Quantificar atividade agonista no G receptores acoplados à proteína

O objetivo geral deste procedimento é estimar a constante de afinidade relativa KB de um agonista para o estado ativo de um receptor por meio da análise de sua curva concentração-resposta. Isso é realizado primeiramente medindo as curvas concentração-resposta de um grupo de agonistas para provocar uma resposta em um receptor acoplado à proteína G. O próximo passo do procedimento é estimar os valores de eemax e EC 50 dos agonistas utilizando análise de regressão não linear.

Esses valores são então utilizados para calcular estimativas iniciais de parâmetros para a subsequente análise de regressão não linear envolvendo o modelo operacional. Como etapa final, obtêm-se estimativas relativas das constantes de afinidade de agonistas pelo estado ativo do receptor, utilizando análise de regressão não linear global das suas curvas de resposta à concentração. Em última instância, utilizando uma forma modificada do modelo operacional, a constante de afinidade de um agonista pelo estado ativo de um receptor, expressa em relação à de outro agonista, pode ser estimada por meio de análise de regressão não linear global das suas curvas de resposta à concentração.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de descoberta de fármacos, como, por exemplo, se um agonista possui seletividade por uma via de sinalização específica. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido aos detalhes da análise matemática. Para a estimativa dos valores relativos de KB do agonista, é necessária uma série de pelo menos duas curvas de resposta à concentração de agonista.

Uma discussão sobre as considerações para esses experimentos pode ser encontrada no protocolo escrito. Após obter as curvas de resposta, subtraia a resposta basal daquela medida na presença de cada concentração do agonista para começar a inserir os dados dos experimentos de resposta à concentração em uma tabela de dados. No software Prism, todas as concentrações logarítmicas do agonista são inseridas na coluna rotulada como X. As medições de resposta para o agonista que parece ter a resposta máxima maior ou valor eax são inseridas na coluna A, e aquelas para os outros agonistas são inseridas nas colunas adjacentes rotuladas com letras.

Digite as medidas replicadas das curvas de resposta à concentração em subcolunas de uma coluna com letra específica. Selecione a planilha de gráfico na qual os dados são plotados e selecione analisar para analisar os dados por meio de análise de regressão não linear utilizando a equação de inclinação variável, restrinja o parâmetro inferior a zero e realize a análise de regressão. Registre os parâmetros superior e log EC 50 para utilização no cálculo das estimativas iniciais de parâmetros.

Para calcular as estimativas dos parâmetros iniciais, atribua o log de tau K observado ao valor negativo do log EC 50 do agonista padrão. Em seguida, calcule o valor log RAI de cada agonista em teste como o logaritmo da quantidade composta pelo produto do valor eemax do agonista em teste multiplicado pelo EC 50 do agonista padrão, dividido pelo produto do valor emax do agonista padrão multiplicado pelo EC 50 do agonista em teste. Nesta equação, os parâmetros do agonista padrão são indicados com um apóstrofo.

Em seguida, atribua a constante de afinidade logarítmica do agonista em teste ao logaritmo negativo dos respectivos valores de CE. Após inserir os dados no Prism, certifique-se de que os dados do agonista com o maior valor de EMAX sejam inseridos na coluna A. Esse agonista é agora designado como padrão, enquanto os demais agonistas são designados como agonistas em teste. Em seguida, insira uma equação definida pelo usuário, log RAI, no Prism em várias linhas.

Neste caso, a equação definida pelo usuário envolve um total de cinco agonistas. Insira as estimativas iniciais dos parâmetros de bloqueio R e da constante de afinidade dos agonistas em teste. M sis recebe o valor EMAX do agonista padrão e M recebe o valor de um.

Agora insira as estimativas iniciais dos parâmetros dos valores de log RAI dos agonistas em teste. Aplique restrições aos parâmetros restringindo o log K um a zero e definindo log GR, m, sis e M como um valor compartilhado para todos os conjuntos de dados. Em seguida, inicie a análise de regressão não linear.

Os resultados fornecem os valores de log K observado e log RAI dos agonistas testados para a estimativa dos valores de KB do agonista em unidades absolutas de unidades inversas de molaridade; ensaios celulares in vitro que exibem atividade constitutiva do receptor são utilizados. Escolha os agonistas e projete o experimento conforme descrito no protocolo escrito. Calcule a atividade constitutiva do receptor e a resposta a cada concentração de agonista como a resposta medida menos a resposta basal em células não transfectadas com o receptor, conforme mostrado aqui, respostas a vários agonistas calculadas dessa maneira para uma via de sinalização que exibe atividade constitutiva muito baixa para análise preliminar.

Primeiro, insira os dados no Prism conforme descrito para atividade não constitutiva. Aceite. Também insira a resposta causada pela atividade constitutiva do receptor nas colunas apropriadas com letras, na linha correspondente a uma concentração logarítmica de agonista de menos 20. Aqui, um logaritmo negativo elevado é inserido para aproximar uma concentração de agonista igual a zero.

Analise os dados como anteriormente, exceto que, para atividade constitutiva, o parâmetro inferior deve ser restrito de modo que seja compartilhado por todos os conjuntos de dados. Registre o parâmetro compartilhado, bem como os parâmetros superior e log EC para cada agonista. Após determinar a constante de afinidade log do agonista padrão em experimentos separados, calcule a estimativa inicial do valor log K observado de cada agonista parcial em teste como o logaritmo da expressão composta pela diferença entre o valor emax do agonista padrão e do agonista em teste dividida pelo produto do EC 50 e pela diferença entre o valor eemax do agonista padrão e a resposta constitutiva.

Calcule a estimativa inicial de log KB para cada agonista e a estimativa inicial de log T cis para estimar os valores de KB do agonista. Insira os dados no Prism e, em seguida, insira uma equação definida pelo usuário. Digite log KB no Prism em várias linhas, conforme demonstrado aqui para a condição de dois agonistas.

Em seguida, insira as estimativas iniciais dos parâmetros inserindo a afinidade de cada agonista. O log T sis estima o M sis, a estimativa de M sis recebe o valor EMAX do agonista padrão e M recebe o valor um. Por fim, insira as estimativas iniciais de log kb.

Aplique restrições aos parâmetros restringindo o log K um ao seu valor previamente determinado e definindo log T sis, m sis e M como um valor compartilhado para todos os conjuntos de dados. Inicie a análise de regressão não linear. Os resultados fornecem o log KB do agonista padrão, o log K observado e os valores de log KB dos agonistas parciais.

A resposta máxima do sistema, o valor log T cys para o complexo do receptor livre e o fator de inclinação do transdutor no modelo operacional mostrado aqui é a hidrólise de fosfoinositídeos induzida por agonistas muscarínicos em células de ovário de hamster chinês, que expressam estavelmente o receptor muscarínico M três. As curvas de concentração-resposta de agonistas muscarínicos selecionados foram medidas neste ensaio, e os dados foram analisados conforme descrito aqui para estimar o valor KB de cada agonista expresso em relação ao de Oxo Tremaine M. As curvas teóricas representam o ajuste de mínimos quadrados da equação de regressão aos dados. As estimativas de log RAI são mostradas para kabale, a recline, pilocarpina e McNeil.

3, 4 3. As estimativas correspondentes da resposta máxima do sistema e do fator de inclinação do transdutor foram determinadas. Os valores de log K observados dos agonistas também foram obtidos para cada agonista mostrado.

Aqui estão os resultados de experimentos sobre a hidrólise de fosfoinositídeos estimulada por agonistas muscarínicos em células HC 2 93. A expressão estável de G alfa 15 e a expressão transitória do receptor muscarínico M três causaram um aumento na hidrólise basal de fosfoinositídeos, o qual foi atribuído à atividade constitutiva do receptor. Os dados foram analisados para estimar os valores log KB de Oxo Tremaine M e MacNeil, A 3 43.

As curvas teóricas representam o ajuste dos quadrados mínimos da equação de regressão aos dados. As estimativas de log KB são apresentadas para Oxo Tremoring M e McNeil, A 3 43. A estimativa do valor K observado de McNeil A 3 43 também foi determinada.

Uma vez dominada, essa técnica de análise de dados pode ser realizada em poucos minutos, se feita corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estimar tanto os valores KB relativos quanto os reais a partir das curvas concentração-resposta de agonistas para provocar uma resposta na via de sinalização downstream de um receptor acoplado à proteína G.