Previsão do HIV-1 de uso co-receptor (tropismo) por análise de seqüência usando uma abordagem genotípica

O objetivo geral do experimento a seguir é prever a utilização do co-receptor pelo HIV-1 para a administração de uma nova classe de medicamentos antirretrovirais. Isso é alcançado pela isolamento dos ácidos nucleicos genômicos virais, RNA viral ou DNA proviral, a partir do sangue do paciente, após a amplificação da região do envelope. A região V3 viral, que é o principal determinante da tropismo, é amplificada por PCR aninhada.

Em seguida, o amplicon V3 é sequenciado com diferentes iniciadores para gerar um arquivo fasta. São obtidos resultados que mostram o tropismo viral e a suscetibilidade ao antagonista do coreceptor com base na taxa de falso positivo ou FPR, conforme obtido pela ferramenta online de interpretação geno to pheno coreceptor. Dependendo do uso do CORECEPTOR, os vírus HIV são classificados como R5 ou X4.

O miri rock liga-se ao receptor CCR5, inibindo a entrada de vírus R5 na célula-alvo. No decorrer da doença, vírus X4 podem emergir e superar os vírus R5. A determinação do uso de receptor, também chamada de tropismo, é portanto obrigatória antes da administração de maraviroc, conforme exigido pela EMA e pela FDA.

A principal vantagem desta técnica é que é possível realizar uma determinação paralela da resistência a outras classes de medicamentos antirretrovirais de forma muito simples. Este método permite uma medicina muito mais personalizada, já que os pontos de corte para os resultados de tropismo podem ser modificados de acordo com as necessidades do paciente. Tivemos pela primeira vez a ideia para este método no início dos anos noventa, quando desejávamos conhecer a base molecular da diferença no crescimento em cultura celular de cepas de HIV e da progressão da doença em pacientes, demonstrando que o procedimento será realizado por um técnico do nosso grupo antes do início deste protocolo.

As amostras são coletadas como sangue com EDTA no local clínico e enviadas ao laboratório para iniciar o isolamento de ácidos nucleicos do HIV a partir de 1000 microlitros de soro ou plasma sanguíneo total, utilizando o sistema mag pure compact e o kit de isolamento de ácidos nucleicos conforme as instruções do fabricante. O RNA ou DNA obtido é então eluído em 50 microlitros de tampão TE. O próximo passo é amplificar a região do envelope do ácido nucleico por PCR com transcrição reversa para RNA ou simplesmente PCR para DNA, conforme descrito no texto; a reação deve gerar um produto com 1.245 pares de bases de comprimento, compreendendo a maior parte da região da proteína do envelope. Para amplificar a região V3 da proteína do envelope, realiza-se PCR aninhada utilizando cinco microlitros da primeira reação de PCR como molde.

Prepare as reações utilizando a mistura mestra para PCR aninhada caseira conforme descrito no texto. Os parâmetros de execução da PCR aninhada também são descritos ali. Após a amplificação da região V três, analise o produto da PCR para verificar o produto esperado com 902 pares de bases de comprimento por eletroforese em gel antes do sequenciamento.

Limpe o produto da PCR conforme descrito no protocolo escrito. Após a purificação do produto da PCR, realize a reação de sequenciamento conforme descrito no texto, após a conclusão da reação. Purifique as amostras de sequenciamento utilizando Cidex G 50 superfino e uma placa de filtro multicanal com membrana Durapore, seguindo as instruções na parte escrita deste procedimento para sequenciar o produto purificado; prepare o sequenciador verificando o polímero e trocando o tampão.

Em seguida, carregue as amostras, defina as condições e inicie a corrida. Após a corrida de sequenciamento, o programa DNA STAR laser gene pode ser usado para alinhar e editar as sequências.

O amplicon V três é sequenciado com pelo menos um iniciador direto e um inverso. O Laser gene alinha os arquivos ABI obtidos do sequenciador com as sequências de referência. V três, consenso B e envelope Laser gene criam uma sequência consenso da amostra analisada utilizando todos os dados brutos disponíveis, mas não as referências, e a armazenam como um arquivo FASTA.

O arquivo FASTA é um arquivo de texto que inclui um cabeçalho com o nome da amostra e a sequência de nucleotídeos. Para iniciar a interpretação dos dados e a predição de tropismo, faça o upload do arquivo FASTA no sistema de interpretação baseado na web. O Geno Tono seleciona o valor de corte FPR até o qual o vírus é classificado como R5.

Ao utilizar as diretrizes alemãs, o vírus é classificado como R cinco. Quando a FPR é maior ou igual a 20%, e como X quatro, quando a FPR é menor que 12,5%, selecione quaisquer parâmetros clínicos adicionais disponíveis e, em seguida, selecione, alinhe e preveja. Este servidor traduz a sequência de nucleotídeos em aminoácidos, alinha-a com a sequência consenso V três B e produz uma classificação de subtipo. Além disso, gera uma previsão do uso de co-receptor expressa como FPR.

O resultado mostra uma interpretação gradativa dependendo da probabilidade de uso do co-receptor. Para valores altos de FPR, tem-se certeza de que o vírus não é X quatro, e para valores baixos de FPR, tem-se incerteza sobre o tipo de vírus, caso a interpretação, o texto e a cor de fundo sejam verdes. A administração segura de Ravi Rock é indicada, enquanto a cor amarela sugere um possível risco baixo ao usar Ravi Rock, e a cor vermelha indica que Ravi Rock não deve ser prescrito.

Além disso, o servidor gera um relatório em PDF que pode ser impresso e enviado ao médico. Dados adicionais, como o nome do paciente ou a data da coleta de sangue, podem ser incluídos manualmente utilizando um programa de edição de PDF. Na privacidade do computador do usuário, comentários específicos também podem ser adicionados.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar os cortes virais utilizando a ferramenta geno feno receptor. Ao tentar este procedimento, é importante realizar regularmente controles de qualidade. Não se esqueça de que trabalhar com HIV pode ser extremamente perigoso, portanto, devem ser tomadas precauções e utilizados sempre laboratórios biologicamente seguros e autorizados.