Preparando E18 neurônios de rato para Cortical Compartimentação em um dispositivo micro

Olá e bem-vindo ao laboratório do Dr. Newly John. Em um vídeo anterior, demonstramos como fabricamos o dispositivo neuronal, uma plataforma que permite ao pesquisador separar os corpos celulares dos neurônios de uma fração axonal pura. A litografia em gel é a técnica utilizada para produzir os dispositivos, que consiste em moldar e curar PDMS sobre uma lâmina de silício contendo o desenho do dispositivo, previamente fabricado por meio de litografia fotográfica.

Neste vídeo, demonstraremos o preparo de neurônios corticais de rato spro dolly E 18 e como carregar os neurônios no dispositivo neuronal. Gostaria de apresentar a vocês Kiana Lee. Ela fará as demonstrações hoje.

Antes de começar, é importante que todos os meios e reagentes necessários estejam aquecidos a 37 graus em banho-maria. Você pode ver o meio neurobasal, tripsina a 0,25% e DMEM contendo 10% de FBS. É essencial garantir que tudo o que for colocado na câmara de fluxo laminar para ser usado no reparo das células esteja esterilizado e limpo com etanol a 70%.

Primeiro, a cabine de fluxo laminar é limpa com etanol a 70%. Em seguida, as grades plásticas utilizadas para segurar os tubos são pulverizadas com etanol. Depois, a bola de borracha utilizada no processo de trissociação é limpa com etanol.

É importante fazer isso logo no início para que tenha tempo suficiente para secar. Em seguida, os reagentes necessários são limpos com etanol e levados para a cabine de segurança. Duas porções de córtex fetal de rato E18, representando um cérebro previamente dissecado, são colocadas em um tubo de 15 ml contendo um ml de solução tampão de dissecção fria a 0 °C, sem cálcio e sem magnésio. Um ml de tripsina-EDTA 0,25% é adicionado ao córtex na solução tampão de dissecção, elevando o volume final para dois ml e a concentração final de tripsina para 0,125%. O tubo de 15 ml contendo o córtex com a tripsina agora adicionada é então colocado em banho-maria a 37 °C por oito minutos, enquanto o córtex fetal incuba a 37 °C na tripsina.

Três pipetas de vidro são flamejadas. A ponta da pipeta de vidro é colocada em contato com a chama, próxima à parte azul da chama, e girada lentamente até que apenas a abertura fique laranja. Enquanto isso, ela fica laranja.

É importante manter a rotação da pipeta de vidro para que ela não colapse. Observe que as aberturas das pipetas de vidro são sucessivamente menores. Também é importante observar que você não deve deixar as aberturas muito pequenas, pois isso pode causar lise celular após o córtex ter sido incubado por oito minutos a 37 graus; nesse momento, são adicionados 10 ml de DMEM contendo 10% de FBS ao córtex para ajudar a interromper a reação da tripsina.

O tubo de 15 ml contendo o córtex e DMEM com 10% de FBS é centrifugado a 2.500 RPM durante dois minutos. Na cabine de segurança biológica, utiliza-se sucção a vácuo acoplada a uma pipeta de vidro para remover o sobrenadante do córtex, tomando cuidado para não perturbar ou deslocar o pellet.

Adiciona-se 1 ml de meio basal neural contendo B 27 e glutamato ao pellet de córtex e pipeta-se suavemente para cima e para baixo. É muito importante não criar bolhas de ar ao pipetar para cima e para baixo, pois as bolhas de ar podem danificar as células por oxidação. Em seguida, utiliza-se a pipeta posterior polida ao fogo com a abertura mais larga para triturar o córtex, acoplando uma bomba de borracha estéril à extremidade da pipeta e pipetando para cima e para baixo aproximadamente cinco vezes.

Tendo o cuidado de não introduzir bolhas de ar. Ok. O processo continuou com os outros dois pipetos de vidro, cada um com tamanho de abertura reduzido. Como afirmado anteriormente, é importante garantir que nenhuma bolha seja introduzida durante o processo de triestriação.

Você também deve notar que não está mais vendo nenhum fragmento visível. É importante continuar a trituração até que você não consiga mais ver nenhum dos fragmentos do córtex no meio. Após essa etapa, as células são novamente centrifugadas a 2.500 RPM por dois minutos.

Este é o tamanho aproximado do pellet que se esperaria obter de dois fragmentos de córtex. Após a centrifugação, o sobrenadante é novamente removido do pellet celular. Após a remoção do sobrenadante, adiciona-se um mL de meio neurobasal contendo B27 e glutamato ao córtex, utilizado para ressuspendê-lo.

O pellet celular é novamente pipetado para cima e para baixo com cuidado para evitar a introdução de bolhas e garantir que o pellet celular esteja uniformemente distribuído e completamente dissociado. Mais um mililitro de meio neurobasal é adicionado à suspensão celular, atingindo um volume final de dois mililitros. Em seguida, a solução celular re-suspensa é filtrada através de um filtro celular de 40 mícrons da BD Biosciences antes da contagem celular e avaliação da viabilidade.

60 microlitros de meio basal neural fresco são colocados em um tubo microcêntrifuga estéril. Em seguida, 20 microlitros de células são adicionados aos 60 microlitros de meio basal neural, e, por fim, 20 microlitros de azul de tripano são adicionados às células no meio basal neural. O azul de tripano cora as células que não estão mais vivas após as células terem sido coradas com azul de tripano.

Pipetamos 20 microlitros em um hemocitômetro e os examinamos ao microscópio. Células viáveis aparecem claras e translúcidas, enquanto as células com membranas perfuradas ficam coradas em azul devido ao azul de tripano. Normalmente, obtemos cerca de 2,5 milhões de células e 8 milhões de células por córtex.

Normalmente, obtemos duas amostras do córtex de um cérebro, com as células ressuspendidas em um volume final de dois mililitros. Assim, a concentração final de células é tipicamente entre 2,5 milhões de células por mililitro e 8 milhões de células por mililitro. Normalmente, carregamos cerca de 20 microlitros de células por dispositivo.

Isso nos fornece uma faixa de células por dispositivo entre 50.000 células e 160.000 células. As densidades celulares podem ser variadas dependendo da aplicação. No entanto, semear neurônios primários em densidade muito baixa geralmente leva à morte celular. Dispositivos previamente preparados contendo meio basal neural são levados para a cabine de segurança biológica para manter a esterilidade.

O excesso de meio dos poços é removido por meio de uma seção a vácuo. No entanto, deve-se ter cuidado para não remover todo o meio. Deve haver algum meio no canal principal; aspire apenas o meio dos reservatórios.

Apenas 20 microlitros de células são aplicados ao reservatório superior esquerdo do dispositivo. As células fluem para dentro do dispositivo e aderem à superfície tratada com PLL. Aqui você pode ver as células enquanto fluem através do canal principal, e começará a observar algumas delas efetivamente aderidas ao vidro.

Após o carregamento, os dispositivos contendo as células são recolocados no incubador por aproximadamente 10 minutos para permitir que as células se fixem. Após 10 minutos no incubador, os dispositivos são novamente levados para a cabine de segurança biológica, os reservatórios são preenchidos com meio e os dispositivos são então recolocados no incubador. Alguns pontos importantes a serem observados: dependendo do incubador e do nível de umidade necessário para o meio, este pode precisar ser trocado nos dispositivos a cada dois ou três dias.

É uma boa prática colocar meio fresco nas poças superiores e permitir que um pouco do meio fresco flua através do dispositivo e entre nos canais principais antes de preencher todos os reservatórios. Os neurônios são visualizados aqui com amida de cálcio, um corante permeável à membrana celular que cora células vivas. Aqui você pode ver o compartimento ou lado celular do dispositivo que contém os corpos celulares, axônios e dendritos.

Enquanto percorremos o dispositivo, é possível observar os microsulcos pelos quais os axônios crescem para alcançar o outro lado do dispositivo, o lado dos axônios, que contém uma fração pura de axônios. Para fins de demonstração, essas células marcadas com fluorescência serão usadas para ilustrar o procedimento de axotomia.

Uma das propriedades do dispositivo neuronal é que ele permite ao pesquisador realizar a exotomia, ou seja, cortar os axônios a partir da fração axonal pura do dispositivo. Para conduzir pesquisas como o estudo da regeneração axonal. Keano agora demonstrará a realização da exotomia no dispositivo neuronal, sendo a exotomia realizada por meio de vácuo.

Uma pipeta de vidro estéril é colocada na abertura inferior do poço no lado axonal, e o meio é aspirado por vácuo. Todo o meio é completamente removido do lado axonal do dispositivo, incluindo o meio presente no canal principal. Para repetir o processo após a remoção do meio, 150 microlitros de meio são forçados para dentro do canal principal colocando-se a ponta da pipeta na abertura do canal principal e pressionando a pipeta com força.

Em seguida, aplica-se vácuo à abertura do canal principal e ao poço superior do lado axonal do dispositivo. O vácuo é novamente utilizado para remover todo o meio do lado axonal, incluindo o canal principal. Mais uma vez, 150 microlitros de meio são forçados a entrar no canal principal posicionando a ponteira da pipeta na abertura do canal principal e pressionando a pipeta com força.

Neste momento, o pesquisador pode observar o dispositivo sob um microscópio para verificar a eficiência do corte dos axônios. Se os axônios não forem cortados de forma suficiente, o processo pode ser repetido quantas vezes forem necessárias. Neste vídeo, mostramos como preparar neurônios corticais fetais E18 e carregá-los no dispositivo neuronal.

A principal vantagem desses dispositivos é a capacidade de separar e compartimentalizar o cultivo dos corpos celulares neuronais em um lado do dispositivo de uma fração pura de axônios no outro lado do dispositivo. Esperamos que este vídeo tenha sido informativo e útil. Assim sendo, é isso do John Lab.

Obrigado por assistir.