Preparando E18 neurônios de rato para Cortical Compartimentação em um dispositivo micro

Olá e bem-vindo ao laboratório do Dr.Newly John. Em um vídeo anterior, demonstramos como fabricamos o dispositivo de neurônios, uma plataforma que permite ao pesquisador separar os corpos celulares dos neurônios de uma fração axonal pura. A litografia suave é a técnica utilizada para fazer os dispositivos, que consiste em fundir e curar o PDMS em um wafer de silício contendo o design do dispositivo que foi fabricado anteriormente por fotolitografia.

Neste vídeo, demonstraremos a preparação de neurônios corticais de ratos spro dolly E 18 e como carregar os neurônios no dispositivo de neurônios. Eu gostaria de apresentá-lo a Kiana Lee. Ela fará as demonstrações hoje.

Antes de começar, é importante ter todos os meios e reagentes necessários aquecidos a 37 graus no banho-maria. Você pode ver a mídia neurobasal 0,25% de tripsina e DMEM contendo 10% de FBS. É importante garantir que tudo o que está sendo colocado no capô para ser usado para reparar as células seja esterilizado e limpo com etanol a 70%.

Primeiro, o capuz de cultura de tecidos é limpo com 70% de etanol. Em seguida, os racks de plástico usados para segurar os tubos são pulverizados com etanol. Em seguida, a bola de borracha usada no processo de triestriação é a limpeza com etanol.

É importante fazer isso desde o início para que tenha tempo suficiente para secar. Em seguida, os reagentes necessários são limpos com etanol e movidos para o capô. Dois pedaços de córtex fetal de rato E 18 representando um cérebro previamente dissecado são colocados em um tubo de 15 ml contendo um ml, gelado, sem cálcio, tampão de dissecção sem magnésio, um ml de 0,25% de tripsina EDTA é adicionado ao córtex no tampão de dissecação, trazendo o volume final para dois moinhos e a concentração final de tentina para 0,125% O tubo de 15 ml contendo o córtex com a tripsina agora adicionada é então colocado em banho-maria a 37 graus por oito minutos, enquanto o córtex fetal está incubando a 37 graus em tripsina.

Três pipetas de pasta são polidas a fogo. A ponta da pipeta de vidro é colocada em contato com a chama perto da parte azul da chama e girada lentamente até que apenas a abertura fique laranja. Quando ficou laranja.

É importante continuar girando a pipeta de vidro para que ela não desmorone. Observe que as aberturas das pipetas de vidro são sucessivamente menores. Também é importante notar que você não quer fazer as aberturas muito pequenas, pois isso pode causar lise das células após o córtex ter sido incubado por oito minutos a 37 graus com a tripsina 10 ml de DMEM contendo 10% FBS é adicionado ao córtex para ajudar a parar a reação de tripsina.

O tubo de 15 ml contendo o córtex e o DMEM 10%FBS é centrifugado a 2.500 RPM por dois minutos. No gabinete de biossegurança, a sucção a vácuo conectada a uma pipeta de vidro é usada para remover o sobrenadante do córtex. Tomando cuidado para não perturbar ou desalojar o pellet.

Um ml de meio basal neural contendo B 27 e glutamato é adicionado ao pellet do córtex e suavemente pipetado para cima e para baixo. É muito importante não criar bolhas de ar durante a pipetagem para cima e para baixo, pois as bolhas de ar podem danificar as células por oxidação. Em seguida, a pipeta posterior polida a fogo com a abertura mais larga, usada para tri o córtex, anexando um bulbo de borracha estéril à extremidade da pipeta e pipetando para cima e para baixo aproximadamente cinco vezes.

Tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar. Okey. O processo continuou com as outras duas pipetas de vidro, cada uma com o tamanho de abertura reduzido. Como dito anteriormente, é importante garantir que nenhuma bolha seja introduzida durante o processo de triestriação.

Você também deve notar que não está mais vendo nenhum pedaço visível. É importante manter a classificação tripla até que você não possa mais ver nenhum dos pedaços do córtex na mídia. Após a ação, as células são novamente fundidas a 2.500 RPM por dois minutos.

Este é aproximadamente o tamanho aproximado do pellet que se esperaria de dois pedaços de córtex. Após a centrifugação, o sup natin é novamente removido do pellet celular. Após a remoção do super natin, um ml de meio neurobasal contendo B 27 e glutamato é adicionado ao córtex e usado para suspender o córtex.

O pellet celular é mais uma vez pipetado para cima e para baixo com cuidado para evitar a adição de bolhas e garantir que o pellet celular seja distribuído e quebrado uniformemente. Mais um mil de meio neurobasal é adicionado à suspensão celular, elevando o volume final para dois mils. Em seguida, a solução celular ressuspensa é filtrada através de um filtro de células BD biosciences de 40 mícrons próximo para contar as células e avaliar a viabilidade.

60 microlitros de meio neural basal fresco são colocados em um tubo de micro fuge estéril. 20 microlitros de células são então adicionados aos 60 microlitros de meio neurobasal e, finalmente, 20 microlitros de azul trian são adicionados às células no meio neurobasal. O azul trian manchará as células que não estão mais vivas depois que as células forem coradas com azul trian.

Pipetamos 20 microlitros em um hemocitômetro e os visualizamos ao microscópio. As células viáveis parecem claras e translúcidas, enquanto as células que têm suas membranas perfuradas ficam azuis devido ao azul trian. Normalmente, obtemos cerca de 2,5 milhões de células e 8 milhões de células por córtex.

Normalmente obtemos dois pedaços do córtex de um cérebro com as células ressuspensas em um volume final de dois mils. Assim, a concentração final de células é tipicamente entre 2,5 milhões de células por mil e 8 milhões de células por mil. Normalmente, carregamos cerca de 20 microlitros de células por dispositivo.

Isso nos dá uma gama de células por dispositivo entre 50.000 células e 160.000 células. As densidades celulares podem variar dependendo da aplicação. No entanto, a semeadura de neurônios primários em uma densidade muito baixa normalmente leva à morte celular Dispositivos previamente preparados contendo meios basais neurais são trazidos para o gabinete de biossegurança para manter a esterilidade.

O excesso de mídia dos poços é removido por uma seção de vácuo. No entanto, é preciso ter cuidado para não remover todas as mídias. Deve haver algum meio no canal principal apenas aspirar os reservatórios.

Apenas 20 microlitros de células são aplicados ao reservatório superior esquerdo do dispositivo. As células fluem para o dispositivo e se ligam à superfície tratada com PLL. Aqui você pode ver as células enquanto elas fluem pelo canal principal, e você começará a ver algumas delas realmente presas ao vidro.

Após o carregamento, os dispositivos que contêm as células são colocados de volta em uma incubadora por aproximadamente 10 minutos para permitir que as células se conectem. Após 10 minutos na incubadora, os dispositivos são novamente trazidos para o gabinete de biossegurança, e os reservatórios são preenchidos com mídia e os dispositivos são colocados de volta na incubadora. Algumas coisas importantes a serem observadas, dependendo da incubadora e do nível de umidade que o meio precisa, podem precisar ser trocadas nos dispositivos a cada dois ou três dias.

É uma boa prática colocar meios frescos nos poços superiores e permitir que alguns meios frescos fluam através do dispositivo e para os canais principais antes de encher todos os reservatórios. Os neurônios são visualizados aqui com cálcio sou um corante permeável celular que mancha as células vivas. Aqui você pode ver o compartimento ou lado celular do dispositivo que contém os corpos celulares, axônios e dendritos.

À medida que percorremos o dispositivo, você pode ver os micro sulcos pelos quais os axônios crescem para alcançar o outro lado do dispositivo, o lado do axônio, que contém uma fração axonal pura. Para fins de demonstração. Essas células marcadas com fluorescência serão usadas para ilustrar o procedimento de otomia do machado.

Uma das propriedades do dispositivo de neurônio é que ele permite que o pesquisador realize uma exotomia que corta os axônios da fração axonal pura do dispositivo. A fim de realizar pesquisas, como estudar a regeneração axonal. Keano agora demonstrará a realização de exotomia no dispositivo de neurônio, a exotomia é realizada por vácuo.

Uma pipeta de vidro estéril é colocada na abertura inferior do poço no lado axonal, o meio é aspirado por vácuo. Todos os meios são completamente removidos do lado axonal do dispositivo, incluindo os meios no canal principal. Para repetir o processo após a remoção do meio, 150 microlitros de meio são forçados para dentro do canal principal, colocando a ponta da pipeta na abertura do canal principal e pressionando a pipeta com força.

Em seguida, o vácuo é aplicado na abertura do canal principal e no poço superior do lado axonal do dispositivo. O vácuo é mais uma vez usado para remover todos os meios do lado axonal, incluindo o canal principal. Mais uma vez, 150 microlitros de meio são forçados para dentro do canal principal, colocando a ponta da pipeta na abertura do canal principal e pressionando a pipeta com força.

Nesse ponto, o pesquisador pode visualizar o dispositivo ao microscópio para verificar a eficiência do corte do axônio. Se os axônios não forem suficientemente cortados, o processo pode ser repetido novamente conforme necessário. Neste vídeo, mostramos como preparar neurônios corticais de rack fetal E 18 e carregá-los no dispositivo de neurônios.

A principal vantagem desses dispositivos é a capacidade de separar e compartimentar a cultura dos corpos celulares dos neurônios de um lado do dispositivo de uma fração axonal pura do outro lado do dispositivo. Esperamos que você tenha achado este vídeo informativo e útil. Então é isso do John Lab.

Obrigado por assistir.