Previsão do HIV-1 de uso co-receptor (tropismo) por análise de seqüência usando uma abordagem genotípica

O objetivo geral do experimento a seguir é prever o uso do co-receptor do HIV para a administração de uma nova classe de medicamentos antirretrovirais. Isso é obtido isolando os ácidos nucléicos genômicos virais, RNA viral ou DNA proviral do sangue do paciente após a amplificação da região do envelope. A região viral V três, que é o principal determinante do tropismo, é amplificada por nested PCR.

Em seguida, o amplicon V três é sequenciado com diferentes primers para gerar um arquivo fasta. São obtidos resultados que mostram o tropismo viral e a suscetibilidade ao antagonista do co-receptor com base na taxa de falsos positivos ou FPR obtida pela ferramenta de interpretação online geno para feno-co-receptor. Dependendo do uso do CORECEPTOR, os vírus HIV são classificados como R cinco ou X quatro.

A rocha Miri se liga através do receptor CCR cinco, inibindo a entrada de vírus R cinco na célula-alvo. Durante o curso da doença, X quatro vírus podem emergir e superar os vírus R cinco. A interrupção do uso do receptor, também chamado de tropismo, é, portanto, obrigatória antes da administração de maraviroc, conforme exigido pela EMA e FDA.

A principal vantagem dessa técnica é que é possível fazer uma determinação paralela da resistência a outras classes de medicamentos antirretrovirais com muita facilidade. Este método permite uma medicina muito mais personalizada, pois os pontos de corte para os resultados do tropismo podem ser modificados de acordo com as necessidades do paciente. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez no início dos anos noventa, quando queríamos conhecer a base molecular do crescimento das diferentes culturas celulares de cepas de HIV e a progressão da doença em pacientes, demonstrando que o procedimento será dado por um técnico do nosso grupo Antes do início deste protocolo.

As amostras são coletadas como sangue EDTA no local clínico e enviadas ao laboratório para começar a isolar os ácidos nucleicos do HIV a partir de 1000 microlitros de soro ou plasma de sangue total usando o sistema compacto mag pure e o kit de isolamento de ácido nucleico de acordo com as instruções do fabricante. O RNA ou DNA ganho é então aludido em tampão TE de 50 microlitros. O próximo passo é amplificar a região do envelope do ácido nucléico por PCR de transcrição reversa para RNA ou simplesmente PCR para DNA, conforme descrito no texto, a reação deve gerar um produto de 1.245 pares de bases de comprimento compreendendo a maior parte da região da proteína do envelope para amplificar a região V três da proteína do envelope, siga com PCR aninhado usando cinco microlitros da primeira reação de PCR como modelo.

Preparar as reacções utilizando a mistura principal para a PCR interna aninhada, tal como descrito no texto. Os parâmetros de execução de PCR aninhados também são descritos lá. Após a amplificação da região V três, analise o produto de PCR para verificar o produto esperado em 902 pares de bases de comprimento por eletroforese em gel antes do sequenciamento.

Purifique o produto de PCR conforme descrito no protocolo escrito. Uma vez que o produto da PCR tenha sido purificado, execute a reação de sequenciamento conforme descrito no texto após a conclusão da reação. Purifique as amostras de sequenciamento usando cidex G 50 superfino e uma placa de filtro multitela com membrana durapore seguindo as instruções na parte escrita deste procedimento para sequenciar o produto purificado, prepare o sequenciador verificando o polímero e trocando o tampão.

Em seguida, carregue as amostras, defina as condições e inicie a execução. Após a execução do sequenciamento. O programa de genes a laser DNA STAR pode ser usado para alinhar e editar as sequências.

O amplicon V três é sequenciado com pelo menos um primer direto e um reverso. O gene do laser alinha os arquivos ABI obtidos do sequenciador com as sequências de referência. V três, consenso B e gene de laser de envelope cria uma sequência de consenso da amostra analisada usando todos os dados brutos disponíveis, mas não as referências e a armazena como um arquivo FASTA.

O arquivo FASTA é um arquivo de texto que inclui um cabeçalho com o nome da amostra e a sequência de nucleotídeos. Para iniciar a interpretação dos dados e a previsão do tropismo, carregue o arquivo FASTA no sistema de interpretação baseado na web. Geno Tono co-receptor selecione o ponto de corte FPR até o qual o vírus é classificado como R cinco.

Usando as diretrizes alemãs, o vírus é classificado como R cinco. Quando o FPR é maior ou igual a 20% e como X quatro, quando o FPR é menor que 12,5%, selecione quaisquer parâmetros clínicos adicionais, se disponíveis, e então selecione, alinhe e preveja Este servidor traduz a sequência de nucleotídeos em aminoácidos, alinha-a com a sequência B de consenso V três e produz uma classificação de subtipo. Além disso, gera uma previsão do uso do co-receptor expresso como FPR.

A saída mostra uma interpretação gradual, dependendo da probabilidade de uso do co-receptor. Para valores FPR altos, é certo que o vírus não é X quatro e para FPR baixo não se tem certeza de como o vírus se parece se a interpretação, o texto e a cor de fundo forem verdes. A administração segura para Ravi Rock é indicada, enquanto o amarelo sugere um possível baixo risco para o uso de Ravi Rock, e o vermelho indica que o Ravi Rock não deve ser prescrito.

Além disso, o servidor gera um relatório em PDF que pode ser impresso e enviado ao médico. Dados adicionais, como nome do paciente ou data da extração de sangue, podem ser incluídos manualmente usando um programa de gravação de PDF. Na privacidade do computador do usuário, comentários específicos também podem ser adicionados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar as costeletas virais usando a ferramenta geno pheno receptor Ao tentar este procedimento, é importante realizar regularmente controles de qualidade. Não se esqueça de que trabalhar com HIV pode ser extremamente perigoso, portanto, precauções e laboratórios biológicos seguros autorizados devem sempre ser usados.