Name: Previsão do HIV-1 de uso co-receptor (tropismo) por análise de seqüência usando uma abordagem genotípica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprenda a prever o uso de co-receptor do HIV-1 por análise de sequência da região V3 do gene env. Este método genotípico auxilia na escolha de terapia antirretroviral personalizada.

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Os autores são financiados pelo Corus, entrada de célula MedSys, CADEIA e projetos de Resina.

O protocolo está resumida na fig. 4. 1. Coleta de amostras de sangue <ol><li> Recolher, pelo menos, 3 ml de sangue em tubos de EDTA no local da clínica. </li><li> As amostras podem ser armazenadas até uma semana a 4 ° C. </li><li> Encaminhar as amostras de sangue EDTA-o mais rapidamente possível para o laboratório por correio normal. </li></ol> 2. O isolamento de RNA do HIV e / ou DNA <ol><li> Obter o RNA viral e / ou de ADN a partir de 1000 uL de sangue total, soro ou plasma, utilizando-se o isolamento do ácido Magna Pure Compact Nucleic I kit I e do Sistema Pure Magna Compacto. </li><li> Eluir o RNA ou DNA obtido em 50 ul de tampão TE. Alternativamente, outros processos de ácidos nucleicos de purificação podem ser usados. </li></ol> 3. A amplificação da região env Amplificação da região env (Figs. 2 e 4) a partir de plasma ou de ARN ou ADN proviral. Um produto de 1245 pb de comprimento, que compreende a maior parte da proteína Env (nt 6556-7811 according de HXB2) é gerado. <ol><li> As amostras de RNA: RT-PCR da reacção <ol><li> RNA viral apresenta uma estrutura muito complexa secundária (Fig. 4) que podem impedir a reacção de RT. Para evitar este problema, incubar 10 ul de RNA a 65 ° C durante 10 minutos (já no tubo de PCR e na máquina de PCR) e em seguida reduzir a temperatura a 50 ° C. </li><li> Adicionar 40 ul da PCR Master Mix incluindo os iniciadores Env-F e Env-R. Mix Master para RT-PCR In-House System: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> volume / reacção (ul) </td><td> concentração final </td></tr><tr><td> RNase H 2 O </td><td> 14,4 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão de 5x (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 5x solução de Q- </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> dNTP Mix (10 mM cada) </td> &lt;td&gt; 2 <td> 400 uM de cada dNTP </td></tr><tr><td> Enzym-Mix (Qiagen OneStep RT-PCR Kit) </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Primer Env-F (100 uM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 uM </td></tr><tr><td> Primer Env-R (100 uM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 uM </td></tr><tr><td> Inibidor de RNase (RNasin) </td><td> 1 </td><td> 5 unidades / reação </td></tr></tbody></table> Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586 de acordo com HXB2) Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811) </li><li> Executar a reacção de RT a 50 ° C durante 30 minutos. </li><li> Executar a primeira PCR como se segue: <table border="1"><tbody><tr><td> 95 ° C, 15 min </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 seg 50 ° C, 30 seg 72 ° C, 2 min </td> 1 x </tr><tr><td> 95 ° C, 30 seg 56 ° C, 30 seg 72 ° C, 2 min </td><td> 38 x </td></tr><tr><td> 72 ° C, 10 min 4 ° C ∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li></ol></li><li> As amostras de DNA: reacção de PCR Para as amostras de ADN proviral, nenhuma reacção de RT inicial é necessária, e a reacção de PCR pode iniciar directamente. <ol><li> Adicionar 40 ul de PCR Master Mix para 10 ul de DNA provial. Mix Master para PCR In-House System: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> volume / reacção (ul) </td><td> concentração final </td></tr><tr><td> RNase H 2 O </td><td> 15,4 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão de 5x (HotStarTaq ADN Polimerase) </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 5x solução de Q- </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> dNTP Mix (10 mM cada) </td><td> 2 </td><td> 400 uM de cada dNTP </td></tr><tr><td> Enzym-Mix (HotStarTaq ADN Polimerase) </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Primer Env-F (100 uM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 uM </td></tr><tr><td> Primer Env-R (100 uM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 uM </td></tr></tbody></table> Env-F: 5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3 '(nt 6556 → 6586) Env-R: 5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3 '(nt 7785 ← 7811) </li><li> Executar as condições de PCR como descrito anteriormente para as amostras de ARN (Passo 3.1.4). </li></ol></li></ol> 4. A amplificação da região V3: PCR aninhada <ol><li> Para a PCR aninhada, usar 5 ul a partir da primeira reacção de PCR (sem análise anterior, em gel de agarose) como modelo e adicionar 95 ul de PCR MasMisture ter. Mix Master de Nested-PCR In-House <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> volume / reacção (ul) </td><td> concentração final </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 61,9 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão de PCR 10x </td><td> 10 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 5x solução de Q- </td><td> 20 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> dNTP Mix (10 mM cada) </td><td> 2 </td><td> 200 uM de cada dNTP </td></tr><tr><td> Primer Env-2F (100 uM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 uM </td></tr><tr><td> Primer Env-2R (100 uM) </td><td> 0,3 </td><td> 0,6 uM </td></tr><tr><td> HotStarTaq ADN Polimerase </td><td> 0,5 </td><td> 2,5 unidades / reacção </td></tr></tbody></table> Env-2F: 5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3 '(nt 6838 → 6864) <li> Executar a PCR como se segue: <table border="0"><tbody><tr><td> 93 ° C, 15 min </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 seg 50 ° C, 30 seg 72 ° C, 90 seg </td><td> 1 x </td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 seg 56 ° C, 30 seg 72 ° C, 90 seg </td><td> 43 x </td></tr><tr><td> 72 ° C, 10 min 4 ° C ∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li><li> Analisar o produto de PCR num gel de agarose a 1% (Fig. 4). O produto esperado é 902 bp de comprimento. </li><li> A purificação das amostras de sequenciação. <ol><li> Purifica-se o produto de PCR com o kit Qiagen PCR Purification, utilizando-se o protocolo, soluções e micro-colunas fornecidas pelo fornecedor. Eluir em 30-100 ul de tampão PE, dependendo da intensidade da banda. </li><li> Alternativamente, as amostras podem ser purificados utilizando ExonucleaseI e Fast AP (Thermo fosfatase alcalina). Para este fim, adicionar 6 Mix Exo-AP a 15 uL do produto de PCR e incubar 15 minutos a 37 ° C. <table border="1"><tbody><tr><td> 580 ul de H2O </td></tr><tr><td> 66 ul AP rápido </td></tr><tr><td> 13,4 Exo ul eu </td></tr></tbody></table></li></ol></li></li></ol> 5. Reação seqüência do amplicon V3 <ol><li> A reacção consiste em uma sequência de reacção de PCR, utilizando um dos seguintes iniciadores: Env-2: 5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959 → 6980) Env-5: 5 '-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3' (nt 7352 ← 7371) Env-6: 5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3 '(nt 6979 → 7000) Env-7: 5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3 '(nt 7530 ← 7549) Env-10: 5 '- GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (nt 7478 ← 7507) Env-11: 5 '- TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (nt 7638 ← 7664) Iniciadores de primeira escolha são: Env-2, 6 ou Env-Env-7, Env-11 </li><li> Use 1 ul do fragmento amplificado V3 purificado como modelo e adicionar 9 ul de PCR mestre de mistura. Sequenciamento Mix Master: <table border="1"><tbody><tr><td> 4 ul mistura de sequência (HIV-Genotipagem Kit) </td></tr><tr><td> 4 ul de H2O </td></tr><tr><td> Um Primer ul (100 pmol / pL) </td></tr></tbody></table></li><li> Executar a sequência de reacção como se segue: <table border="0"><tbody><tr><td> 96 ° C, 10 seg </td><td></td></tr><tr><td> 50 ° C, 10 seg </td><td> 36 x </td></tr><tr><td> 60 ° C, 45 seg </td><td></td></tr><tr><td> 4 ° C ∞ </td><td></td></tr></tbody></table></li></ol> 6. A purificação das amostras de sequenciação Purificar seqüências using Sephadex G-50 superfina. <ol><li> Encher o número adequado de poços no "carregador coluna" com Sephadex G-50 superfina. Transfira o Sephadex ao MAHVN4510 placa de filtro virando. </li><li> Adicionar 300 ul de água Milli-Q H 2 O a cada poço na placa de filtro, e incubar-lo durante pelo menos 3 horas a 2-8 ° C. </li><li> Centrifugar as placas durante 5 min a 910Xg e 4-15 ° C. Descartar o fluxo através. </li><li> Adicionar 10 ul de H 2 O para o produto de sequência e, em seguida, a sequência da pipeta na placa de Sephadex incharam. </li><li> Para obter o produto purificado, centrifugar a placa durante 5 min. em 910Xg e 4-15 ° C e recolher o fluxo através. </li></ol> 7. A sequenciação das amostras purificadas no sequenciador ABI Prism 3130 XL <ol><li> Antes de cada corrida, mudar o tampão e verificar o volume do polímero (POP7). Se necessário, substituir o polímero frasco velho por um novo. </li><li> Use as condições de execução salvas, incluindo um tempo de injeção de 18 segundos. </li><li> Nesta máquina, a recolha de dados de sinal de uma experiência com 16 amostras de sequências leva cerca de 60 minutos (36 cm capilar) ou 150 minutos (50 cm capilar). </li></ol> 8. Edição seqüência <ol><li> Usar o programa Lasergene (DNA-Star) para alinhar e editar as sequências (Fig. 5). Outros programas de edição de sequências pode ser utilizado. Utilizar um "B-V3 Consenso" e a sequência de consenso env como referências. </li><li> Lasergene cria uma sequência de consenso da amostra analisada utilizando todos os dados em bruto disponíveis, e armazená-lo como um ficheiro FASTA. O ficheiro FASTA é um ficheiro de texto que inclui um cabeçalho com o nome da amostra e da sequência de nucleótidos. </li></ol> 9. Sequenciamento interpretação de dados e previsão tropismo <ol><li> Sequenciação de interpretação dos dados é realizada pelo sistema de interpretação com base na web geno2pheno [coreceptor] ( <a href="http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php">http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/</a>index.php). Para a predição tropismo, configurações de FPR diferentes podem ser seleccionados. A configuração padrão é de acordo com as diretrizes germano-austríaca de terapia. Para FPR ≥ 20%, o vírus é classificado como R5 quando FPR ≥ 20% e X4 para FPR &lt;12,5%. </li><li> Carregar o arquivo FASTA no servidor. Este servidor traduz a sequência de nucleótidos em aminoácidos, alinha-o com a sequência de consenso V3-B e produz uma classificação de subtipo. Além disso, ele gera uma previsão da utilização co-receptor (Fig. 4), expresso como a taxa de falso positivo (FPR). </li></ol> 10. Resultados representativos O geno2pheno [coreceptor] saída mostra uma interpretação graduada do tropismo. Dependendo da probabilidade de o uso co-receptor, a interpretação de texto e a cor do fundo que varia do verde (&lt;20% FPR), sugerindo uma administração segura de MVC, a amarela, sugerindo um risco, baixa possível e, finalmente, para o vermelho. Vermelho é a cor sugeremção não prescrever MVC. Além disso, o servidor gera um relatório pdf que pode ser impresso, preenchido com o paciente e os dados de amostra, e enviada para o médico. Exemplos de saída geno2pheno [coreceptor] estão representados na Fig. 6. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura. 1. Replicação esquemática de HIV. O virião deve ligar-se às células CD4 como receptor celular e tanto ao CCR5 ou CXCR4 como co-receptor. O co-receptor CCR5 pode ser bloqueado com os antagonistas do CCR5 como Maraviroc (MVC, Celsentri, Selzentry). Após a fusão das membranas viral e celular, o nucleocapsídeo viral é libertado no citoplasma. A nucleocápside desmonta e do complexo de RNA viral é libertado para dentro do citoplasma. A transcriptase reversa virai (RT) transcreve o ARN genómico em ADN proviral, que é, então, transportado para o núcleo e integrado no genoma do hospedeiro pela integrase HIV. Cellular RNA polimerases transcribe genoma viral e RNA mensageiro a partir do genoma proviral. As proteínas virais são produzidas no citoplasma e transportada para a superfície celular. O vírus bud partículas como imaturas, não infecciosas viriões a partir das células. A protease de HIV cliva as proteínas produtoras de partículas infecciosas. A inibição de um dos passos leva a uma interrupção do ciclo de replicação. As drogas anti-retrovirais e o passo que eles inibem a replicação são marcados a vermelho. O RNA viral e DNA proviral (material utilizado para a análise tropismo ou resistência) estão marcados a verde. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> A Figura 2. HIV genoma proviral. A partícula de HIV é construído com diferentes proteínas estruturais e enzimas diversas casas e proteínas, tanto de origem viral e celular. O show figuraé a localização dos genes dentro do genoma viral. A superfície de proteínas gp120 e gp41 constituem pontas sobre a superfície do virião e contactar a célula humana para realizar a fusão da membrana. Na parte inferior da figura, os produtos de amplificação por PCR e os iniciadores utilizados no nosso protocolo são mostrados. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Proporção de pacientes com carga viral baixa (VL) medidas analisadas para resistência a drogas ou determinação do tropismo no Instituto de Virologia da Universidade de Colônia (Alemanha). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Esquema geral do experimento .. Por favor <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3264/3264fig4_lg.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Sequência de edição com Lasergene. O amplicon V3 é sequenciado com, pelo menos, um para a frente e um iniciador inverso. Lasergene alignes os "ABI". Arquivos obtidos no seqüenciador com a referência de seqüências "Consenso V3-B" e env. Lasergene cria uma seqüência consenso com todos os dados da linha disponíveis. As sequências de referência podem ser marcados (e, em seguida, são apresentados a cinzento), de modo que não contribuem para a sequência de consenso da amostra. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3264/3264fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Tropismo relatórios de previsão gerados pelo geno2pheno [co-receptor] relatórios tool.The são gerados como arquivos PDF que podem ser salvos e preenchidos no computador. Dados adicionais nome do paciente nos tal, a data de extração de sangue, etc, podem ser incluídos manualmente usando um programa de escritor pdf. Comentários específicos também podem ser adicionados. Tsdados electrónicos são exclusivamente no computador do utilizador, e não sobre a [coreceptor] geno2pheno servidor. Por favor <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3264/3264fig6_lg.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão maior desta figura.

<ol><li>Heger, E., Schuelter, E., Klimkait, T., Lengauer, T., Kaiser, R., Walter, H., Sierra, S. European coreceptor proficiency panel test. 9th European Workshop on HIV & Hepatitis Treatment Strategies & Antiviral Drug Resistance, Paphos, Cyprus, , (2011).</li>
<li>Lengauer, T., Sander, O., Sierra, S., Thielen, T., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+prediction+of+HIV+coreceptor+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotech%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic prediction of HIV coreceptor usage.</a> Nature Biotech. 25 (12), 1407-1410 (2007).</li>
<li>McGovern, R., Dong, W., Zhong, X., Knapp, D., Thielen, A., Chapman, D., Lewis, M., James, I., Valdez, H., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population-based+Sequencing+of+the+V3-loop+Is+Comparable+to+the+Enhanced+Sensitivity+Trofile+Assay+in+Predicting+Virologic+Response+to+Maraviroc+of+Treatment-na+ve+Patients+in+the+MERIT+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Population-based Sequencing of the V3-loop Is Comparable to the Enhanced Sensitivity Trofile Assay in Predicting Virologic Response to Maraviroc of Treatment-na ve Patients in the MERIT Trial.</a> 17th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).</li>
<li>Reuter, S., Braken, P., Jensen, B., Sierra-Aragon, S., Oette, M., Balduin, M., Kaiser, R., Haussinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+in+treatment-experienced+patients+with+HIV-1+infection+-+experience+from+routine+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Maraviroc in treatment-experienced patients with HIV-1 infection - experience from routine clinical practice.</a> Eur. J. Med. Res. 15 (6), 231-237 (2010).</li>
<li>Recordon-Pinson, P., Soulie, C., Flandre, P., Descamps, D., Lazrek, M., Charpentier, C., Montes, B., Trabaud, M. A., Cottalorda, J., Schneider, V., Morand-Joubert, L., Tamalet, C., Desbois, D., Mace, M., Ferre, V., Vabret, A., Ruffault, A., Pallier, C., Raymond, S., Izopet, J., Reynes, J., Marcelin, A. G., Masquelier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+genotypic+prediction+of+HIV-1+coreceptor+use+versus+a+phenotypic+assay+and+correlation+with+the+virological+response+to+maraviroc%3A+the+ANRS+GenoTropism+study%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the genotypic prediction of HIV-1 coreceptor use versus a phenotypic assay and correlation with the virological response to maraviroc: the ANRS GenoTropism study.</a> Antimicrob. Agents. Chemother. 54 (8), 3335-3340 (2010).</li>
<li>Swenson, L. C., Knapp, D., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+and+accuracy+of+the+geno2pheno+co-receptor+algorithm+for+predicting+HIV+tropism+for+single+and+triplicate+measurements+of+V3+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Calibration and accuracy of the geno2pheno co-receptor algorithm for predicting HIV tropism for single and triplicate measurements of V3 genotype.</a> 10th International Congress on Drug Therapy in HIV Infection, Glasgow, UK, , (2010).</li>
<li>Macartney, M. J., Cameron, J., Strang, A., García, A., Booth, C., Marshall, N., Johnson, M., Geretti, A. M. Use of a genotypic assay for the prediction of HIV-1 coreceptor tropism and guiding the use of CCR5 antagonists in clinical practice. 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).</li>
<li>Sierra, S., Thielen, A., Reuter, S., Jensen, B., Esser, S., Fätkenheuer, G., Lengauer, T., Pfister, H., Sichtig, N., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+determination+and+clinical+outcome+of+61+patients+under+MVC+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Tropism determination and clinical outcome of 61 patients under MVC treatment.</a> 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).</li>
<li>Obermeier, M., Carganico, A., Bieniek, B., Schleehauf, D., Dupke, S., Fischer, K., Freiwald, M., Neifer, S., Schuler, C., Mayr, C., Klausen, G., Köppe, S., üünsche, T., Berg, T., Baumgarten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropism+testing+from+proviral+DNA+-+analysis+of+a+subgroup+from+the+Berlin+Maraviroc+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Tropism testing from proviral DNA - analysis of a subgroup from the Berlin Maraviroc cohort.</a> 8th European HIV Drug Resistance Workshop, Sorrento, Italy, , (2010).</li>
<li>Vandekerckhove, L. P., Wensing, A. M., Kaiser, R., Brun-Vezinet, F., Clotet, B., De Luca, A., Dressler, S., Garcia, F., Geretti, A. M., Klimkait, T., Korn, K., Masquelier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+guidelines+on+the+clinical+management+of+HIV-1+tropism+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">European guidelines on the clinical management of HIV-1 tropism testing.</a> Lancet Infect Dis. 11 (5), 394-407 (2011).</li>
<li>Walter, H., Eberle, J., Möller, H., Noah, C., Wolf, E., St rmer, M., Braun, P., Krn, K., D umer, M., Berg, T., Obermeier, M., Thielen, A., Kaiser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Empfehlung+zur+Bestimmung+des+HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs+%28DAIG+Recommendations+for+the+HIV-1+tropism+testing%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Empfehlung zur Bestimmung des HIV-1-Korezeptor-Gebrauchs (DAIG Recommendations for the HIV-1 tropism testing).</a> , (2011).</li>
<li>Obermeier, M. J., Carganico, A., Dupke, S., Schranz, D., Cordes, C., Freiwald, M., Klausen, G., Köppe, S., Schuler, C., Mayr, C., Schleehauf, D., Berg, T., Krznaric, I., Baumgarten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+application+of+genotypic+co-receptor+tropism+testing+from+viral+RNA+and+proviral+DNA%3A+week+24+analysis+of+the+Berlin+maraviroc+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+International+AIDS+Society%22%5BJournal%5D)">Clinical application of genotypic co-receptor tropism testing from viral RNA and proviral DNA: week 24 analysis of the Berlin maraviroc cohort.</a> Journal of the International AIDS Society. 13, Suppl . 4. 129-129 (2010).</li>
<li>Toma, J., Frantzell, A., Hoh, R., Martin, J., Deeks, S., Petropoulos, C., Huang, W. Determining HIV-1 Co-receptor Tropism Using PBMC Proviral DNA Derived from Aviremic Blood Samples. 18th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, San Francisco, USA, , (2010).</li>
</ol>

Este artigo de vídeo é patrocinado pela ViiV Healthcare e GlaxoSmithKline.

A sequência V3 permite uma previsão fiável do tropismo viral, como demonstrado em estudos clínicos 3-9. Na verdade, a determinação genotípica é contemplada nas diretrizes atuais europeus e germano-austríaca 10. Em comparação com testes fenotípicos, não só é o mais curto tempo de giro (equivalente ao teste de resistência), mas também os custos. Além disso, uma grande vantagem do teste de genotipagem é que os resultados são classificados como FPR e, portanto, pode ser adaptado às necessidades do paciente. Trofile resultados, por outro lado, são simplesmente relatórios R5 ou X4, e o acesso aos dados em bruto não é dada. Atualmente, as orientações europeias sugerem um FPR de corte de 20 a 10%, enquanto as diretrizes austríaco-alemãs permitem adaptar o FPR de corte especificamente para as necessidades de cada paciente 11. Nesta linha, para pacientes com uma ampla gama de opções de medicamentos anti-retrovirais, maior FPR cut-offs (&gt; 20%) são Recomterminou. Por outro lado, para pesadamente pré-tratados pacientes com poucas opções terapêuticas, inferior FPR pontos de corte (&gt; 5%) pode ser usado. Este tipo de terapia é a orientação actualmente em curso, o teste de resistência de NRTIs, NNRTIs, PIs e inis, onde a droga parcialmente activos podem ser incluídos no tratamento de pacientes com reduzidas opções terapêuticas. Além disso, com um número crescente de mudanças terapia genotipicamente-guiadas, o clinicamente relevante FPR cut-offs estão constantemente a ser ajustado por um painel de bioinformáticos, virologistas e clínicos. Outra importante vantagem do teste de tropismo genotípica é a possibilidade de analisar amostras clínicas com muito baixa ou mesmo não detectável de carga viral (VL). Nestes casos, quando o plasma RNA não é amplif icável, o ADN proviral pode ser sequenciado e usado para previsões confiáveis ​​9,12. Digno de nota, o número de pacientes com baixos ou indetectáveis ​​de carga viral aumentou acentuadamente nos últimos anos. Até à data, o TERFIL ensaio só permite a análise de amostras de pacientes com VL &lt;1000 cópias / ml. No entanto, estudos preliminares mostraram que o ADN proviral pode ser também adecuate a ser testado por Trofile 13.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Magna Pure Isolation Kit Compacto de Ácido Nucleico I </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 04 802 993 001 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema Pure Magna Compact </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 03731146001 </td><td></td></tr><tr><td> T3000 Termociclador </td><td> Biometra </td><td> 050-723 </td><td></td></tr><tr><td> One Step RT-PCR Kit </td><td> Qiagen </td><td> 210215 </td><td></td></tr><tr><td> HotStarTaq Mix Master Kit </td><td> Qiagen </td><td> 203445 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28106 </td><td></td></tr><tr><td> Exonuclease I (Exo I) </td><td> Fermentas </td><td> EN0582 </td><td></td></tr><tr><td> Fastap Fosfatase Alcalina termossensível </td><td> Fermentas </td><td> EF0651 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4337457 </td><td></td></tr><tr><td> Sephadex G-50 Superfine </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0041-01 </td><td></td></tr><tr><td> Seqüenciador ABI Prism 3130 XL capilar </td><td> Applied Biosystems </td><td> 3130XL </td><td></td></tr></tbody></table>

previsão do hiv-1 de uso co-receptor (tropismo) por análise de seqüência usando uma abordagem genotípica

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) é o fármaco anti-retroviral licenciada primeiro da classe dos antagonistas do co-receptor. Ele liga-se ao hospedeiro co-receptor CCR5, que é utilizado pela maioria das estirpes de HIV para infectar células humanas imunes (Fig. 1). Outros isolados de HIV usar um co-receptor diferente, o CXCR4. Receptor que é utilizado, é determinada no vírus pela proteína Env (Fig. 2). Dependendo do co-receptor utilizado, os vírus são classificados como R5 ou X4, respectivamente. MVC se liga ao receptor CCR5 inibir a entrada de vírus R5 na célula-alvo. Durante o curso da doença, os vírus X4 pode emergir e superar os vírus R5. Determinação do co-receptor usage (também chamado tropismo) é, portanto, obrigatório, antes da administração de MVC, como exigido pela FDA e EMA. Os estudos para MVC eficiência MOTIVATE, mérito e 1029 foram realizados com o ensaio Trofile de monograma, San Francisco, EUA Este é um ensaio de alta qualidade baseado sophisticated testes recombinantes. A aceitação para este teste para a rotina diária é bastante baixo fora dos EUA, já que os médicos europeus e não tendem a trabalhar com laboratórios especializados descentralizadas, que também oferecem testes de resistência concomitante. Esses laboratórios foram submetidos a avaliações de qualidade de garantia de vários, o último a ser apresentado em 2011 1. Há vários anos, temos realizado determinações tropismo com base em análise da seqüência da região HIV gene env-V3 (V3) 2. Esta região contém informação suficiente para executar uma previsão fiável. A determinação genotípica de uso co-receptor apresenta vantagens como: menor tempo de volume de negócios (equivalente ao teste de resistência), custos mais baixos, possibilidade de adaptar os resultados para as necessidades dos pacientes e possibilidade de analisar amostras clínicas com muito baixo ou mesmo indetectáveis ​​de carga viral (CV ), particularmente desde que o número de amostras analisadas com VL &lt;1000 cópias / mLaproximadamente aumentou nos últimos anos (Fig. 3). Os passos principais para os testes de tropismo (Fig. 4) demonstrado neste vídeo: 1. Coleta de uma amostra de sangue 2. O isolamento do RNA do HIV no plasma e / ou de ADN proviral de VIH a partir de células mononucleares de sangue 3. A amplificação da região env 4. A amplificação da região V3 5. Reação seqüência do amplicon V3 6. A purificação das amostras de sequenciação 7. A sequenciação das amostras purificadas 8. Edição seqüência 9. Sequenciamento interpretação de dados e previsão tropismo

A predição do uso de co-receptor de HIV-1 é necessário para a administração de uma nova classe de fármacos anti-retrovirais co-receptor, ou seja, os antagonistas. Ela pode ser realizada por análise da sequência do<em&gt; Env</em&gt; Gene e posterior interpretação através de um sistema de interpretação baseado na Internet (geno2pheno<sub&gt; [Coreceptor]</sub&gt;).

Previsão do HIV-1 de uso co-receptor (tropismo) por análise de seqüência usando uma abordagem genotípica

O Maraviroc (MVC) é o primeiro fármaco antirretroviral licenciado da classe dos antagonistas de correceptores. Ele liga-se ao correceptor do hospedeiro CCR5, que é utilizado por...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A região da coroa de seqüências diferentes V3 loop do envelope glicoproteína de superfície (gp120) do HIV-1 pode ser caracterizada estruturalmente em muitos casos por in silico dobrar de posições 10-22 do loop usando um...

Avaliação da dinâmica imunologicamente relevantes Terciário características estruturais do HIV 1-V3 loop Sequence R2 Crown por Ab initio Folding

Tropismo do HIV pode ser inferida a partir da região V3 do envelope viral. V3 é PCR amplificados em triplicata utilizando nested RT-PCR, sequenciado, e interpretados usando software de bioinformática. Amostras com a seqüência de um ou mais (s) com pontuações baixas são G2P classificados como não-R5 vírus.

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Quantificar os níveis de HIV-1 RNA no plasma e seqüenciamento única HIV-1 genomas de indivíduos com carga viral abaixo do limite de detecção (50-75 cópias / ml) é difícil. Aqui nós descrevemos como extrair e quantificar RNA viral no plasma usando um ensaio de PCR em tempo real, que de forma confiável medidas HIV-1 RNA até 0,3 cópias / ml e como amplificar genomas virais por seqüenciamento do genoma único, a partir de amostras com cargas virais muito baixas.

Amplificar e Quantificação do HIV-1 RNA no indivíduos infectados pelo HIV com carga viral abaixo do limite de detecção pela Standard Ensaios Clínicos

Técnicas para dissecar os mecanismos subjacentes a secreção de HIV-1 Nef em exosomes são descritos. Pequenos peptídeos específicos derivados da proteína Nef e transfecção foram explorados para determinar a estrutura, função e parceiros de ligação da secreção Modificação Região de Nef. Estes procedimentos têm relevância geral em muitos estudos mecanicistas.

Identificação baseada em peptídeo de motivos funcionais e seus parceiros de ligação

Testes de resistência aos medicamentos para o HIV-1 indivíduos infectados não responderam à terapia anti-retroviral (ART) pode orientar futuras terapias e melhorar os resultados do tratamento. Otimizando individual e populacional resultados de saúde em alta prevalência de HIV, mas contextos de recursos limitados, em última análise exigem genotipagem resistência aos medicamentos disponíveis e acessíveis e métodos de interpretação.

Um método de monitoramento acessível HIV-1 Resistência às Drogas para recursos configurações limitadas

A patogênese do HIV-1 é definida tanto pelas características virais quanto pelos fatores genéticos do hospedeiro. Aqui descrevemos um método robusto que permite medições reprodutíveis para avaliar o impacto da variação da sequência do gene gag na capacidade de replicação in vitro do vírus.

A Enzima de Restrição método baseado Clonagem para avaliar a<em&gt; In vitro</em&gt; Replicação Capacidade de HIV-1 do subtipo C gag-MJ4 quiméricos Vírus

A competição de crescimento entre vírus quase isogênicos fornece uma medida sensível para determinar a aptidão relativa da replicação. Os protocolos descritos aqui incluem a construção de clones recombinantes do HIV-1, propagação do vírus e competição de crescimento e métodos de análise otimizados para produzir resultados sensíveis e consistentes.

Crescimento Pairwise competição ensaio para determinar a replicação de Fitness de Imunodeficiência vírus humanos

Descrevemos um protocolo para amplificar locais de integração retroviral a partir do DNA genômico de células infectadas, sequenciando as junções amplificadas vírus-hospedeiro e, em seguida, mapeando essas sequências para um genoma de referência. Também descrevemos técnicas para quantificar a distribuição de locais de integração em relação a várias anotações genômicas usando BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Sequenciamento proviral individual completo (aletas) fornece um método eficiente e de alta produtividade para a amplificação e sequenciamento de single, perto de provírus completos de HIV-1 (intactos e com defeito) e permite a determinação do seu potencial replicação-competência. FLIPS supera as limitações dos ensaios anteriores projetados para sequenciar o reservatório latente do HIV-1.

Amplificação de perto completos provírus HIV-1 para a próxima geração de sequenciamento

Aqui nós apresentamos uma abordagem profunda de sequenciamento que fornece uma análise imparcial da nascente 3'-termini, bem como perfis mutacional de moléculas de DNA único-encalhado. A aplicação principal é a caracterização de DNAs complementares retrovirais nascentes (cDNAs), os intermediários gerados durante o processo de transcrição reversa retroviral.

Determinante 3'-Termini e sequências de moléculas de ADN Viral de Single-Stranded nascente durante o HIV-1 inverter transcrição em células infectadas

Grampos de cabelo rna e loops podem funcionar como primers para transcrição reversa (RT) na ausência de primers específicos da seqüência, interferindo com o estudo de transcrições antisense sobrepostas. Desenvolvemos uma técnica capaz de identificar rna específico da cadeia, e nós o usamos para estudar a proteína antisense HIV-1 ASP.

Transcrições de RNA do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) em pacientes por RT-PCR específico

Aprenda a prever o uso de co-receptor do HIV-1 por análise de sequência da região V3 do gene env. Este método genotípico auxilia na escolha de terapia antirretroviral personalizada.

Previsão do HIV-1 de uso co-receptor (tropismo) por análise de seqüência usando uma abordagem genotípica

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