Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

O objetivo geral deste procedimento é utilizar um ensaio de supressão humano in vitro para medir a função das Treg e, potencialmente, antecipar futuras perdas em sua funcionalidade. Isso é realizado primeiramente preparando e testando microesferas codificadas, que serão usadas como estimuladores celulares. O segundo passo é isolar células T naïve CD4 positivas CD25 negativas, células T CD4 positivas CD25 baixas ativadas in vivo e células T regulatórias CD4 positivas CD25 altas, além de irradiar PP BMCs para utilização como células apresentadoras de antígeno ou APCs.

Em seguida, são montadas culturas simples de linfócitos T ingênuos ou ativados como células respondedoras com PBMCs como APCs, ou culturas em co-cultivo nas mesmas condições, mas com Tregs adicionados numa proporção de um para dez. O passo final consiste em colher as células e medir sua proliferação por incorporação de timidina tritiada. Os resultados finais obtidos podem demonstrar diferenças na supressão das respostas de linfócitos T ingênuos versus ativados in vivo.

Meu nome é Jeff Woodcliff. As células T regulatórias não expressam marcadores únicos na superfície celular. Portanto, para medir com confiança sua função, elas devem ser isoladas utilizando técnicas que proporcionem a melhor separação.

A principal vantagem do uso da triagem de células ativadas por fluorescência em comparação com outros métodos, como isolamento máx, é que a fax oferece populações celulares puras que podem ser obtidas. A função celular pode então ser testada com confiança em ensaios de supressão in vitro, conforme demonstrado aqui. Embora este método possa fornecer informações sobre a função de treg em indivíduos saudáveis e relacionados ao diabetes tipo um, ele também pode ser aplicado a outras doenças autoimunes, como artrite reumatoide humana, lúpus sistêmico, eritematoso, esclerose múltipla e outras. Para revestir as microesferas ativadas com taal com anti-CD3 humano.

Adicione um mililitro das microesferas ativadas M four 50 provenientes do frasco original a um tubo de 1,5 mililitro e coloque o tubo em um suporte magnético até que todas as microesferas adiram à parede do tubo. Em seguida, remova o tampão das microesferas por pipetagem, mantendo o tubo no suporte magnético. Depois, retire o tubo do suporte magnético e adicione um mililitro do tampão um.

Coloque o tubo novamente no suporte magnético várias vezes. Remova o tampão enquanto o tubo está no suporte magnético. Resuspenda, suspenda as microesferas em um mililitro de tampão mais uma vez.

Desta vez, adicione 40 microlitros de anti-humano CD3 também. Agite as microesferas e o anticorpo a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, adicione BSA a 0,1% peso por volume e continue agitando pelas próximas 16 horas.

Em seguida, lave as esferas duas vezes com o tampão dois, incubando as esferas em um mililitro de tampão dois por cinco minutos a dois a oito graus Celsius, e depois remova o tampão enquanto o tubo estiver no suporte magnético. Em seguida, lave as esferas mais uma vez nas mesmas condições estéreis.

Desta vez, utilizando um mililitro do tampão três, teste a eficiência do revestimento com anticorpo adicionando um número variável de microesferas revestidas com CD três por célula, a fim de determinar a proporção ideal, semeando 50.020 a 5.000 PBMCs por poço em triplicata em uma placa de 96 poços. Após 72 horas de cultivo a 37 graus Celsius, adicione um microcurie de timidina tritiada e continue a incubação pelas próximas 16 horas. Colete as células em uma placa de colheita multicanal ou similar.

Adicione o líquido cintilador e leia as contagens por minuto ou CPM por poço. Usando um contador de cintilação top count N XT ou similar, determine a proporção de microesferas por célula utilizando aquele que fornece uma CPM consistentemente acima de 5.000, mas abaixo de 15.000, conforme nossa experiência. Uma proporção de três microesferas por célula geralmente fornece a estimulação ideal tanto para células respondentes quanto para células Treg em todos os indivíduos humanos testados.

Encha um tubo cônico de 50 mililitros com 15 mililitros de fal plus. Em seguida, realize uma diluição de um para seis de 50 mililitros de camada leucócita, adicionando 250 mililitros de PBS ao tubo de sangue. Cubra lentamente 25 mililitros da camada leucócita diluída sobre o fial pack sem perturbar as camadas.

Centrifugue a 800 vezes G durante 30 minutos a quatro graus Celsius. Com o freio desligado, colete cuidadosamente a camada de PBMC, que é a fase intermediária branca entre o frasco e o tampão. Se necessário, raspe as células da parede do tubo.

Espere alguns minutos e colete-os novamente da fase intermediária. Transfira as células para tubos novos de 50 mililitros e lave-as preenchendo os tubos com PBS para formar o pellet. Os PBMCs.

Repita a etapa de lavagem duas vezes a cada vez. Combine dois pellets celulares em um único tubo, e, por fim, reúna todos os pellets celulares em um único tubo de 50 mililitros. Em seguida, utilize 20 microlitros das células suspensas para determinar a viabilidade celular pelo método de exclusão de azul de tripano.

Teste a geração de APCs transferindo um mililitro dos PBMCs viáveis para um novo tubo. Em seguida, adicione quatro mililitros de meio e irradie as células com 5.000 rads. Complete o tubo contendo o restante dos PBMCs com tampão PBS. Após centrifugar as células a 250 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius, despreze o sobrenadante e re-suspenda as células em quatro mililitros da mesma mistura.

Em seguida, adicione 200 microlitros de microesferas máximas antí-CD4 aos PBMCs e incube a mistura de células e microesferas a quatro graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, lave as células em 40 mililitros de tampão PBS, depois centrifugue para formar o pellet celular. Em seguida, despreze o sobrenadante e ressuspenda as células em oito mililitros de tampão PBS desgaseificado à temperatura ambiente.

Em seguida, utilize filtros de separação com pres para filtrar e separar a suspensão celular. Então, divida o PBM CS em dois tubos de 15 mililitros. Adicione quatro mililitros dos P BMCs a cada tubo.

Acople duas colunas a um separador minimax e posicione tubos de coleta abaixo de cada coluna. Em seguida, adicione três mililitros de tampão PBS DGAs a cada coluna e, quando não restar mais tampão, sobreposicione toda a solução celular de quatro mililitros de cada tubo sobre as colunas antes que a suspensão celular termine completamente. Adicione três mililitros de tampão PBS DGAs, à temperatura ambiente, a cada coluna e deixe o tampão passar para os tubos de coleta.

Adicione mais tampão até que saia claro. Pipete mais cinco mililitros do tampão DGAs nas colunas LS e, em seguida, remova as colunas LS do separador minimax. Coloque as colunas em novos tubos coletores estéreis de 50 mililitros.

Deixe sair meio mililitro e, em seguida, empurre lentamente o restante do volume, que é de cerca de quatro mililitros. Agora, combine as duas frações CD4 positivas. Em seguida, adicione até 50 mililitros de PBS ao tubo e conte as células após centrifugar as células a 400 ×g durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Resuspenda as células em dois mililitros de tampão PBS. Combine os anticorpos a serem utilizados para coloração de superfície em um único tubo: anti-CD14, CD32, CD116 e, opcionalmente, anti-CD4. Retire uma alíquota da mistura para coloração do tubo menos um fluorocromo.

Prepare o tubo FMO transferindo cinco microlitros da suspensão celular por mililitro para um tubo fax e marque as células com dois microlitros do coquetel de anticorpos previamente preparado. Em seguida, adicione células não marcadas e microesferas revestidas com IgG de camundongo para serem marcadas com um único fluorocromo a novos tubos fax individuais, para uso como controles de compensação para classificação celular. Depois, adicione 50 microlitros de CD25 humano anti-PE ao coquetel e adicione o coquetel ao restante da suspensão celular.

Incube os tubos a quatro graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação das células com o coquetel de anticorpos, adicione tampão PBS às células e, em seguida, centrifugue-as para obter o pellet. Suspenda o pellet em tampão PBS numa concentração de 10⁷ células por mililitro.

Utilize o tubo FMO para definir o limiar de separação de células T CD25 positivas. Usando esta estratégia de gateamento, primeiro, estabeleça um gate ao redor das células FITC negativas para excluir as células FITC positivas, que compreendem monócitos, macrófagos e todas as demais células não T CD4 positivas, conforme demonstrado nesta figura. Em um gráfico separado, delimite gates para células T CD25 negativas e CD25 baixas e células Treg CD25 altas como nesta figura.

Após o fluxo, separar os subconjuntos celulares, centrifugar os tubos de coleta e manter as células T em gelo até o plaqueamento. Rotule uma placa de 96 poços com fundo em U conforme mostrado na tabela. Suspenda uma alíquota de 50 microlitros de microesferas revestidas com CD3, calculada para uma concentração de três microesferas por célula respondente por poço, em meio completo com 10% de soro humano AB poolado na placa de 96 poços, e então dilua as APCs previamente irradiadas no meio para uma concentração de cinco vezes 10 à quinta células por mililitro.

Adicione 50 microlitros das células à placa de 96 poços e, em seguida, adicione 2,5 vezes 10 à quarta células T CD4 positivas CD25 negativas ou CD4 positivas CD25 baixas por poço em triplicata. Adicione as Tregs à linha B e aos poços rotulados como Tregs apenas da co-cultura numa proporção de 1 para 10, conforme mostrado aqui. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius em um incubador com 5%CO2 em umidade saturada por 72 horas. A seguir, pulse as células com um microcurie de timidina tritiada e continue a incubação a 37 graus Celsius pelas próximas 16 horas após a incorporação da timidina nas últimas horas da co-cultura.

Utilize um colhedor tipo filter mate para colher as células em uma placa de colheita com múltiplas telas. Em seguida, cubra a placa de colheita com uma tampa plástica transparente previamente preenchida com um fluido de cintilação. Por fim, leia os CPM por poço.

Usando um contador de cintilação, subpopulações de linfócitos T podem ser isoladas com alta pureza por meio deste sistema, conforme observado na seguinte série de diagramas de dispersão: células T CD4 positivas CD25 negativas são mostradas aqui no quadrante inferior. Na próxima figura, pode-se observar células T CD4 positivas CD25 baixas altamente purificadas. Uma população pura de células T CD4 positivas classificadas por citometria de fluxo.

Células Treg CD25 alta são mostradas no controle do gate superior. Culturas de tipo celular único de APCs e Tregs de indivíduos saudáveis exibiram pouca ou nenhuma proliferação acima do fundo, conforme medido pela incorporação de timidina, enquanto células T naïve CD25 negativas e células T CD25 baixas ativadas in vivo exibiram proliferação acentuada, que é suprimida quando esses tipos de células responsivas são cultivados em co-cultura com células Treg. Embora pequenas diferenças na capacidade das Tregs de suprimir células responsivas naïve CD25 negativas e células T CD25 baixas ativadas in vivo tenham sido observadas.

Não foi um controle significativo. Culturas de tipo celular único de APCs e Tregs de indivíduos em risco exibiram pouca ou nenhuma proliferação acima do fundo, conforme medido pela incorporação de timidina. Enquanto isso, células T ingênuas CD25 negativas e células T CD25 baixas ativadas InVivo exibiram níveis mais baixos de proliferação em comparação com controles saudáveis.

Os linfócitos T responsivos foram ainda mais suprimidos pelos tregs e pelos cultivos em co-cultura, já que o ensaio gera resultados confiáveis. Podemos ainda concluir que valores baixos de CPM sugerem defeitos potenciais na transdução de sinal, os quais deveriam ser investigados mais a fundo em um tipo diferente de estudo. A diferença na capacidade dos tregs de suprimir linfócitos T responsivos CD25 negativos versus CD25 baixos em indivíduos em risco, entretanto, foi significativa.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como conectar de forma fluida todas as etapas necessárias para um teste funcional bem-sucedido e confiável para a detecção de Tregs em indivíduos saudáveis e em indivíduos com sistemas imunológicos comprometidos. Por exemplo, em indivíduos com diabetes tipo 1.