Name: Longo prazo Cultura de Amostras de mama Humano do Câncer e sua análise por meio de tomografia óptica de Projeção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda a cultivar amostras primárias de câncer de mama em matriz de colágeno por 20 dias e analisar seu crescimento tridimensional por meio de tomografia óptica de projeção. Este método permite avaliar respostas individuais a medicamentos.

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Agradecemos a Lorna Renshaw (Edinburgh Breast Unit) para sua inestimável assistência na obtenção de amostras clínicas. Uso de material tumoral foi aprovado pelo Comitê de Ética de Pesquisa Lothian (08/S1101/41) e obtido sob os auspícios do Centro Experimental Cancer Medicine programa (Edinburgh). Este trabalho é apoiado pelo Conselho de Financiamento escocês. ADL é uma senhorita Margaret Butters Reekie companheiros Confiança clínico.

1. Extração de colágeno de Tails Rat <ol><li> Lugar fresco congelado rabos de rato em etanol 70%. </li><li> Deglove a pele sobrejacente com um bisturi expondo tendões. </li><li> Faixa de tendões longe de cauda e colocar em etanol 70% para esterilizar. </li><li> Pesar os tendões coletados e transferidos para o ácido acético (1g tendão ao ácido acético 0,5 M 250ml). Mix de 48hr a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a mistura de ácido tendão / acético a 10.000 g por 30min e descartar o pellet. </li><li> Adicionar um volume igual a 10% (w / v) NaCl para o sobrenadante e deixar a mistura repousar uma noite a 4 ° C. </li><li> Recolher as ricas em colágeno, camada inferior insolúveis e centrifugado para um mais 30min a 10.000 g. </li><li> Ressuspender o material rico em colágeno em ácido acético 0,25 m a 4 ° C e dialyse contra 1:1000 ácido acético a 4 ° C por 3 dias, mudando o tampão de diálise duas vezes por dia. </li><li> Além disso esterilizar a solução de colágeno por centrifugação (20.000 g para 2hr) e armazenar a 4 ° C. </li><li> Diluir colágeno conforme requerido, com a adição de ácido acético 1:1000 estéril a uma concentração de ações de 1mg/ml. </li></ol> 2. 3D Criação de Ensaio O ensaio 3D é baseado em um ensaio de linha celular, publicado anteriormente 2. <ol><li> Biópsias múltiplas são colhidas consentindo pacientes no momento da ressecção cirúrgica curativa para o câncer de mama invasivo. </li><li> Por olho, divide os núcleos com um bisturi em um milímetro três fragmentos. Guarnição e descartar gordura macroscopicamente distintos. </li><li> Mergulhe os fragmentos em MEGM mídia completa. O tecido pode ser armazenado neste estado por até 1h. </li><li> Para criar o gel de colágeno mix, no gelo colágeno da cauda de rato 1mg/ml, 1:1000 ácido acético filtrada, DMEM/F12 10x e 0,22 m NaOH em uma proporção de 3:5:1:1 para criar uma concentração de colágeno final de 0,3 mg / ml. </li><li> Injetar 1,2 ml da mistura de colágeno em poços individuais de uma placa de 24 poços e coloque em uma incubadora a 37 ° C por 10 min para iniciar gelificação. </li><li> Após 10min, retire a placa de 24 poços da incubadora. Coloque os pedaços de tumor para o colágeno gelificação e suavemente empurrá-los para o centro do gel usando uma ponteira 10μl. Devolver a placa de 24 poços para a incubadora de 1hr. </li><li> Para ER + tumores, suplemento MEGM media completo com β-estradiol a uma concentração de 3.2x10 -10 M. Uma vez que os ensaios de gel têm gel para 1hr, cuidadosamente introduzir 1,2 ml do meio suplementado em cada poço. A concentração de β-estradiol final no ensaio vai para equilibriate 1.6x10 M -10 a recapitular os níveis de estrogênio fisiológicas encontradas no tecido mamário 3. </li><li> Executar uma ponteira 10μl em torno da borda interna de cada bem, liberando cada gel circunferencialmente, permitindo assim que cada gel para flutuar livremente na mídia. Devolver a placa de 24 poços para a incubadora. </li><li> Troca complementada media duas vezes por semana até o término do experimento. Rescindir o experimento através da remoção de mídia e adicionando um fixador formalina. </li></ol> 3. Coloração de anticorpos de Ensaio em preparação para Tomografia projeção óptica Adotamos um método previamente publicados por 4 toda amostra de coloração. <ol><li> Lavar formol espécimes fixados por 30min em PBS. Desidratar o gel stepwise em metanol diluído em PBS contendo 0,05% Tween 20 (PBST 0,05%): 33%, 66% e 100% para ≥ 15min em cada etapa. </li><li> Incubar o tecido em MeOH preparados na hora: DMSO: 30% H 2 O 2 em uma proporção de 02:01:03 (15% v / v H 2 O 2) em temperatura ambiente por 24 horas para saciar a autofluorescência. </li><li> Lavar as amostras duas vezes por 30min em metanol. Congelar as amostras a -80 ° C cinco vezes por pelo menos 1 hora de cada vez e de volta à temperatura ambiente (RT) para garantir que os antígenos nas partes mais profundas do tecido são tornados acessíveis. </li><li> Reidratar o tecido de volta para PBST 0,05% com metanol como solvente (33%, 66% e 100% por 15 min em cada etapa). </li><li> Bloquear o tecido em solução de bloqueio (10% de soro em PBST 0,05%) para 24 horas. </li><li> Incubar o tecido com o anticorpo primário para identificar o conteúdo epiteliais, usando de coelho anti-citoqueratina na concentração de 1:500 diluídos em 1,5 ml de solução bloqueadora contendo DMSO 5% para 48hr. </li><li> Lavar as amostras quatro vezes com PBST 0,05% para cada 30min. </li><li> Incubar o tecido com anticorpo fluorescente secundário (1:100 cabra anti-coelho Alexa555), diluído em solução de bloqueio de 1,5 ml contendo DMSO 5% para 48hr. </li><li> Lavar as amostras novamente com PBST 0,05% quatro vezes por 30min cada. </li></ol> 4. Tomografia projeção óptica Tomografia projeção óptica é uma técnica de microscopia previamente desenvolvido para produzir imagens de alta resolução em 3D de espécimes biológicos fluorescentes com uma espessura de até 15 milímetros 5. <ol><li> Monte o sgel sustentado em 1% agarose baixo ponto de fusão e desidratação em metanol 100% para 24h. Limpar o espécime em Babb solução (1:2 álcool benzílico, Benzoato de benzilo) para 48hr e digitalizar usando o OPT Scanner 3001M (Bioptonics). </li><li> Alvo e autofluorescência são capturados usando o conjunto de Cy3 filtro (excitador 545nm/30 nm, emissor 610/75 nm) e GFP1 conjunto de filtros (excitador 425nm/40 nm, emissor LP475 nm), respectivamente. </li></ol> 5. Reconstrução e quantificação em 3D <ol><li> O conjunto de projeções angular adquirida pela OPT pode ser reconstruído usando NRecon software (SkyScan) para criar uma série de fatias de seção transversal através do ensaio de invasão. Este software está disponível para download gratuitamente no <a href="http://www.skyscan.be/products/downloads.htm">http://www.skyscan.be/products/downloads.htm</a> . </li><li> Analisar os dados reconstruídos usando software Volocity (PerkinElmer). Software de demonstração gratuita está disponível para download em <a href="http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/">http://www.cellularimaging.com/products/Volocity/demo/</a> . </li><li> Para quantificar o volume epiteliais através da coloração citoqueratina, definir um limite de intensidade mínima voxel para reduzir a interferência da fluorescência de fundo no canal alvo. Definimos esse limite empiricamente em 9000 au Usando uma lista de parâmetros disponíveis no aplicativo de medição, nós quantificamos o volume de epitélio em continuidade com o núcleo original (demarcadas no canal autofluorescent). Isso nos permitiu quantificar volumes de crescimento epitelial entre diferentes amostras de tumor. </li></ol> 6. Resultados representativos: Durante o desenvolvimento do ensaio, um total de 52 biópsias de câncer de mama com uma ampla gama de estudos histopatológicos, foram utilizados. Destes &lt;10% (5 / 52) não conseguiram fornecer pelo menos um ensaio de invasão viável. Falha ensaio foi devido a qualquer bacteriana supra-infecção ou insuficiente tumor material de biópsia. Portanto, aplicação do ensaio não está restrito a um subtipo específico de cancro da mama. Ensaios típico (figura 1) fixo após 20 dias na cultura de colágeno e, posteriormente, coradas para citoqueratina. Volocity software é capaz de reconhecer tanto a granel, a epitelial contínua com o núcleo original e grupos destacados de invadir células e quantificar cada volume separadamente. <img src="/files/ftp_upload/3085/3085fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Ensaios Invasion seguintes fixação e quantificação. O ensaio suporta amostras obtidas a partir de múltiplos subtipos de câncer de mama: a) ER + b) HER2 + e c) ER-.

<ol><li>Lopez-Garcia, M. A., Geyer, F. C., Lacroix-Triki, M., Marchio, C., Reis-Filho, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+precursors+revisited%3A+molecular+features+and+progression+pathways.+Histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Breast cancer precursors revisited: molecular features and progression pathways. Histopathology.</a> 57, 171-192 (2010).</li>
<li>Sabeh, F., Shimizu-Hirota, R., Weiss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-dependent+versus+-independent+cancer+cell+invasion+programs%3A+three-dimensional+amoeboid+movement+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protease-dependent versus -independent cancer cell invasion programs: three-dimensional amoeboid movement revisited.</a> J Cell Biol. 185, 11-19 (2009).</li>
<li>Dabrosin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+extracellular+local+levels+of+estradiol+in+normal+breast+in+vivo+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Increased extracellular local levels of estradiol in normal breast in vivo during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> J Endocrinol. 187, 103-108 (2005).</li>
<li>Alanentalo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat Methods. 4, 31-33 (2007).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Hidalgo-Carcedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+requires+suppression+of+actomyosin+at+cell-cell+contacts+mediated+by+DDR1+and+the+cell+polarity+regulators+Par3+and+Par6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration requires suppression of actomyosin at cell-cell contacts mediated by DDR1 and the cell polarity regulators Par3 and Par6.</a> Nat Cell Biol. 13, 49-58 (2011).</li>
<li>Katz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+on+the+HER2+amplicon%2C+C35%2C+is+an+oncogene+in+breast+cancer+whose+actions+are+prevented+by+inhibition+of+Syk%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A gene on the HER2 amplicon, C35, is an oncogene in breast cancer whose actions are prevented by inhibition of Syk.</a> Br J Cancer. 103, 401-410 (2010).</li>
<li>Timpson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Regulation+of+RhoA+Activity+during+Pancreatic+Cancer+Cell+Invasion+Driven+by+Mutant+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial Regulation of RhoA Activity during Pancreatic Cancer Cell Invasion Driven by Mutant p53.</a> Cancer Res. 71, 747-757 (2011).</li>
</ol>

SEW e JF são empregados por MRC Tecnologia, que está comercializando scanners Bioptonics OPT. Outros autores declaram que não há conflito de interesses.

À base de colágeno ensaios para estudar o comportamento de linhagens de células de câncer são hoje amplamente utilizadas 6,7,8. No entanto, estas análises não têm refletido na complexidade do total do tumor e seu ambiente. Neste estudo, nós mostramos que materiais câncer de mama humano pode ser usado de uma maneira similar, ex vivo. Além disso, OPT é uma ferramenta útil para caracterizar a expansão 3D de câncer de mama. Descobrimos que a principal limitação desta técnica é a disponibilidade de materiais tumor (um único núcleo biópsia é suficiente para 4-6 ensaios). Outro fator limitante é que a invasão estrutural ocorre apenas em cerca de 40% dos ensaios. Para superar isso, nós regularmente adicionar qualquer tipo de tratamento desejado por volta do dia 7 para todos os ensaios com o crescimento visível. O uso do OPT poderia ser estendido no futuro para também detectar alterações em massa, ex vivo, resultantes do tratamento da toxicodependência. Este por sua vez, poderia facilitar o tratamento do câncer mais individualizada, independente de modelos animais. Estamos a explorar a resposta de tumores ER + ao tamoxifeno ex vivo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> No. de catálogo </td></tr><tr><td> MEGM Completo </td><td> Lonza </td><td> CC-3150 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D8900 10X1L </td></tr><tr><td> β-estradiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E8875-250mg </td></tr><tr><td> Coelho anti-citoqueratina </td><td> Dako </td><td> Z0622 </td></tr><tr><td> Cabra anti-coelho Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td></tr></tbody></table> Todos os outros reagentes padrão foram obtidos da Sigma-Aldrich.

longo prazo cultura de amostras de mama humano do câncer e sua análise por meio de tomografia óptica de projeção

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Câncer de mama é uma das principais causas de mortalidade no mundo ocidental. Está bem estabelecido que a propagação do câncer de mama, primeiro localmente e, mais tarde distalmente, é um fator importante no prognóstico do paciente. Sistemas experimentais de câncer de mama dependem de linhas de células normalmente derivadas de tumores primários ou derrame pleural. Dois grandes obstáculos dificultam esta pesquisa: (i) alguns conhecidos sub-tipos de cânceres de mama (principalmente pobres prognóstico tumores luminal B) não estão representados em colecções linha atual, (ii) a influência do microambiente do tumor geralmente não é tido em conta. Nós demonstramos uma técnica para a cultura amostras de câncer de mama primário de todos os tipos de sub-. Isto é conseguido usando sistema tridimensional de cultura (3D) em que pequenos pedaços de tumor são incorporados no colágeno de ratos macio eu almofadas. Dentro de 2-3 semanas, as células cancerígenas se espalham para o colágeno e formam várias estruturas semelhantes aos observados em tumours1 humana. Adipócitos viável, células epiteliais e fibroblastos dentro do núcleo original eram evidentes na histologia. Células epiteliais malignas com morfologia squamoid foram demonstradas em invadir o colágeno circundante. Pleomorfismo nuclear era evidente dentro dessas células, juntamente com figuras de mitose e corpos apoptóticos. Nós empregamos Tomografia projeção óptica (OPT), uma tecnologia de imagem 3D, a fim de quantificar o grau de disseminação do tumor em cultura. Temos usado OPT para medir o volume maior da cultura tumor, um parâmetro rotineiramente medidas durante o tratamento neo-adjuvante de pacientes com câncer de mama para avaliar a resposta à terapia medicamentosa. Aqui, apresentamos uma oportunidade de tumores de mama humano sem cultura sub-tipo de preconceito e quantificar a propagação dos ex vivo. Este método poderia ser usado no futuro para quantificar a sensibilidade da droga no tumor original. Isso pode fornecer um modelo mais preditivo do que linhas celulares usados ​​atualmente.

Nós desenvolvemos um à base de colágeno<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio que promove a proliferação e invasão a partir de amostras de todos os subtipos de câncer de mama. Tomografia projeção óptica, uma técnica de microscopia tridimensional foi utilizado para visualizar e quantificar a expansão do tumor. Este ensaio poderá ser utilizada para quantificar a resposta à droga das amostras de tumor individual.

Longo prazo Cultura de Amostras de mama Humano do Câncer e sua análise por meio de tomografia óptica de Projeção

O câncer de mama é uma das principais causas de mortalidade no mundo ocidental. É amplamente estabelecido que a disseminação do câncer de mama, primeiramente de forma local e posteriormente...

O objetivo geral deste procedimento é criar uma cultura de longa duração de tecido primário de câncer de mama e quantificar o padrão de crescimento tridimensional. Isso é realizado primeiramente por meio da extração de colágeno do tipo I das caudas de ratos. Em seguida, a amostra de biópsia do câncer é preparada e incorporada à matriz de colágeno.Após 20 dias em cultura, o tecido de câncer de mama é corado por imunofluorescência e escaneado utilizando tomografia de projeção óptica, e os dados são reconstruídos e quantificados. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o padrão de invasão do tumor de um indivíduo, o qual pode ser ainda mais quantificado por meio de análise tridimensional. A principal vantagem das culturas ex vivo é que utiliza materiais reais de câncer em um contexto fisiológico.Diferentemente dos cultivos de linhagem celular, a demonstração visual desta técnica é importante, pois é difícil obter tecido tumoral primário. A técnica correta otimizará as chances de um resultado experimental bem-sucedido. A demonstração desta técnica será feita por mim e por Joanne Farrell da MRC Technology, para começar a extração de colágeno tipo um.Coloque caudas congeladas de rato em etanol 70% até descongelar. Usando um bisturi, remova a pele sobrejacente para expor os tendões, separe os tendões da cauda e coloque-os em etanol 70% para esterilizar. Pese os tendões coletados e transfira-os para ácido acético.Agite durante 48 horas a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue a mistura de ácido acético com tendão a 10.000 ×g durante 30 minutos e descarte o pellet.Adicione um volume igual de cloreto de sódio a 10% ao sobrenadante S e deixe a mistura em repouso durante a noite a quatro graus Celsius. Pipete e descarte a camada superior. Em seguida, colete a camada inferior insolúvel rica em colágeno e centrifugue por 30 minutos a 10.000 vezes.Em seguida, ressuspenda o material rico em colágeno em ácido acético 0,25 molar a quatro graus Celsius e pipete para dentro de uma bolsa de diálise. Realize a diálise contra ácido acético de 1 a 1000 durante três dias a quatro graus Celsius.Alterando o tampão de diálise duas vezes ao dia. O colágeno pode ser ainda mais esterilizado com uma etapa adicional de centrifugação e suspensão em ácido acético para este ensaio. Inicie com múltiplas biópsias de núcleo obtidas de pacientes consentidos no momento da ressecção cirúrgica curativa para câncer de mama invasivo, à vista e utilizando um bisturi.Divida a amostra em fragmentos de um milímetro cúbico, remova e descarte qualquer gordura macroscopicamente distinta. Montar a amostra em uma lâmina de bisturi permite uma melhor visualização dentro da câmara de fluxo laminar e torna a dissecação precisa e segura. Mergulhe os fragmentos no meio completo MEGM.O tecido pode ser armazenado nesse estado por até uma hora para criar uma mistura de gel de colágeno de 0,3 miligramas por mililitro. Coloque na geladeira uma mistura contendo um miligrama por mililitro de colágeno de cauda de rato, ácido acético filtrado na proporção de 1 para 1000, D-M-E-M-F 12 diluído 10 vezes e hidróxido de sódio 0,22 molar. Pipete 1,2 mililitro da mistura de colágeno em poços individuais de uma placa de 24 poços e coloque na incubadora a 37 graus Celsius por 10 minutos. Para iniciar a formação do gel, remova a placa da incubadora.Coloque os fragmentos do tumor sobre o colágeno gelificado e use a ponteira de uma pipeta de 10 microlitros para empurrá-los suavemente para o centro do gel. Retorne a placa ao incubador por uma hora. Suplemente o meio completo A-M-E-G-M com beta-estradiol até uma concentração final de 3,2 vezes 10 à potência de menos 10 molar.Após a incubação dos ensaios em gel por uma hora, introduza cuidadosamente 1,2 mililitros do meio suplementado em cada poço. A concentração final de beta-estradiol atingirá 1,6 vezes 10 elevado a menos 10 molar, recapitulando os níveis fisiológicos de estrogênio encontrados no tecido mamário. Passe a ponteira de uma pipeta de 10 microlitros ao longo da borda interna de cada poço, soltando cada gel circularmente, permitindo assim que cada gel flutue livremente no meio.Retorne a placa de 24 poços ao incubador e troque o meio suplementado duas vezes por semana até o término do experimento. O crescimento invasivo pode ser observado em tempo real usando um microscópio de campo claro aqui. Um vídeo com captura de intervalo de tempo e profundidade de foco estendida demonstra a invasão do epitélio a partir da borda do tumor para dentro do colágeno circundante ao longo de 60 horas, do sétimo ao nono dia.Encerre o experimento removendo o meio e adicionando uma fórmula. Fixador por 48 horas para imunomarcar as amostras do ensaio 3D para tomografia por projeção óptica. Primeiro, transfira os espécimes fixados em formal para um frasco a partir dos poços.Em seguida, lave-os por 30 minutos. Realize uma desidratação progressiva dos géis em PBS utilizando metanol diluído em PBS contendo 0,05% de Tween 20, incube o tecido em metanol DMSO com peróxido de hidrogênio a 30%, recém-preparado, na proporção de dois para um para três, à temperatura ambiente durante 24 horas para suprimir a autofluorescência. A seguir, lave as amostras duas vezes por 30 minutos.No congelamento-descongelamento com metanol, submeta as amostras de menos 80 graus Celsius à temperatura ambiente cinco vezes, durante pelo menos uma hora cada vez, para garantir que os antígenos nas partes mais profundas do tecido se tornem acessíveis. Em seguida, reidrate o tecido de volta ao PBS com 0,05%T entre 20 usando metanol como diluente, incube o tecido em solução bloqueadora por 24 horas a quatro graus Celsius para identificar o conteúdo epitelial, incube as amostras em anticorpos primários coelho anti-citoceratina diluídos em 1,5 mililitros de solução bloqueadora com 5%DMSO por 48 horas a quatro graus Celsius. Lave as amostras em PBS com 0,05%T entre 24 vezes por 30 minutos cada.Incube o tecido em anticorpos secundários fluorescentes, diluídos em 1,5 mililitros de solução bloqueadora contendo 5% de DMSO por 48 horas a quatro graus Celsius. Lave novamente as amostras em PBS com 0,05% por entre 24 vezes, durante 30 minutos cada. Para preparar as amostras para tomografia por projeção óptica, monte o gel corado em agarose com ponto de fusão baixo a 1% e desidrate em metanol a 100% por 24 horas.Em seguida, clarifique o espécime em solução BABB por 48 horas. Analise as amostras utilizando o scanner OPT 3001 M. Tanto o sinal alvo quanto a autofluorescência são capturados utilizando os conjuntos de filtros SI três e GFP um, respectivamente.O espécime é sustentado em um cilindro transparente de gel de aro e rotacionado em intervalos angulares de 0,9 graus. Uma imagem digital do espécime estático é capturada em cada uma das 400 posições rotacionadas. Utilize o software n recon para reconstruir o conjunto de projeções angulares adquiridas em OPT, criando uma série de fatias em corte transversal através do ensaio de invasão.Analise os dados reconstruídos utilizando o software de velocidade para quantificar o volume epitelial por citoceratina. Na coloração, defina um limiar mínimo de intensidade de vóxel para reduzir a interferência da fluorescência de fundo no canal-alvo. Este limiar é definido empiricamente em 9.000 unidades arbitrárias.Por fim, utilize uma lista de parâmetros disponíveis no aplicativo de medição e os dados do canal autofluorescente, que delimita o epitélio contínuo a um núcleo original, para quantificar o volume do epitélio em um crescimento tumoral. Aqui é mostrado um ensaio típico fixado após 20 dias em cultura de colágeno e posteriormente corado para citoceratina. O software Velocity é capaz de reconhecer tanto a massa epitelial contínua com o núcleo original quanto grupos destacados de células invasoras, quantificando separadamente cada volume.As biópsias originais obtidas eram de uma variedade de tumores após culturas ex vivo. Também seria possível utilizar outras técnicas, como imunohistoquímica ou imunofluorescência, para determinar taxas de proliferação ou apoptose ou qualquer outro parâmetro semelhante. O desenvolvimento dessa técnica permitiu que pesquisadores na área de pesquisa translacional de câncer de mama explorassem métodos para identificar resistência a medicamentos em indivíduos com câncer de mama.

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Biologia

Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/59020/longitudinal-morphological-physiological-monitoring-three-dimensional'&gt;Huang, Y. et. al., Monitoramento morfológico e fisiológico longitudinal de esferoides tumorais tridimensionais usando tomografia de coerência óptica. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o uso da tomografia de coerência óptica (OCT) para monitorar esferoides tumorais em uma placa de vários poços, capturando imagens transversais de alta...

Monitoramento morfológico e fisiológico de esferoides tumorais por meio de tomografia de coerência óptica 

Massas de tecido complexos, a partir de órgãos de tumores, são compostas de vários elementos celulares. Nós elucidada a contribuição de fenótipos celulares dentro de um tecido utilizando ratinhos transgénicos fluorescentes multi-marcados em combinação com coloração de imunofluorescência multiparamï seguido de separação espectral para decifrar origem celular, bem como características de células com base na expressão da proteína.

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Três cultura tridimensional de células epiteliais mamárias de uma membrana basal reconstituída é um método útil para recapitular a arquitectura in vivo da mama benigna, e para diferenciar o fenótipo maligno do fenótipo da mama benigna. Importante, este sistema pode ser aplicado para estudar os carcinomas invasivos em outros tecidos.

Três Culturas dimensionais: Uma ferramenta para o estudo normal Acináceo Arquitetura vs transformação maligna das células de mama

Protocolos são descritos para estudar a migração de células do cancro da mama, a proliferação e a colonização em um sistema modelo de tecido ósseo humano explante.

Métodos para a cultura fémur humano explantes de tecido para o Estudo de Câncer de Mama Colonização celular do Niche metastático

Tomografia de coerência óptica (OCT), uma tecnologia de imagem tridimensional, foi usada para monitorar e caracterizar a cinética de crescimento de esferoides tumor multicelulares. Precisa quantificação volumétrica de esferoides tumor usando um voxel contando a abordagem e deteção de tecido livre de rótulo morto nos esferoides baseado no contraste intrínseco atenuação óptica, foram demonstradas.

Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Culturas tridimensionais de amostras de BMPC pacientes e xenoenxertos de câncer de próstata metastático mantêm a heterogeneidade funcional de seus tumores originais resultando em cistos, esferoides e organoides complexos, semelhantes a tumores. Este manuscrito fornece uma estratégia de otimização e protocolo para a cultura 3D de amostras derivadas de pacientes heterogêneos e sua análise utilizando IFC.

Estabelecimento e Análise de Organoides Tridimensionais (3D) derivados de amostras de metástase óssea do câncer de próstata paciente e seus Xenoenxertos

Os organoides derivados do paciente (PDOs) são uma ferramenta poderosa na pesquisa de câncer translacional, refletindo tanto a heterogeneidade genética e fenotípica da doença quanto a resposta a terapias anticânculas personalizadas. Aqui, um protocolo consolidado para gerar PDOs de câncer de bexiga primário humano em preparação para a avaliação de análises fenotípicas e respostas medicamentosas é detalhado.

Cultura dos Organoides do Câncer de Bexiga como Ferramentas de Medicina de Precisão

Descrevemos um protocolo para produção, cultura e visualização de cânceres humanos com metástase para as superfícies peritoneais. Os espécimes tumorais ressecados são cortados com vibratótomo e cultivados em insertos permeáveis para aumento da oxigenação e viabilidade, seguidos de análises de imagem e a jusante usando microscopia confocal e citometria de fluxo.

Cultura e Imagem de Cortes Extraviais de Tumor Organotípico de Pseudomixoma Peritonei Ex Vivo de Espécimes Tumorais Humanos Ressecados

Um protocolo detalhado é fornecido aqui para estabelecer organoides mamários humanos a partir de ressecções de tumor de mama derivadas de pacientes ou tecido mamário normal. O protocolo fornece instruções passo a passo abrangentes para cultivar, congelar e descongelar organoides mamários derivados de pacientes humanos.

Estabelecimento e Cultura de Organoides Mamários Derivados da Paciente

Este protocolo oferece uma estrutura sistemática para o estabelecimento de organoides de câncer de ovário de diferentes estágios da doença e aborda os desafios da variabilidade específica da paciente para aumentar o rendimento e permitir uma expansão robusta a longo prazo para aplicações subsequentes. Inclui etapas detalhadas para processamento de tecidos, semeadura, ajuste dos requisitos de meios e coloração por imunofluorescência.

Estratégia para Biobanco de Organoides para Câncer de Ovário: Abordando a Heterogeneidade Interpaciente entre Subtipos Histológicos e Estágios da Doença

Aprenda a cultivar amostras primárias de câncer de mama em matriz de colágeno por 20 dias e analisar seu crescimento tridimensional por meio de tomografia óptica de projeção. Este método permite avaliar respostas individuais a medicamentos.

Longo prazo Cultura de Amostras de mama Humano do Câncer e sua análise por meio de tomografia óptica de Projeção

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