelos de diferenciação óssea ectópica e ortotópica. Isso é alcançado primeiramente isolando células-tronco do tecido adiposo utilizando tecnologia de fax. Em seguida, são fabricadas estruturas personalizadas para fornecer uma superfície para a diferenciação celular em um ambiente ectópico ou ortotópico.Para testar a formação óssea mediada por CVPs, defeitos esqueléticos são criados utilizando um modelo de bolsa muscular em camundongo skid, um modelo de calvária em camundongo skid ou um modelo de defeito segmentar femoral em rato atímico, e o enxerto com biomaterial é posicionado dentro do defeito. A análise radiográfica, histológica e bioquímica revela que a diferenciação de células-tronco perivasculares leva à formação significativa de osso in vivo. A principal vantagem do uso de células-tronco perivasculares em comparação com outras fontes tradicionais de células-tronco é que os CVPs, ou células-tronco perivasculares, constituem uma população mais homogênea, o que aumenta a pureza das células-tronco, potencializa a produção de fatores tróficos e possivelmente incrementa a formação óssea.Comece criando um andamio conforme descrito no manuscrito suplementar. Prepare o andamio para implante adicionando uma suspensão celular a ele. Para os modelos de bolsa muscular em camundongo ou defeito calvarial, utilize uma densidade de 250.000 células por cem microlitros após anestesiar.Animais com seis semanas de idade anestesiados com isoflurano e buprenorfina. Faça uma preparação padrão com Betadine na perna traseira. Em seguida, faça uma incisão bilateral longitudinal de dois milímetros e use dissecação romba para criar bolsos com profundidade de quatro milímetros nos músculos bíceps femoral.Paralelamente às fibras musculares, deve-se encontrar apenas sangramento mínimo. Insira o implante enxertado com CEPs. Agora, sutura a fáscia sobrejacente ao músculo com um padrão contínuo simples usando fio Vicryl 5-0.Em seguida, feche a pele com Vicryl 5-0 em padrão subcuticular. No pós-operatório, trate os animais com buprenorfina por 48 horas e T-M-P-S-M-X por 10 dias. O camundongo deve caminhar com facilidade no primeiro dia pós-operatório.Após a indução da anestesia com isoflurano em um camundongo skid de 12 a 14 semanas de idade, realize a preparação padrão da região calvariana com Betadine. Inicie com uma incisão cutânea de oito milímetros de comprimento ao longo da sutura sagital mediana do crânio do camundongo.Em seguida, remova suavemente o periósteo da calvária com um aplicador de algodão e use um aplicador para absorver o sangramento. Agora, utilizando uma broca trepanadora revestida com diamante acoplada a uma broca dentária de alta velocidade, faça um defeito no osso parietal de quatro milímetros. O defeito deve ser de espessura total, ou seja, atravessando completamente o osso, mas tenha extremo cuidado para não lesar a dura-máter subjacente, pois isso interferirá na cicatrização.Agora, coloque suavemente o implante e enxertado com PSCs no local do defeito. Finalmente, feche a pele com seis pontos de Vicryl no pós-operatório. Trate os animais com buprenorfina por 48 horas e T-M-P-S-M-X por 10 dias.Inicie esfregando e preparando o fêmur de um rato amic com 12 a 14 semanas de idade, que foi anestesiado com isoflurano. Utilize o protocolo padrão de Betadine. Faça uma incisão longitudinal de 27 a 30 milímetros na face anterior lateral do fêmur.Em seguida, exponha o corpo do fêmur separando os músculos vasto lateral e bíceps femoral para evitar sangramento excessivo. Tenha cuidado em torno dos principais vasos sanguíneos. Para maximizar a consistência da regeneração óssea, completamente.Remova o periósteo que recobre o defeito femoral, juntamente com o segmento femoral ressecado. Evite danificar o nervo femoral para prevenir lesões neurológicas. Agora, posicione uma placa de polietileno na superfície anterior lateral do fêmur.Seis orifícios pré-perfurados na placa acomodam pinos de Kirschner rosqueados com diâmetro de 0,9 milímetro. Utilizando a placa como molde, perfure seis pinos de Kirschner rosqueados através da placa e de ambas as cortesias. Com uma pequena lâmina de serra oscilante, faça um defeito médio de seis milímetros.Em seguida, implante a PSC e o suporte enxertado no defeito. Feche o músculo e a fáscia sobrejacentes com quatro pontos absorvíveis de Vicryl. Para fixar o implante no lugar, administre analgesia ao rato durante dois dias após a cirurgia e monitore a deiscência da ferida ao longo de quatro semanas após a implantação no bolsão muscular.Houve um aumento gradual do volume ósseo e da densidade mineral óssea, conforme observado com o enxerto de PSC por meio de análise de micro-TC e de RX ao longo de oito semanas após a introdução de um defeito calvarial; nenhuma cicatrização óssea foi observada na ausência de um suporte devido ao tamanho crítico do defeito, mesmo com um suporte, mas sem células. Estimou-se uma cicatrização mínima em torno de 20%, conforme esperado. Foi observado um aumento gradual da ossificação do defeito com um suporte semeado.A ossificação principal ocorreu dentro de duas semanas. A ossificação completa ocorreu após oito semanas da introdução de um defeito femoral. Um aumento gradual da ossificação ocorreu quando o defeito foi tratado com BMP-2, com união observada em alguns animais já na quarta semana, e todas as cobaias estavam curadas após oito semanas.Em contraste, nenhuma união óssea foi observada na ausência de um suporte ou com um suporte sem células ou proteína recombinante. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células-tronco paravasculares, como utilizar essas células-tronco paravasculares em combinação com suportes osteoindutivos de PLGA e, finalmente, como usar esses produtos combinados de suporte e células em três métodos diferentes de engenharia de tecidos. Ao tentar realizar cada procedimento conforme apresentado aqui, há alguns pontos importantes a serem considerados. Primeiro, no modelo de defeito calvarial, a preservação precisa da dura-máter garante que a cicatrização adequada ocorrerá.Em segundo lugar, para o modelo de defeito segmental no fêmur de rato, é importante minimizar o trauma aos nervos e vasos sanguíneos circundantes. Uma vez que um indivíduo domine uma determinada técnica cirúrgica como a apresentada aqui, pode-se esperar que cada implante no bolsão muscular leve aproximadamente 20 minutos para ser realizado, e cada defeito calvarial e defeito segmental femoral possa levar até 30 minutos para ser adequadamente executado.

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Bioengineering

Bioengenharia

Este protocolo descreve o isolamento de derivadas de tecido adiposo a partir de células do estroma lipoaspirado e a criação de um defeito de 4 milímetros de tamanho crítico calvária em avaliar a regeneração óssea.

Reparação de um modelo de defeito crítico porte calvária Usando derivadas de tecido adiposo células do estroma colhidas lipoaspirado

As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm potencial de diferenciação em relação à linhagem osteoblástica quando estimuladas com fatores solúveis ou biomateriais específicos. Este trabalho apresenta uma nova opção para a entrega de MSCs a partir de membrana amniótica humana (AM-hMSCs) que emprega a matriz óssea bovina Nukbone (NKB) como um andaime.

Isolamento de mesenquimais humanas células-tronco e seu cultivo na matriz óssea Porous

tecido cardíaco humano abriga populações de células precursoras perivasculares multipotentes que podem ser adequados para a regeneração do miocárdio. A técnica aqui descrita permite o isolamento e purificação simultânea de duas populações de células estromais multipotentes associados com os vasos nativos de sangue, ie CD146 + CD34 - pericitos e células CD34 + CD146 - células adventícias, a partir do miocárdio humano.

Isolamento de perivascular Multipotentes populações de células precursoras a partir de tecido cardíaco humano

A cultura de células estromais mesenquimais humanas (hMSCs) com soro autólogo, reduz os riscos de rejeição por material de xenogénico e outros efeitos negativos. Também permite a recuperação de um subconjunto de células progenitoras mesodérmica, que pode fornecer as hMSCs frescos. Incorporação hMSCs em um coágulo de fibrina autóloga permite fácil manuseio e implantação cirúrgica eficaz.

Estromais mesenquimais cultura de células e Entrega em condições autólogas: Uma abordagem inteligente para aplicações ortopédicas

As células estromais derivadas do tecido adiposo podem ser úteis para a engenharia de novos tecidos a partir das próprias células do paciente. Apresentamos um protocolo para o isolamento de uma subpopulação de células estromais derivadas do tecido adiposo humano (ASCs) com potencial osteogênico aumentado, seguido da aplicação das células em um ensaio de cicatrização calvarial in vivo.

Isolamento rápido de BMPR-IB + adiposo-derivados de células estromais para uso em um Defeito Modelo Cura calota craniana

Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar vasos sanguíneos formação em vivo e em tempo real em 3D andaimes por microscopia do multiphoton. Angiogênese em andaimes geneticamente modificados foi estudado em modelo murino raspagem de osso crítico defeito. Mais novos vasos sanguíneos foram detectados no grupo de tratamento do que em controles.

Visualizando a angiogênese por Multiphoton microscopia In Vivo no andaime de 3D-PLGA/nhập geneticamente modificado para raspagem crítico reparo de defeito ósseo

É apresentado um método para criar e imagem viva diferentes meninos de medula óssea humanizados em camundongos. Com base no nicho de suporte criado por células mesenquimais humanas, a adição de células endoteliais humanas induz a formação de vasos humanos, enquanto que a adição de rhBMP-2 induz a formação de tecido ósseo maduro quimérico humano-rato.

Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

Apresentamos um protocolo para investigar os biomarcadores de expressão do mRNA de células periósteo-derivado (PDCs) induzidas pela vitamina C (vitamina C) e 1,25-dihidroxi vitamina D [1,25-(OH)2D3]. Além disso, avaliamos a capacidade dos PDCs para diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteócitos.

Isolamento de células-tronco mesenquimais do periósteo Alveolar humano e efeitos da vitamina D na atividade osteogênica do periósteo-derivado de células

A terapia óssea via ossificação endocondral através da implantação de tecido cartilaginoso artificial produzido a partir de células-tronco mesenquimais tem o potencial de contornar os inconvenientes das terapias convencionais. Os hidrogéis de ácido hialurônico são eficazes na ampliação de enxertos de cartilagem uniformemente diferenciados, bem como na criação de osso integrado com vascularização entre enxertos fundidos in vivo.

Formação Óssea Integrada Através da Ossificação Endocondral In Vivo Usando Células-Tronco Mesenquimais

Aqui, estabelecemos osteo-organoides in vivo desencadeados por andaimes de gelatina carregados com proteína 2 morfogenética óssea para colher células-tronco / progenitoras hematopoiéticas terapêuticas para a reconstrução de um sistema hematopoiético e imunológico danificado. No geral, essa abordagem pode fornecer uma fonte celular promissora para terapias celulares.

Abordagem osteoorganoide in vivo para coleta de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas terapêuticas

Aprenda a utilizar células-tronco perivasculares humanas para regeneração óssea em modelos ectópicos e ortotrópicos. Este método demonstra ossificação completa em oito semanas com enxertos de PSCs.

Uso de Células-tronco humanas perivasculares para Regeneração Óssea

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