Produção Parvovirus eficiente recombinante com a ajuda de Adenovirus sistemas derivados

O objetivo geral deste procedimento é produzir vírus parvo recombinantes, ou rec PVs, em altas titulações, preservando sua qualidade e reduzindo os tempos e custos de produção. Isso é alcançado inicialmente pela produção de um estoque viral rec PV através da transfeção de células HEK 293T com plasmídeos rec PV, juntamente com um vetor derivado do adenovírus tipo 5. Uma vez que a introdução de elementos genômicos do ad nos aumenta em mais de dez vezes a produção de rec PVs nas células HEK 293T.

Em comparação com os protocolos existentes, foi gerado um novo auxiliar AD VP que contém os elementos genômicos adenovirais necessários para aumentar a produção de parvovírus recombinante, bem como a unidade do gene VP do parvovírus. O próximo passo é produzir e purificar este novo auxiliar AD VP VP segundo protocolos padrão.

O passo final deste procedimento consiste em amplificar os PVS recombinantes por meio da coinfecção de células NB324K com o PV recombinante e os vírus ADADP. A eficiência da produção de PV recombinante é melhorada em mais de 100 vezes com esta estratégia, que pode ser usada exclusivamente assim que uma pequena quantidade de PVS recombinantes tiver sido produzida por transfeção. Em última instância, a titulação dos estoques virais produzidos é realizada por meio de PCR quantitativa em tempo real ou por ensaio de transdução.

Além disso, um ensaio de placa é realizado para confirmar que vírus competentes em replicação indesejados não foram gerados durante o processo de produção. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a produção clássica de parvovírus recombinante por meio de plasmídeo, em células ativas e tratadas, é que, uma vez produzidos os estoques iniciais de parvovírus recombinante com o auxílio da proteína VP do adenovírus, nossa produção dependerá inteiramente da infecção viral. Isso permite o uso de células NBK, que são boas produtoras de parvovírus, mas são transfectáveis.

Dessa forma, é possível amplificar os vírus recombinantes por e aumentar o poder infeccioso do vírus comum em mais de 100 vezes, reduzindo o tempo e o custo de produção. Demonstrará o procedimento Bárbara Loic, chefe da Unidade de Produção de Vírus, que desenvolveu conosco este novo protocolo. Esperamos que você goste deste vídeo e desejamos boa sorte em seus experimentos.

A produção de parvovírus recombinante ou PV rec por meio de transfeção é necessária para produzir a quantidade mínima de PVs rec a ser utilizada como inóculo na produção subsequente de PVs rec por infecção. Um laboratório de nível de biossegurança dois é necessário para a produção de PVs rec um dia antes da semente de transfeção. Dois milhões de células HEC 2 9 3 T em uma placa de 10 centímetros para obter 50% de confluência celular.

No dia da transfeção, cultive as células em 10 mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS, L-glutamina, penicilina e estreptomicina, e incube durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono e 92% de umidade. No dia da transfeção, prepare uma mistura de produção de vírus em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione os seguintes reagentes em uma proporção molar de um para dois para um: três microgramas do vetor PV rec. contendo o transgênico de interesse.

Six microgramas do vetor P-C-M-V-V-P que abriga a unidade do gene da cápside do parvovírus e oito microgramas do plasmídeo auxiliar derivado do adenovírus. Pxx seis, dilua a mistura de plasmídeos com meio livre de soro até 850 microlitros para obter uma concentração final de 20 nanogramas por microlitro. Em seguida, adicione 42,5 microlitros do reagente de transfeção FU gene HD numa proporção de 2,5 para um de reagente FU gene para DNA.

Tenha cuidado para não deixar o reagente do gene FU tocar na parede do tubo; vorte suavemente por cinco a 10 segundos e, em seguida, incube a mistura de transfeção à temperatura ambiente por 30 minutos. Adicione a mistura de transfeção gota a gota às células. Agite suavemente a placa para distribuir uniformemente a mistura.

Incube a placa por 72 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 92% de umidade. Durante este período, partículas de vírus parvovírus são formadas a partir dos plasmídeos de parvovírus para a coleta do vírus. Primeiro, raspe as células no meio delas, depois aspire e transfira a suspensão da placa para um tubo plástico de 15 mililitros.

Centrifugue o tubo a 250 G durante cinco minutos. À temperatura ambiente, remova 95% do sobrenatante, deixando cerca de 0,5 mililitros restantes. Vortexe suavemente o tubo para ressuspender o pellet no sobrenatante remanescente e transfira para um tubo einor de 1,5 mililitro.

Congele a suspensão em um banho de nitrogênio líquido e depois descongele em água morna a 37 graus Celsius. Agite o tubo vigorosamente por 15 segundos. Repita o ciclo de congelamento e descongelamento mais duas vezes.

Centrifugue o tubo a 16.000 G durante 15 minutos a quatro graus Celsius e colete o sobrenadante em um tubo novo. O sobrenadante nesta etapa contém o extrato bruto de vírus, que pode ser usado como inóculo para a produção de PVS recombinante por infecção. Amplificação viral.

As replicações dependem de fatores celulares que são expressos em células em proliferação. Portanto, é importante que as células utilizadas para a produção do vírus recombinante estejam em condição ótima e semeadas em densidade apropriada, conforme demonstrado neste protocolo. Um dia antes da infecção, semeie 10 milhões de células MB 20.4K em um frasco T175 para obter uma confluência celular de 60 a 80% no dia seguinte.

Prepare um segundo frasco contendo o mesmo número de células como controle. Cada frasco T 1 75 deve conter 20 mililitros de MEM como volume final suplementado com 5% de FBS, L-glutamina, penicilina e estreptomicina na manhã do dia da infecção. Prepare uma mistura de vírus em um tubo plástico de dois mililitros.

Adicione esses reagentes. ADICIONE o auxiliar VP. Adicione uma multiplicidade de infecção de 10 PVRs na MOI de 0,5 e MEM até 1,5 mililitro.

Aplicar toda a mistura viral em um dos frascos T 1 75. Incubar o frasco por duas horas a 37 graus Celsius, 92% de umidade e 5% de dióxido de carbono, com agitação suave a cada 15 minutos. Incubar por mais 20 a 24 horas a 37 graus Celsius, 92% de umidade e 5% de dióxido de carbono.

Após 20 a 24 horas, substitua o meio de cultura por meio fresco e incube o frasco nas mesmas condições por 48 horas como indicação de produção eficiente de vírus. Devem ser observados sinais claros de citotoxicidade no frasco contendo células infectadas por vírus. A partir de 36 a 48 horas pós-infecção, após 48 horas, aspire e transfira o sobrenadante do meio do frasco para um tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Lave as células duas vezes com 1,5 mililitros de PBS, adicione tripsina e incube por três a cinco minutos. Em seguida, adicione a suspensão celular ao meio removido, centrifugue as células e o sobrenadante a 5.000 ×g durante cinco minutos à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e adicione um mililitro de tampão TE ao pellet celular. Vortexe suavemente o tubo para ressuspender as células. A seguir, congele a suspensão celular em banho de nitrogênio líquido e descongele em água morna a 37 graus Celsius.

Vortexie o tubo vigorosamente durante 15 segundos. Repita o ciclo de congelamento e descongelamento três vezes. Em seguida, trate a suspensão celular com a nuclease Ben Nase por 30 minutos a 37 graus Celsius para digerir o DNA genômico celular e o DNA viral não encapsidado.

Após 30 minutos, centrifugue o tubo a 5.000 G durante 20 minutos a quatro graus Celsius. Por fim, colete o sobrenadante em um tubo novo. O sobrenadante nesta etapa contém um extrato bruto de vírus.

Os rendimentos típicos de PV rec GFP produzidos seguindo este protocolo devem estar na faixa de um a 10 vezes 10 à oitava unidade infecciosa viral. Um exemplo de estimulação da produção de PV rec por um plasmídeo baseado em adenovírus é mostrado aqui. Extratos brutos de vírus contendo PHH um GFP PV rec portando o gene GFP com ou sem.

O plasmídeo baseado em adenovírus PXX foi aplicado em células indicadoras NBK, conforme observado nestes micrografias; há mais células positivas para GFP na presença do PXX seis. Quando ensaios de transdução GFP foram realizados, obteve-se um aumento claro na produção de PV recombinante na presença do Pxx seis. A produção aumentou de 0,3 unidades de transdução GFP, ou TU por célula, obtidas por protocolos convencionais, para aproximadamente cinco TU por célula obtidos por este protocolo.

Os resultados do ensaio de transdução GFP indicam que os genes E dois a, E quatro e RNA VA do adenovírus contidos no PXX seis são capazes de aumentar a produção de parvovírus. Esta próxima figura mostra um exemplo representativo da produção de PV rec por meio de infecção. Células NB três 20 4K foram infectadas com o vírus auxiliar ADP purificado e posteriormente superinfectadas com um dos dois parvovírus recombinantes.

Extratos celulares brutos foram utilizados para determinar os títulos virais por meio de um ensaio de transdução que demonstrou que o auxiliar AD VP aumentou ainda mais a produção de PV rec até mais de 70 T por célula. Finalmente, lotes virais produzidos na presença ou na ausência de ADP foram analisados quanto ao seu conteúdo de partículas virais com capacidade de replicação por ensaio de placas em células indicadoras MB três 20 4K. Os resultados indicam que o auxiliar ADP aumentou a produção de PV rec sem aumentar a ocorrência de partículas virais com capacidade de replicação indesejáveis após seu desenvolvimento.

Essa técnica permite que cientistas na área de câncer e terapia gênica aumentem ainda mais a produção de vírus vetoriais recombinantes. Utilizando variantes de biorreatores, pode-se produzir grandes quantidades necessárias em um contexto clínico.