Name: Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: Aprenda a realizar ensaio de supressão in vitro para avaliar função de células Treg e identificar desequilíbrios imunológicos em indivíduos predispostos ao diabetes tipo 1.

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Este estudo foi apoiado por Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetesat Medical College of Wisconsin e infantil Research Institute of Wisconsin. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, ou preparação do manuscrito.

1. Antes de configurar supressão de um ensaio, um precisa de contas de revestimento tosylactivated com anti-CD3 humano (clone UCHT1, 1μg/ml concentração final) para a estimulação das células e, depois, verificar se as contas são eficientemente revestido através da criação de um ensaio de proliferação in vitro utilizando humana células T <ol><li> Tomar 1ml de M-450 contas tosylactivated do frasco original, realizada em suporte magnético e segure até que todas as contas tenham aderido ao lado do tubo. Remova o tubo de buffer enquanto ainda está no suporte magnético. Leve tubo de suporte magnético e adicionar 1 ml de buffer1, coloque o tubo no suporte magnético novamente e remover o buffer1 enquanto tubo está no suporte magnético; contas ressuspender em 1 ml de buffer1 e adicionar 40μl de anti-CD3 humano, agite a 37 ° C por 15 minutos, adicionar 0,1% w / v BSA e continuar agitando para o próximo 16 horas. </li><li> Lave as contas em buffer2 duas vezes durante 5 minutos a 2-8 ° C e de vez em buffer3 por 5 minutos a 2-8 ° C usando suporte magnético, como explicado acima; remover o tampão e ressuspender as contas em 1ml de buffer2; as contas são concentração de 4x10 8 ml / final e pronto para uso. </li><li> Alíquota de 50.000 e 25.000 PBMC / poço, em triplicata em placa de 96 poços e adicione número variável de CD3-revestido contas (4x10 8 contas / ml, CD3 1μg/ml, por exemplo 1, 2, 3, 4, 5 esferas / células ), a fim de determinar o número ideal de contas por célula. Após 72 horas de cultura, adicionar 1μCi [3 H] timidina e continuar incubando a 37 ° C para os próximos 16 horas. Células colheita em chapa de colheita Multiscreen (Millipore), adicione líquido de cintilação e ler contagens por minuto (cpm) / poço usando Top Conde NXT (Packard, CT). Use as contas / razão entre células quando CPMs são acima de 5000, mas menos de 15 mil para evitar a superestimulação de Tregs, que pode perder função supressiva. Normalmente, a razão de 3 esferas / células estimula tanto responder e células Treg em todos os grupos sujeitos testados até agora 1-4. </li></ol> 2. PBMC isolamento do sangue total de doadores saudáveis ​​ou de leukopacks humano ou buffy coat (BC), geralmente tiradas de voluntários saudáveis ​​e disponível gratuitamente a partir de centros de transfusão de sangue locais (Figura 1) <ol><li> Diluir o BC (~ 50ml) 1:06 com PBS (adicione 250ml). Agora não há volume total de 300ml. Lentamente camada de 25ml de BC diluída em cima de 15ml Ficoll-Paque PLUS adicionado 50ml tubos Falcon, sem perturbar as camadas. Centrifugar a 800xg (1400 rpm em uma centrífuga Sorvall com rotor girando balde SH-3000) por 30 minutos a 4 ° C, com freios desligado. </li><li> Recolher com cuidado a camada de PBMC (fase intermediária) e transferi-lo para uma nova 50ml tubos Falcon. Lavar PBMC preenchendo os tubos de até 50ml com DPBS. Coletar 2 pellets de células em um tubo. Centrifugar a 400xg por 10 min a 4 ° C. Repita o passo de lavagem duas vezes, cada vez que combina dois pellets de células em um tubo único. Combine todos os pellets de células em um tubo de 50ml único. </li><li> Contagem de PBMC usando Trypan teste de exclusão Azul. Fazer uma diluição de 1:10 em Trypan Blue adicionando 20μl de PBMC de 180μl de Trypan Blue mancha. Misture bem e leve 20μl a contar em hemocitômetro imediatamente. Contar números de todas as células sem mácula e apenas azul manchado localizados em dois blocos quadrados cada um contendo 16 quadrados menores. Tomar a média dos dois números e multiplicar por 10. Divida este número por 100 para obter o número de PBMC / ml. Porcentagem de células viáveis ​​calcular como [1 - (número de células azuis / número de células total) x100]. Proceder se a viabilidade é ≥ 95%. </li></ol> 3. MACS tipo pré-CD4 células T <ol><li> Antes de prosseguir, a transferência de 1 ml de PBMC em um novo tubo, adicionar 4ml de mídia para preparar células de irradiação com 5000rad-estes serão células apresentadoras de antígenos (APC). </li><li> Centrifugar o resto das células em 250xg em PBS/2mM tampão BSA EDTA/0.5% por 10 min a 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante de células, e ressuspender em 4ml de tampão BSA PBS/2mM EDTA/0.5%. </li><li> Adicionar 200μl de microesferas de MACS anti-CD4 e incubar a 4 ° C por 20 minutos. </li><li> Lavagem adicionando 40 ml de tampão BSA PBS/2mM EDTA/0.5% e centrifugar a 250xg de 10min a 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante e ressuspender em 8ml de desgaseificado à temperatura ambiente, PBS/2mM EDTA/0.5% tampão BSA. </li><li> Filtro-separada de suspensão da célula usando filtros pré-separação antes de carregá-los em uma coluna de LS. </li><li> Dividir a suspensão de células e 4ml camada de cada coluna LS mais calibrada (com 3 ml de tampão BSA deggassed PBS/2mM EDTA/0.5%). LS coluna é fixa no separador MidiMACS. Antes de suspensão celular se esgota, ou fluxo contínuo re-run ou adicionar 3 ml de temperatura ambiente deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% tampão BSA e deixar que o tampão de corrida completamente. Adicione mais buffer até que ele sai claro. </li><li> Pipetar 5 ml tampão deggassed na coluna LS, LS remover Coluna do separador MidiMACS e coloque em um tubo de nova coleção estéril 15ml deixar ~ 1,0 ml por rodar. Coloque o êmbolo na coluna e empurre lentamente o resto dode volume para fora. </li><li> Faça o mesmo com as duas colunas LS e combinar as duas CD4 + frações. Adicione até 50ml células PBS e contar. Rendimento esperado é de até 5x10 8 células. Centrifugar a 400xg por 10 minutos e ressuspender as células bem em 2ml PBS/2mM tampão BSA EDTA/0.5%. </li></ol> 4. Fluorescente ativado Celular classificação de isolamento (FACS) (Figura 2) <ol><li> Faça um coquetel de anticorpos para marcadores de CD para os marcadores de células seguintes superfície (manter protegido da luz): 20 l de anti-humano CD8-FITC (clone RPA-T8), 20 l de anti-CD14 humano-FITC (clone M5E2; LPS receptor), 20 l de anti-CD32 humano-FITC (clone FLI8.26; FcγR do tipo II) e 6 mL de anti-humano CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα cadeia) e, alternativamente, adicionar anti 40μl -humanas CD4-APCCy7 (clone RPA-T4). </li><li> Tome 5μl de suspensão de células de 2ml e mancha com 2μl de cocktail mancha, que é um tubo para determinar o limiar (Fluorocromo Minus One-FMO) 5. </li><li> Adicionar 50 ul de anti-CD25 humano-PE (clone M-A251; IL-2Rα) para o coquetel de mancha, e adicione o cocktail de suspensão de células e incubar a 4 ° C 30 minutos. Lavar as células em tampão PBS, centrifugue a 400xg por 10 minutos e ressuspender as células a uma concentração de células de 10 7 / ml. </li><li> Prepare células imaculada e células ou grânulos corados com fluorocromo único para usar como controle de compensação para separação de células em FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ). </li><li> Aquisição de células no tubo FMO que permitirá ao usuário definir o limite para a classificação de células CD25 + T (Figura 2a). Definir uma porta em torno FITC-negativos para excluir as células-FITC células positivas compreendendo monócitos, macrófagos e todos os outros CD4 + T-não-células (Figura 2b). </li><li> Em um lote separado, desenhar portas para CD25, CD25low e T-CD25high células Tregs (top 1% das células que expressam o maior número de CD25) (Figura 2c). Subpopulações de células normalmente apresentam alta pureza (Figura 2d, 2e e 2f). </li><li> Centrifugar tubos de coleta com células em 400xg por 10 minutos e mantê-los no gelo até placas. </li></ol> 5. Criar cultura de células em placa de 96 poços (esquema anexado como Table1) em 200μl/well <ol><li> 50μl alíquota de CD3-revestido contas (1 mg / ml), calculado a ser três esferas / resposta celular em um poço, ressuspenso em media completo com 10% de soro AB humanos agrupados em U bottom-placas de 96 poços. (Por exemplo, para fazer media com 2ml CD3-revestido, tomar 7.5μl do estoque de CD3-revestido contas-final 4x10 concentração 8 ml / e diluir em 2 ml de mídia, cada 50μl conterá 75.000 beads-3beads/cell). </li><li> Diluir APC irradiada para 5x10 concentração celular 5 ml / e adicionar 50μl (conterá 2,5 x 10 4 células) em cada poço com estimulação previamente adicionados, incluindo poços rotulados como "Tregs só", "A APC só" e "media apenas" na Tabela 1. </li><li> Adicionar 2,5 x 10 4 / CD4CD25 bem-T ou células CD4CD25low em triplicatas seguinte projeto na Tabela 1. </li><li> Adicionar Tregs para co-culturas (linha B, Tabela 1) na proporção 01:10 (2.500 células Treg) e poços rotulados como "Tregs only" e incubar a placa a 37 ° C em incubadora de CO 2 com 5% de CO 2 , na umidade saturada por 72 horas. </li><li> Pulso de poços com 1μCi [3 H] timidina e continuar incubação a 37 ° C para o próximo 16 horas. </li></ol> 6. Colheita e contando <ol><li> Células colheita na placa colheita multiscreen usando Packard filtermate colheitadeira ou sistema alternativo. </li><li> Adicionar líquido de cintilação (Microscint 20), tampa colheita placa com a cobertura de plástico transparente, em preparação para a etapa final. </li><li> Leia contagens por minuto (cpm) / poço usando Top Conde NXT (Packard, CT) ou sistema alternativo. </li></ol> 7. Porcentagem de supressão de computação <ol><li> Como as células foram cultivadas em triplicatas, a média é calculada para cada condição. Se o coeficiente de variação é&gt; 30%, o outlier é eliminado e apenas cpm a partir de dois poços são em média. Porcentagem de supressão é obtida pelo cálculo [(sc) / s] x 100%, onde s = cpm em cultura única e c = cpm em co-cultura. </li><li> Como naïve (CD25) e in vivo ativado (CD25low) células T efetoras são banhados como células T responder, a diferença na capacidade de Tregs para suprimir a cada um desses subconjuntos é capturado e usado como um indicador de prognóstico potencial funcional baseada na premissa de que células ativadas são mais difíceis de suprimir. </li></ol> 8. Resultados representativos: Grande variabilidade nos métodos utilizados e os resultados derivados do ensaio in vitro em supressão humana nos levou a realizar um estudo abrangente das condições que influenciam o ensaio 1. Temos desenvolvido um ensaio que os testes não só a função Treg, mas também a sua pureza, considerando a baixa relação entre Tregs: Teffs (1:10), que determinou anteriormente 6. Além disso, diferem em Tregs ªeir capacidade de suprimir com sucesso ingênua e vivo em células T ativadas, mesmo em indivíduos saudáveis, como mostrado na Figura 3 e em nossos estudos anteriores 2,4, que se torna mais proeminente se o equilíbrio imunológico está comprometido, como em indivíduos em risco de desenvolver DM1 . O ensaio funcionou muito bem no estudo onde comparou a função de supressão de recursos naturais (nTregs), induzível (iTregs) e em nTregs vitro expandido, permitindo-nos comparar a sua função entre o controle saudável, de início recente (RO) e DM1 de longa data (LS ) indivíduos DM1. Concluiu-se que assuntos RO DM1 tinham melhor capacidade de gerar funcional tanto iTregs e nTregs expandiu em comparação com indivíduos controle LS DM1 e saudável 7. Assim, este ensaio pode ser usado como uma excelente ferramenta para o reconhecimento tanto do Estado uma precoce e tardia de desequilíbrio imunológico. Esquema de apresentação esquemática uma das etapas envolvidas no ensaio in vitro em supressão <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Etapas do ensaio in vitro em supressão apresentados com fotografias <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Estratégia Gating FACS em isolamento celular. a) CD25 limite + foi ajustada de acordo com Fluorocromo Minus One (FMO), b) as células foram fechadas como FITC-negativos, c) FITC-negativos células foram novamente fechados e recolhidos como CD + CD25-, CD + CD25low e CD + CD25high ( Tregs) mostrada com porcentagens, d) FACS classificadas Tregs após a triagem, e) FACS classificadas CD + CD25low após a triagem, e f) FACS CD4 + CD25-classificadas células T após triagem <img src="/files/ftp_upload/3071/3071fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Os resultados representativos de indivíduos saudáveis ​​a) Os resultados representativos de contagens por minuto (cpm) de indivíduos saudáveis ​​apresentado como único para todas as culturas de células subconjuntos envolvidos (naïve-CD25-, in vivo ativado-CD25low, células apresentadoras de antígenos-APC e células T reguladoras-Treg), bem como co-culturas de células de resposta T (CD25 ou CD25low) e Tregs. b) Percentagem de supressão de cada CD25 e células T CD25low responder por Tregs autólogo é apresentado para controle de indivíduos saudáveis ​​(n = 4). Supressão foi calculada como [(sc) / s] x 100%, onde s = cpm em cultura única e c = cpm em co-cultura. Embora pequena diferença na capacidade de Tregs para suprimir as células T responder foi notado, não foi significativa (teste t pareado p = 0,08). C) Apresentado são cpm em indivíduos de risco para cada cultura única, incluindo-CD25 e CD25low como responder células T, bem como a APC e Tregs, e co-culturas, onde cada resposta subconjunto de células T é semeado com Tregs Percentagem (CD25-/Tregs e CD25low/Tregs). d) de supressão de cada CD25 e CD25low células T responder por autólogo Tregs é apresentado para em indivíduos de risco (n = 4). A diferença na capacidade de Tregs para suprimir CD25 versus CD25low células T responder foi significativa (teste t pareado p = 0,04). Tabela 1. Esquemática criação de ensaio in vitro em supressão <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 03/01 </td><td> 06/04 </td><td> 09/07 </td><td> 12/10 </td></tr><tr><td> A </td><td> CD4CD25- </td><td> CD4CD25low </td><td> somente mídia </td><td> somente mídia </td></tr><tr><td> B </td><td> CD4CD25 / Tregs </td><td> CD4CD25low / Tregs </td><td> Tregs apenas </td><td> APC só </td></tr><tr><td> C </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> E </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> G </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Como a única característica única de Tregs, função supressiva deverá ser testado de forma confiável e de maneira uniforme entre os indivíduos em diferentes fases de desenvolvimento da doença dentro da mesma e entre diferentes estudos. Oferecemos os detalhes do ensaio de supressão desenvolvido em nosso laboratório como a nossa contribuição para a padronização deste ensaio. Em nosso estudo otimização, nós determinamos que a estimulação de células T com anti-CD3 humano revestido contas (UCHT1 clone, na concentração de 1μg/...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente ou instrumento </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Ficoll-Paque PLUS </td><td> Amersham Pharmacia Biotech </td><td> 17-1440-03 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS-1X </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan Blue </td><td> Invitrogen </td><td> 15250-061 </td><td></td></tr><tr><td> anti-CD4 microesferas </td><td> Miltenyi </td><td> 130-045-101 </td><td></td></tr><tr><td> Pré-separação filtros </td><td> Miltenyi </td><td> 130-041-407 </td><td></td></tr><tr><td> Coluna LS </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-401 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15575-020 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4287 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) </td><td> BD PharMingen </td><td> 557852 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) </td><td> BD PharMingen </td><td> 555432 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD8-FITC (clone RPA-T8) </td><td> BD PharMingen </td><td> 555366 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD14-FITC (clone M5E2; receptor LPS) </td><td> BD PharMingen </td><td> 555397 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR do tipo II) </td><td> BD PharMingen </td><td> 555448 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-humano CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα cadeia) </td><td> BD PharMingen </td><td> 554532 </td><td></td></tr><tr><td> Dynalbeads M-450 tosylactivated </td><td> Invitrogen </td><td> 140-13 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD3 humano </td><td> Ancell </td><td> 144-024 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer1 </td><td> Caseiro </td><td></td><td> 0,1 M Na 2 B 4 O 7 pH7.6 </td></tr><tr><td> Buffer2 </td><td> Caseiro </td><td></td><td> PBS/2mM BSA EDTA / 0,1% pH7.4 </td></tr><tr><td> Buffer3 </td><td> Caseiro </td><td></td><td> 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 </td></tr><tr><td> RPMI completo media </td><td> Caseiro </td><td></td><td> RPMI 1640 media 2 mM L-glutamina 5 mM HEPES 100 U / mg / ml peni / strept 0,5 mM piruvato de sódio </td></tr><tr><td> [3 H] timidina </td><td> Perkin Elmer </td><td> NET027Z005MC </td><td></td></tr><tr><td> humanos agrupados soro AB </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S40110 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de colheita Multiscreen </td><td> Millipore </td><td> MAHFC1H60 </td><td></td></tr><tr><td> Microscint 20 </td><td> Perkin Elmer </td><td> 6013621 </td><td></td></tr></tbody></table>

humano in vitro supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um estado precoce de desequilíbrio imunológico

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Células T reguladoras (Tregs) são mediadores críticos de tolerância imune a auto-antígenos. Além disso, eles são reguladores fundamentais da resposta imune após uma infecção. Apesar dos esforços para identificar marcador de superfície única sobre Tregs, a única característica única é a sua capacidade para suprimir a proliferação e função das células T efectoras. Embora seja claro que só em ensaios in vitro podem ser utilizados na avaliação da função Treg humano, este torna-se problemático quando se avalia os resultados de estudos transversais, onde as células saudáveis ​​e células isoladas de indivíduos com doenças auto-imunes (como Diabetes Tipo 1-DM1) precisam a serem comparados. Há uma grande variabilidade entre laboratórios no número e tipo de células T responder, a natureza e força de estimulação, Treg: rácios de resposta eo número e tipo de células apresentadoras de antígenos (APC) usado em humanos em testes de supressão vitro. Esta variabilidade dificulta a comparação entre os estudos que medem a função Treg difícil. O campo precisa de um ensaio de Treg supressão padronizados que vai funcionar bem com ambos os indivíduos saudáveis ​​e aqueles com doenças auto-imunes. Nós desenvolvemos um ensaio in vitro em supressão que mostra muito pouco da variabilidade intra-ensaio na estimulação de células T isolados de voluntários saudáveis ​​em comparação a indivíduos com base destruição auto-imune do pâncreas β-células. O objetivo principal desta peça é descrever um ensaio in vitro que permite a supressão humana comparação entre grupos de sujeitos diferentes. Além disso, este ensaio tem o potencial para delinear uma pequena perda em função nTreg e antecipar ainda mais a perda de, no futuro, assim, identificar temas que poderiam se beneficiar da terapia com imunomoduladores preventiva 1. Abaixo, fornecemos descrição detalhada das etapas envolvidas neste procedimento. Esperamos contribuir para a padronização do ensaio in vitro em supressão usado para medir a função Treg. Além disso, oferecemos este ensaio como uma ferramenta para reconhecer um estado inicial de desequilíbrio imunológico e um biomarcador em potencial funcional para DM1.

Tregs são potentes supressores do sistema imune. Há uma falta de marcadores de superfície única para defini-los, portanto, definições de Tregs são principalmente funcionais. Aqui nós descrevemos um otimizado<em&gt; In vitro</em&gt; Teste capaz de identificar o desequilíbrio imunológico em indivíduos em risco de desenvolver DM1.

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

As células T reguladoras (Tregs) são mediadoras críticas da tolerância imunológica a autoantígenos. Além disso, são reguladoras cruciais da resposta imune...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar um ensaio de supressão humano in vitro para medir a função das Treg e, potencialmente, antecipar futuras perdas em sua função. Isso é realizado primeiramente preparando e testando microesferas codificadas, que serão usadas como estimuladores celulares. O segundo passo é isolar células T naïve CD4 positivas, CD25 negativas, células T CD4 positivas, CD25 baixas ativadas in vivo e células T regulatórias CD4 positivas, CD25 altas, além de irradiar PP BMCs para uso como células apresentadoras de antígeno ou APCs.Em seguida, são montadas culturas simples de linfócitos T ingênuos ou ativados como células responsivas com BMCs de P como APCs, ou culturas co sob as mesmas condições, mas com tregs adicionados numa proporção de um para dez. O passo final consiste em colher as células e medir sua proliferação por incorporação de timidina tritiada. Os resultados finais obtidos podem demonstrar diferenças na supressão das respostas de linfócitos T ingênuos versus linfócitos T ativados in vivo.Meu nome é Jeff Woodcliff. As células T regulatórias não expressam marcadores únicos na superfície celular. Portanto, para medir com confiança sua função, elas

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Foi desenvolvido um ensaio in vitro para investigar o papel das vias de imunorreguladores na regulação da secreção de citoquinas por células T CD4 + específicas para o HIV.

In Vitro Ensaio para avaliar o impacto da imunorreguladora Pathways on específica para o HIV CD4 T efetoras celular Função

A coinfecção humana é difícil de replicar in vitro. No entanto, os parasitas da malária humana podem ser facilmente cultivados in vitro, assim como as células mononucleares do sangue periférico humano recém-isoladas naturalmente infectadas com o HIV. Isso fornece um excelente modelo para estudar as respostas imunes precoces aos parasitas da malária no contexto da coinfecção pelo HIV.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para medição de respostas imunes a Malária no Contexto do HIV co-infecção

Este protocolo descreve os métodos na construção de um modelo humanizado de camundongo medula óssea/fígado/timo com imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir a tolerância em transplante e avaliar in vitro e em vivo a capacidade supressora de subconjuntos distintos celular do destinatário e o status imune do destinatário para doador ou antígenos exógenos.

In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados

Descrevemos aqui um protocolo para investigar a citotoxidade de CD8 pré-activated+ T células contra as células cancerosas através da detecção de apoptotic câncer células através do tempo real microscopia. Este protocolo pode investigar os mecanismos subjacentes mieloide induzida por células T cell supressão e avaliar compostos vistos reabastecer T células através do bloqueio de células mieloides supressivas do sistema imunológico.

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Este papel utiliza um ensaio de fluxo cytometry-baseado para bibliotecas de tela de inibidores químicos para a identificação de inibidores e os alvos que influenciam a sinalização do receptor de células T. Os métodos descritos aqui também podem ser expandidos para as sessões de alta produtividade.

Identificação de mediadores do Receptor de células T através da triagem de bibliotecas de inibidor químico de sinalização

Nós descrevemos uma pilha mononucleares do sangue periférico humano (PBMC)-modelo humanizado baseado do rato do xenograft para a pesquisa translacional do immuno-Oncology. Este protocolo poderia servir como diretriz geral para O estabelecimento e caracterização de modelos similares para a avaliação da terapia de I-O.

Uma célula mononuclear do sangue periférico humano (PBMC) engrafted o modelo humanizado do xenograft para a pesquisa translational do immuno-Oncology (I-O)

O uso de uma abordagem baseada em RNA para determinar perfis imunológicos quantitativos de tecidos tumorais sólidos e aproveitar coortes clínicas para a descoberta de biomarcadores imuno-oncologia é descrito através de protocolos moleculares e informativos.

Modelagem imunológica preditiva de tumores sólidos

Apresentado aqui é um protocolo para isolamento do monócito sanguíneo humano primário, bem como sua diferenciação em macrófagos e células dendríticas e montagem com células epiteliais em um modelo pulmonar humano multicelular. Respostas biológicas de coculturas compostas de células imunes diferenciadas de monócitos recém-isolados ou descongelados, após exposição a estímulos proinflamatórios, são comparadas.

Modelo Alveolar Humano Multicelular Composto por Células Epiteliais e Células Imunes Primárias para Avaliação de Riscos

O presente protocolo descreve como enxertar pele humana em camundongos diabéticos não obesos (NOD)-scid interleucina-2 receptor de cadeia gama (NSG) camundongos. Uma descrição detalhada da preparação da pele humana para transplante, preparação de camundongos para transplante, transplante de pele humana de espessura dividida e procedimento de recuperação pós-transplante estão incluídas no relatório.

Modelo de pele de xenoenxerto para manipular respostas imunes humanas in vivo

Este protocolo descreve a geração de camundongos do sistema imunológico humano (HIS) para estudos de imuno-oncologia. Instruções e considerações sobre o uso deste modelo para testes de imunoterápicos humanos em tumores humanos implantados neste modelo são apresentadas com ênfase na caracterização da resposta do sistema imune humano ao tumor.

Testando imunoterápicos contra o câncer em um modelo humanizado de camundongo com tumores humanos

Aprenda a realizar ensaio de supressão in vitro para avaliar função de células Treg e identificar desequilíbrios imunológicos em indivíduos predispostos ao diabetes tipo 1.

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

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