Isolamento de variantes de vírus de RNA Fidelity e Caracterização de frequência de mutação de vírus

Os vírus de RNA utilizam polimerases de RNA codificadas pelo próprio vírus para replicar seus genomas. Essas polimerases possuem uma taxa de erro intrinsecamente mais alta, o que permite ao vírus se adaptar e evoluir rapidamente. Este vídeo apresenta um método otimizado para triagem e identificação de vírus com mutações em sua polimerase de RNA que afetam a taxa de erro ou a fidelidade durante a replicação.

Primeiro, aplicam-se mutagênicos às células hospedeiras virais para determinar o nível máximo de mutagênico que pode ser utilizado sem matar as células ou inibir o vírus. Uma vez determinadas as condições ideais, o vírus é submetido a passagens sob pressão seletiva de mutagênicos de RNA. Em seguida, a população resistente ao mutagênico é sequenciada para identificar a mutação responsável.

Em seguida, o mutante resistente ao agente mutagênico é isolado. A cinética de replicação é monitorada e os resultados mostram aumentos ou diminuições na fidelidade da polimerase. Associado à resistência ampla a mutagênicos de RNA e alterações na frequência de mutação da população viral.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como ácidos de fidelidade bioquímica utilizando polimerases purificadas, é que os métodos descritos são válidos para qualquer vírus de RNA que possa ser cultivado em cultura de tecidos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de virologia, como o papel da taxa de polimerase na adaptação e evolução viral. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades porque as pressões seletivas que utilizam são ou excessivamente fortes ou excessivamente fracas, e o tamanho da amostra de sequência analisada da região e o número de clones não foram otimizados para garantir poder estatístico.

Inicie este experimento determinando a faixa de concentrações de mutagênicos que podem ser utilizadas nos experimentos seguintes sem resultar em morte celular. Aspire o meio de seis placas de poços contendo monocamadas subconfluentes de células hilares. Em seguida, adicione dois mililitros de meio suplementado com mutagênico aqui, sendo utilizados os mutagênicos ribavirina, cinco fluorouracila, azacitidina, cloreto de magnésio e cloreto de manganês.

Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, a cada 24 horas, durante os próximos dois a sete dias, utilize uma placa de células para verificar a viabilidade por exclusão de azul de tripano. Usando um hemocitômetro, calcule a porcentagem de células viáveis para cada concentração de mutagênio, incluindo as condições de controle não tratadas que resultem em menos de 50% de morte celular no ponto final da infecção.

Quando são alcançados os títulos máximos ideais, a próxima etapa do procedimento é determinar a concentração do agente mutagênico que exercerá uma pressão seletiva ótima sem supermutagenizar a população nas concentrações apropriadas. Cada genoma é mutado em pelo menos uma ou duas posições. O agente mutagênico, portanto, gerará a mutação de resistência, a qual será então selecionada ao longo das passagens.

Se forem introduzidas muitas mutações, os mutantes que carregam a mutação de resistência serão eles próprios letais. O agente mutagênico dificulta o isolamento deles em placas de seis poços semeadas com he. Nossas células em dois mililitros de meio suplementado com agente mutagênico utilizam a mesma faixa de concentrações que antes, excluindo concentrações que resultaram em mais de 50% de morte celular.

Incube por duas horas para permitir a absorção do agente mutagênico após a incubação. Aspire o meio e infecte com o vírus em baixa multiplicidade de infecção em 200 microlitros; incube por 15 a 60 minutos para permitir que o vírus infecte as células, agitando a placa em intervalos regulares para garantir que o inóculo cubra completamente a monocamada celular. Aspire o vírus inoculado e lave duas vezes com dois mililitros de PBS para remover o máximo possível do inóculo.

Em seguida, adicione meio com o mutagênico a cada poço e incube as células pelo equivalente a três a seis ciclos de replicação, geralmente de dois a sete dias. Recolha o vírus de cada poço e realize um ensaio padrão de placas ou diluição limitante para determinar o efeito antiviral sobre a titulação viral a partir dos títulos calculados. Identifique a concentração do mutagênico que reduz os títulos virais em comparação com a infecção controle não tratada em 0,5 a dois logs e que também não seja altamente tóxica para as células.

De forma ideal, com menos de 50% de toxicidade para isolar variantes resistentes a mutagênicos, comece passando o vírus em células hospedeiras na concentração ideal de cada mutagênico; o vírus pode precisar ser repassado até 30 vezes, e em cada passagem, titule o vírus e repita a infecção e incubação com o mutagênico conforme mostrado aqui. Os títulos virais das amostras tratadas com mutagênico devem diminuir durante as primeiras passagens em comparação com o título viral original e os títulos virais do controle não tratado. Assim que os títulos virais de uma determinada série atingirem a mesma magnitude dos títulos do controle não tratado, isso sugere resistência.

Extraia o RNA viral para sequenciamento usando iniciadores que amplifiquem os genes da polimerase ou replicase do vírus de interesse. Gere o cDNA do genoma viral por RT-PCR e, em seguida, sequencie o DNA. Após obter as informações de sequência.

Utilize um software de alinhamento para alinhar as sequências resultantes com o consenso de referência e identificar as novas mutações pontuais. Além disso, verifique os cromatogramas em busca de picos minoritários que possam ter sido ignorados pelo software de alinhamento. Um mutante que represente de 20 a 30% da população total ainda aparecerá como um pico, mas pequeno demais para ser identificado como um nucleotídeo misto pela análise de sequência padrão. Para identificar a mutação de interesse, procure polimorfismos de nucleotídeo único que apareçam exclusivamente na população tratada com mutagênico em comparação com o controle não tratado da mesma passagem, conforme mostrado aqui. Uma vez identificada uma mutação, a variante resistente deve ser regenerada a partir de DNA infeccioso ou isolada em cultura de tecidos, e o fenótipo de resistência deve ser confirmado.

Aqui, isolamos por ensaio de placa para separar os mutantes identificados. Prepare diluições seriadas da amostra resistente ao nitrogênio e adicione-as a monocamadas celulares em placas de seis poços para um ensaio de placa, após uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. Adicione uma cobertura de agarose de dois a cinco dias após a infecção.

A placa deve estar claramente visível. Idealmente, uma das placas produzirá entre 10 e 50 placas bem separadas. Marque a localização das placas na placa com um ponto, usando um marcador, tomando cuidado para não deslocar e mover a posição da camada superior, mergulhando suavemente uma ponteira de filtro P 200 através da camada superior de ágar.

Para alcançar a placa, levante cuidadosamente a ponta do revestimento e transfira o tampão de aros para um tubo de microcentrifugação contendo 250 microlitros de meio. Uma quantidade suficiente de vírus será transferida independentemente de o tampão de aros ser liberado da ponta; vorte o tubo e colete até dez vezes por tratamento de ute. Guarde uma porção da amostra para amplificar o vírus vivo posteriormente.

Em seguida, extraia o RNA do restante da amostra e realize a R-T-P-C-R para identificar a amostra de placa que contém a mutação desejada. Sequencie o cDNA. Certifique-se de que não haja mutações adicionais.

Em seguida, prepare um estoque maior deste vírus para todos os estudos subsequentes. Depois, confirme a resistência conferida pela mutação identificada. Repita o ensaio com agentes mutagênicos utilizando diversas condições mutagênicas.

Se a variante for resistente a múltiplos mutagênicos, provavelmente possui fidelidade aumentada. Como mutações que alteram a fidelidade são mapeadas para a polimerase, é importante confirmar que a cinética de replicação não foi significativamente alterada. Antes de determinar as frequências de mutação, examine a replicação por pelo menos duas abordagens complementares.

Por exemplo, uma abordagem que examina a produção de vírus, como ensaio de placa ou TCID 50, pode ser realizada além de uma abordagem que examina a síntese de RNA, como R-T-P-C-R quantitativo ou northern blot. Em seguida, para confirmar que a alteração identificada na polimerase que confere resistência ao mutagênico altera a replicação, as frequências de mutação de fidelidade são medidas. Isso pode ser realizado tanto na população de vírus viável quanto na população total de vírus.

Para determinar as frequências de mutação da população total de vírus, que inclui variantes viáveis e não viáveis, extraia o RNA e amplifique por RT-PCR uma região de 800 a 1.200 nucleotídeos de uma sequência codificante conhecida por apresentar variantes genéticas, como aquela que codifica uma proteína estrutural. Em seguida, clone o produto purificado por topo TA para cada população viral a ser estudada. Selecione 96 colônias identificadas como portadoras de inserção positiva por meio da triagem azul-branca em placas revestidas com Xga.

Realize uma PCR de colônia simples para confirmar a validade do peneiramento azul-branco. Com base no tamanho do fragmento e nas condições acima, cerca de 90% das colônias devem ser positivas. Para cada colônia branca positiva, use um palito de dente para transferir cada colônia para um mililitro de meio LB em 96.

Bem, as placas de cultura bacteriana são incubadas durante a noite a 37 graus Celsius com agitação constante. No dia seguinte, isole o DNA preparando mini preparos em formato de placa de 96 poços, sequenciando cada placa com quantidade suficiente de iniciadores para obter cobertura máxima do segmento clonado.

Dois primers com cobertura de 600 bases devem ser suficientes. Realize a análise de sequência utilizando uma sequência de referência ou consenso para cada população e um software de alinhamento apropriado capaz de identificar prontamente polimorfismos de nucleotídeo único aqui. Busque o software Man da DNA Star Laser.

O gene é usado inicialmente para descartar sequências de baixa qualidade, como aquelas com chamada de bases inadequada em muitas extremidades ou aquelas que são muito curtas em comprimento. Alinhe as sequências restantes. Identifique a faixa de nucleotídeos coberta por todas as sequências na análise.

Descarte clones que não estejam completamente cobertos nesta região. Por motivos de comparação, é essencial que a mesma região esteja totalmente coberta. Identifique e conte os polimorfismos de nucleotídeo único que diferem da cepa de referência.

Calcule a frequência de mutação dividindo o número total de polimorfismos de nucleotídeo único pelo número total de nucleotídeos sequenciados. Apresente este valor como o número médio de mutações por 10.000 nucleotídeos sequenciados. Se o mesmo polimorfismo de nucleotídeo único aparecer em um grande número de clones, apresente dois valores que incluam ou excluam essas mutações repetidas.

Determine a distribuição das mutações. Elabore uma lista ordenada do número de clones em cada população que apresenta 0, 1, 2, 3 e assim por diante. Mutações na região sequenciada como opção.

Utilize as sequências editadas para calcular todas as comparações par a par possíveis dentro de uma amostra, a fim de obter valores médios de diversidade populacional. Vários programas de alinhamento estão disponíveis aqui. O programa de análise genética evolutiva molecular, também chamado de mega, é usado para determinar as condições ótimas para seleção de resistência à mutagênese de RNA.

Nossas células foram tratadas com concentrações crescentes de ribavirina e infectadas com o vírus Cox AKI B selvagem com uma multiplicidade de infecção de 0,01, 48 horas após a infecção. O vírus descendente foi colhido e as titulações foram determinadas por TCID50. Este gráfico indica a porcentagem de células sobreviventes ao tratamento abaixo do eixo x, determinada por coloração com azul de tripano 48 horas após a infecção.

Os resultados mostram que concentrações de 100 e 200 micromolares reduzem o título do vírus em um a dois logaritmos sem afetar a viabilidade celular. Para selecionar populações resistentes ao mutagênico, o vírus CHI ganga foi passado em células hilar na presença (barras cinzas) ou ausência (barras pretas) de 50 micromolares de ribavirina; após cada passagem, a progênie viral foi quantificada por ensaio clássico de placas em células BHK, conforme pode ser observado aqui. O efeito mutagênico é evidente nas primeiras passagens, nas quais o título do vírus tratado diminuiu em dois logaritmos.

Gradualmente, Titus retornou aos níveis normais não tratados. Nenhuma diferença significativa é observada em cinco populações tratadas com mutagênico em comparação com as não tratadas, sugerindo que variantes resistentes foram selecionadas. De fato, o sequenciamento identificou mutações únicas na população viral submetida ao tratamento com ribavirina para confirmar a resistência ampla a mutagênicos de RNA de estrutura diferente. A variante de alta fidelidade A 3 72 V do vírus COA B três, que inicialmente foi isolada na triagem, foi testada quanto à sensibilidade reduzida a diferentes concentrações dos mutagênicos de RNA ribavirina, cinco-fluorouracil e azacitidina.

As nossas células foram tratadas com as concentrações indicadas de ribavirina e infectadas com o vírus Cox AKI tipo selvagem B três, com uma multiplicidade de infecção de 0,01, 48 horas após a infecção. O vírus descendente foi coletado e os títulos foram determinados por TCID50. Aqui são mostrados os títulos do tipo selvagem e da variante A372V em função da concentração do agente mutagênico. A variante A372V apresenta consistentemente títulos mais altos que o tipo selvagem.

Em todas as condições testadas para determinar a cinética de crescimento em um único passo da produção viral, nossas células foram infectadas com uma multiplicidade de infecção de 10 com a variante de alta fidelidade do tipo selvagem, A372V, ou com a variante deficiente em replicação CX64 do vírus Coxsackie B3. Nos pontos de tempo indicados, a prole viral foi colhida de células e sobrenadantes por congelamento-descongelamento e titulada por TCID50. O aumento de fidelidade da variante A372V não coincide com um defeito de replicação observável em cultura de tecidos. A variante CX64 apresenta um atraso significativo na cinética de replicação e atinge títulos máximos que são 1000 vezes menores do que os do vírus tipo selvagem.

Utilizando a abordagem descrita neste vídeo, cada clone sequenciado origina-se de um genoma único dentro da população total de vírus e, portanto, apresenta mutações exclusivas. Esta figura mostra um alinhamento típico após a limpeza de sequências de baixa qualidade e a visualização de polimorfismos de nucleotídeo único. Os polimorfismos de nucleotídeo único totais dentro de uma população são contabilizados e o número de polimorfismos de nucleotídeo único presentes em cada clone é anotado.

Por exemplo, o clone sublinhado por uma barra contém duas mutações únicas, enquanto oito outros clones contêm uma única mutação única. Esses dados são utilizados para compilar uma tabela como a mostrada aqui. A tabela mostra a distribuição classificada dos clones sequenciados pelo número de mutações.

A comparação estatística de valores classificados pode determinar se uma distribuição é significativamente diferente de outra. Para facilitar a interpretação, os dados numéricos obtidos a partir da análise de sequência e estatística podem ser representados como um gráfico ou histograma. Como mostrado aqui, o vírus A 3 72 V gera menos mutações do que o tipo selvagem e apresenta uma frequência de mutação significativamente menor, com um valor de P inferior a 0,01.

A mesma população do vírus chicken ganga apresenta frequências de mutação semelhantes, independentemente de o estoque viral ou uma diluição 10 elevado à quinta potência ser usado para a extração de RNA. Após seguir este procedimento, você pode desejar realizar ensaios bioquímicos in vitro ou estudos de cristalização para compreender melhor a base mecanicista e estrutural da fidelidade nesta variante da polimerase.

Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia explorarem a correlação entre diversidade genética e aptidão viral in vivo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como aumentar suas chances de isolar variantes de fidelidade de vírus de RNA e como utilizar frequências de mutação para identificar essas diferenças de fidelidade.