Mapeamento Inibitória Circuitos Neuronal por Laser Scanning fotoestimulação

O objetivo geral deste procedimento é investigar a organização funcional local dos circuitos neuronais inibitórios. O procedimento começa com a preparação de fatias de cérebro vivo do córtex somatossensorial primário de camundongos. O próximo passo é visualizar e registrar a partir de tipos de células inibitórias que expressam GFP direcionada na fatia do cérebro.

Após essa fotoestimulação de varredura a laser via glutamato, o desenjaulamento é usado para ativar pequenos aglomerados de neurônios pré-sinápticos como excitatórios ou inibitórios. As correntes pós-sinápticas são registradas na GFP expressando neurônios inter. A etapa final é passar por fotoestimulação, análise de dados e gerar mapas quantitativos de entrada sináptica para os neurônios registrados.

Em última análise, a fotoestimulação de varredura a laser combinada com gravações de células inteiras permite a construção de mapas detalhados de entradas sinápticas para tipos específicos de neurônios inibitórios, o que pode permitir determinar a organização e a função dos circuitos corticais inibitórios locais. A técnica baseada em fotoestimulação foi iniciada pelo Dr. Larry Katz, Ned Calloway e desenvolvida pelo Dr. Carols Waboda, meu pi, Dr. Xing Z treinado com o Dr. Dr. Calloway, o Instituto Salk, onde liderou muitos estudos investigando circuitos interorais. Nosso grupo está atualmente ampliando e dando continuidade a esses estudos, investigando circuitos interorais.

Para iniciar este procedimento, sacrifique um camundongo transgênico no pós-natal de duas a três semanas por decapitação e remova rapidamente o cérebro, coloque o cérebro em uma solução de corte congelada e oxigenada. Em seguida, use os óculos GFP para rastrear visualmente o cérebro e verificar a expressão de GFP. Em seguida, corte o córtex somatossensorial primário em seções de 400 micrômetros de espessura com um vibrador.

Incube as fatias na sacarose contendo um LCR borbulhado com 95% de O2 e 5% de CO2 a 32 graus Celsius por 30 minutos a uma hora. Depois disso, transfira as fatias para o A CSF regular em temperatura ambiente para preparar o laser para o experimento, ligue o sistema de resfriamento do laser e a fonte de alimentação. Em seguida, ligue todo o hardware relacionado ao controle de fotoestimulação, incluindo o sistema de espelho de varredura e modulador óptico e obturador eletrônico, e um amplificador de entrada de fotodiodo.

Em seguida, ligue o equipamento eletrofisiológico, como amplificador multi clamp 700 B e micro manipuladores. Registros eletrofisiológicos, fotoestimulação e imagens são conduzidos na câmara de perfusão de fatias montada no estágio motorizado do microscópio. Depois disso, ligue a câmera de imagem, a fatia será visualizada no microscópio vertical com DIC infravermelho e óptica epifluorescente através do sistema de imagem.

Em seguida, abra o software FS baseado em MATLAB e o software de câmera de captura Q no monitor. Antes de executar o experimento, verifique o sistema de fotoestimulação a laser e certifique-se de que esteja funcionando. Coloque um pedaço de papel sob a objetiva de microscópio quatro x para observar o padrão de varredura a laser enquanto o sistema está funcionando.

Para fazer o microeletrodo com resistência de quatro a seis mega OM, puxe um eletrodo de vidro com o extrator de pipeta. Em seguida, encha o eletrodo com uma solução interna contendo 0,1% de biotina para marcação celular e identificação morfológica. Em seguida, ligue o sistema de perfusão pressurizado para bombear A CSF para a câmara.

Assegure um nível de fluido constante de 2,0 milímetros acima da fatia na câmara. Uma alíquota da solução estoque de glutamato enjaulado MNI é adicionada a 25 mililitros de LCR A circulante para uma concentração de glutamato enjaulado 0,2 milimolar. Em seguida, transfira uma fatia de cérebro para a câmara de gravação.

Execute o sistema de imagem para verificar a qualidade do corte e localizar anatomicamente a área somatossensorial primária. Em seguida, ancore a fatia com um anel de platina com cordas feito sob medida e tome cuidado para não colocar a âncora sobre a região do cérebro destinada à gravação. Visualize as células com uma objetiva de 60 x com base na visualização da expressão de GFP sob um microscópio fluorescente DIC.

Identifique e selecione os tipos de células inibitórias. Observe que a gravação será realizada sob controle visual auxiliado por DIC infravermelho. O monitoramento de vídeo e a alternância entre os modos DIC e fluorescente são necessários para confirmar a localização da célula GFP enquanto abaixa o eletrodo até a célula-alvo.

Usando a técnica convencional de fixação de remendo. Primeiro, aplique pressão positiva no eletrodo. Mova-o para perto da superfície da célula para estabelecer uma covinha discernível na membrana celular alvo.

Em seguida, aplique pressão negativa rapidamente para formar uma giga vedação e quebrar a célula enquanto monitora as respostas de injeção de corrente no monitor de vídeo. Ao entrar, tire as imagens da GFP gravada expressando intraneurônio com ampliação de 60 x nos modos DIC e fluorescente para a verificação online. Antes de coletar os dados de fotoestimulação, injete pulsos de corrente hiperpolarizantes e despolarizantes para examinar as propriedades eletrofisiológicas básicas de cada célula.

Uma vez estável, a gravação de células inteiras é alcançada com boa resistência de acesso, que geralmente é inferior a 20 mega ohms, mude a objetiva do microscópio de 60 x para quatro x de ampliação para estimulação fotográfica de varredura a laser, adquira uma imagem de fatia com ampliação de quatro x e use-a para guiar e registrar os locais de fotoestimulação. Defina os parâmetros de fotoestimulação e aquisição de dados ativando o módulo de comutação de configuração do phys. Use um pulso de laser de um milissegundo de cerca de 20 miliwatts com um intervalo de estímulo de um segundo.

Para mapeamento de fotoestimulação, adquira traços de dados de um segundo amostrado a 10 kilohertz. Em seguida, carregue a imagem de quatro fatias x no módulo mapeador do phys. Defina a localização do soma e configure os locais de fotoestimulação de um padrão de 16 por 16 com 80, micrômetro por 80 micrômetros.

Espaçamento ao redor da localização da célula, que cobre todas as camadas corticais. Em seguida, mapeie o perfil de excitação do neurônio gravado examinando os locais de pico em resposta à fotoestimulação no modo de pinça atual. Nosso software fácil de usar com os recursos de exibição on-line facilita os experimentos de mapeamento.

Depois disso, mapeie as conexões do circuito excitatório local detectando as correntes pós-sinápticas excitatórias da célula registrada Com varredura a laser em locais diferentes, mantenha a célula em 70 milivolts negativos no modo de pinça de tensão para detectar correntes excitatórias internas. Em seguida, repita os mapas de corrente pós-sináptica excitatória duas a três vezes com o padrão de fotoestimulação girado ou invertido. Para mapear as conexões do circuito inibitório local, detecte as correntes inibitórias pós-sinápticas da célula registrada.

Mantenha a célula perto de zero milivolts neste caso, menos 15 milivolts no modo de grampo de tensão para detectar correntes inibitórias externas. Depois de completar todos os ensaios fisiológicos, remova o eletrodo suavemente da célula registrada. Remova a fatia do cérebro da câmara, fixe-a em 4% para formaldeído durante a noite e core as células registradas contra a biotina.

Neste experimento, a combinação da expressão de GFP, eletrofisiologia intrínseca e características morfológicas são usadas para classificar os neurônios inibitórios. Mostrado. Aqui estão o exemplo e um mapa de dados brutos para ilustrar a fotoestimulação de varredura a laser, que permite um mapeamento extensivo das conexões do circuito cortical local com o neurônio inibitório registrado. Aqui estão os exemplos dos mapas de entrada quantitativos codificados por cores derivados dos traços brutos mostrados na Figura D. As amplitudes dos eventos sinápticos detectados no interneurônio registrado são codificadas por cores e sobrepostas topograficamente aos locais de fotoestimulação.

A localização do corpo celular é indicada pelo círculo aberto vermelho na barra de escala. As cores quentes indicam fortes entradas sinápticas e as cores frias indicam conectividade fraca ou nenhuma conectividade com a célula alvo. Da mesma forma, a figura E apresenta o número de eventos sinápticos por local de desenjaulamento amostrado para o neurônio registrado.

A Figura F demonstra o tempo de início do primeiro evento sináptico detectado para a célula registrada após a fotoestimulação na barra de escala. As cores quentes indicam entrada curta, latência e cores mais frias indicam latências sinápticas mais longas. Assim, o LSPS permite a construção de mapas detalhados da posição, força, latência e número de entradas que afetam tipos específicos de neurônios inibitórios.

Bem, participando deste procedimento, é importante ser paciente, fazer uma condição de experimento limpa, mas neurônio de forma eficaz e com muito cuidado para mudar de objeto de alta ampliação para baixa modificação. Em seguida, o último uso do software terrestre muito bem.