Identificação de subconjuntos de células T reguladoras de linfonodos de drenagem pancreática murina

As células T reguladoras, ou Tregs, são uma subpopulação especializada de células T que exerce efeitos imunossupressores para mediar a homeostase do sistema imunológico. Tregs expressam os marcadores de superfície celular CD4, CD25 e Neuropilin 1, Nrp1, e os fatores de transcrição nuclear forkhead box P3, Foxp3 e Helios.

Para isolar Tregs de linfonodos de drenagem pancreática de camundongos, ou PDLNs, coloque uma malha de metal sobre um tubo cônico. Coloque os PDLNs na malha e triture o tecido para dissociá-lo mecanicamente. Adicione um meio adequado sobre a malha, lavando as células no tubo.

Centrifugue, removendo células mortas e detritos celulares. Ressuspenda as células viáveis no meio. Passe as células por uma tampa de filtro de células encaixada em um tubo de fundo redondo para obter uma suspensão homogênea de célula única, eliminando quaisquer aglomerados de células restantes.

Adicione anticorpos anti-CD4, anti-CD25 e anti-Nrp1 conjugados com fluorocromo. Os anticorpos anti-CD4 e anti-CD25 ligam-se aos seus respectivos antígenos de superfície celular em Tregs. Simultaneamente, o anti-Nrp1 se liga aos receptores Nrp1.

Trate as células com um tampão de fixação de permeabilização adequado, fixando as células e permeabilizando as membranas celular e nuclear. Adicione anticorpos conjugados com fluorocromo direcionados a Foxp3 e Helios.

As membranas permeabilizadas permitem que os anticorpos entrem nas células e se liguem aos seus respectivos alvos intranucleares. Analise as células usando citometria de fluxo.

As Tregs são caracterizadas pela expressão positiva da superfície celular de CD4, CD25 e Nrp1, juntamente com os fatores de transcrição nuclear Foxp3 e Helios.

Primeiro, coloque um tubo cônico de 15 mililitros em um rack. Coloque uma malha de metal estéril de 250 micrômetros sobre o tubo. Enxágue a malha com 1 mililitro de RPMI. Em seguida, transfira os gânglios linfáticos para a malha de metal e use uma pinça para triturá-los através da malha. Aplique 1 mililitro de RPMI na malha para liberar as células no tubo. Repita esse processo de transferência e trituração dos gânglios linfáticos três vezes para cada amostra e, em seguida, remova a malha.

Centrifugue os tubos a 433 x g e a 4 graus Celsius por 5 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em aproximadamente 5 mililitros de RPMI e, em seguida, encha os tubos com RPMI. Repita esse processo desde centrifugar as amostras até encher o tubo com RPMI uma vez.

Centrifugue os tubos novamente a 433 x g e a 4 graus Celsius por 5 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 2 mililitros de RPMI. Transfira 2 mililitros da suspensão celular para tubos de fundo redondo de 5 mililitros com tampas de filtro de célula.

Primeiro, centrifugue a suspensão celular das amostras de PDLN a 433 x g e a 4 graus Celsius por 5 minutos. Descarte o sobrenadante. Pinte as células com anticorpos de superfície, conforme descrito no protocolo de texto, e incube os tubos no gelo por 40 minutos.

Em seguida, adicione 200 microlitros de tampão FACS a cada tubo. Centrifugar a 433 x g e a 4 graus Celsius durante 5 minutos e rejeitar o sobrenadante. Repita esse processo - adicionando o tampão, centrifugando e descartando o sobrenadante uma vez. Ressuspenda o pellet celular em 500 microlitros de tampão de fixação de permeabilização para fixar e permeabilizar as células.

Transfira os tubos para uma geladeira a 4 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, centrifugue a suspensão celular das amostras de PDLN a 433 x g e a 4 graus Celsius por 5 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 500 microlitros de tampão de lavagem de permeabilização. Centrifugue as células novamente a 433 x g e a 4 graus Celsius por 5 minutos e descarte o sobrenadante.

Corar as células com anticorpos intracelulares, conforme descrito no protocolo de texto. Incube os tubos no gelo por 1 hora. Depois disso, adicione 500 microlitros de tampão de lavagem de permeabilização a cada tubo. Centrifugue a 433 x g e a 4 graus Celsius por 5 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de lavagem de permeabilização.

Centrifugue mais uma vez a 433 x g a 4 graus Celsius por 5 minutos. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 300 microlitros de tampão FACS. Em seguida, analise as células em um citômetro de fluxo conforme descrito no protocolo de texto.