Produção Parvovirus eficiente recombinante com a ajuda de Adenovirus sistemas derivados

O objetivo geral deste procedimento é produzir vírus parvo recombinantes, ou rec PVS em altos títulos, preservando sua qualidade e reduzindo os tempos e custos de produção. Isso é feito primeiro produzindo um estoque viral rec PV inicial por meio da transfecção de células T HEC 2 93 com plasmídeos rec PV, juntamente com um vetor derivado de adenovírus tipo cinco. Desde a introdução de elementos genômicos ad no HEC 2, 9 3 células T aumenta a produção de rec PVS em mais de dez vezes.

Em comparação com os protocolos existentes. Foi gerado um novo auxiliar AD VP que contém os elementos adenovirais genômicos necessários para aumentar a produção de parvovírus recombinante, bem como a unidade gênica VP do parvovírus. O próximo passo é produzir e purificar este novo ajudante ADD VP de acordo com protocolos padrão.

A etapa final neste procedimento é amplificar o rec PVS coinfectando NB três células 20 4K com os vírus rec PV e AD ADP. A eficiência da produção de rec PV é melhorada em mais de 100 vezes com essa estratégia, que pode ser usada exclusivamente quando uma pequena quantidade de rec PVS for produzida por transfecção. Em última análise, PCR quantitativo em tempo real ou um ensaio de transdução é usado para a titulação dos estoques virais produzidos.

Além disso, um ensaio de placa é realizado para confirmar que vírus competentes para replicação indesejada não foram gerados durante o processo de produção. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a produção clássica de parvovírus recombinante via plasmídeo, ção em células de ato e tratado, é que, uma vez que tenhamos produzido os estoques iniciais de parvovírus recombinante no ajudante VP de adenovírus, nossa produção dependerá inteiramente da infecção por vírus. T permite o uso de células NBK, que são boas produtoras de parvovírus, mas são transfectas.

Desta forma, é possível amplificar os vírus per recombinantes e aumentar o poder comum de cura de vírus em mais de 100 vezes, reduzindo o tempo e o custo de produção. Demonstrando o procedimento será Barbara Loic, chefe da Unidade de Produção de Vírus, desenvolveria conosco este novo protocolo. Esperamos que você goste deste vídeo e desejamos boa sorte em seus experimentos.

A produção de parvovírus recombinante ou rec PV via transfecção é necessária para produzir a quantidade mínima de rec PVS para servir como inóculo na produção subsequente de rec PVS via infecção. Um laboratório de nível dois de biossegurança é necessário para a produção de rec PVS um dia antes da transfecção da semente. 2 milhões de células T HEC 2 9 3 em uma placa de 10 centímetros para obter 50% de fluência de co.

No dia da transfecção, cultive células em 10 mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS L-glutamina, penicilina e estreptomicina incubar durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono e 92% de umidade. No dia da transfecção, prepare uma mistura para fazer vírus em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione os seguintes reagentes em uma proporção molar de um para dois a um três microgramas do vetor rec PV que abriga o transgene de interesse.

Seis microgramas de vetor P-C-M-V-V-P abrigando a unidade do gene do capsídeo do parvovírus e oito microgramas de plasmídeo auxiliar derivado de adenovírus. Pxx seis diluir a mistura de plasmídeo com meio livre de soro até 850 microlitros para obter uma concentração final de 20 nanogramas por microlitro. Em seguida, adicione 42,5 microlitros de reagente de transfecção HD do gene FU em uma proporção de 2,5 para um de reagente do gene FU para DNA.

Tenha cuidado para não deixar o reagente do gene FU tocar a lateral do vórtice do tubo suavemente por cinco a 10 segundos e, em seguida, incube a mistura de transfecção em temperatura ambiente por 30 minutos. Adicione a mistura de transfecção gota a gota às células. Agite o prato suavemente para distribuir uniformemente a mistura.

Incube a placa por 72 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 92% de umidade. Durante este período, partículas de parvovírus da progênie são formadas a partir dos plasmídeos do parvovírus para colher o vírus. Primeiro, raspe as células dentro de seu meio, depois aspire e transfira a suspensão da placa para um tubo de plástico de 15 mililitros.

Centrifugar o tubo a 250 G durante cinco minutos. À temperatura ambiente, remova 95% do sobrenadante, deixando cerca de 0,5 mililitros para trás. Agitar suavemente o tubo para ressuspender o sedimento no sobrenadante restante e transferir para um tubo einor de 1,5 mililitros.

Congele a suspensão em um banho de nitrogênio líquido e depois descongele em água morna a 37 graus Celsius. Vortex o tubo vigorosamente por 15 segundos. Repita o ciclo de congelamento e descongelamento mais duas vezes.

Centrifugar o tubo a 16 000 g durante 15 minutos a quatro graus Celsius, recolher o sobrenadante num novo tubo. O sobrenadante nesta fase contém o extrato bruto do vírus, que pode ser usado como inóculo para a produção de rec PVS via infecção. Ganho de vírus de energia.

As replicações A dependem de fatores celulares que são expressos nas células em proliferação. Portanto, é importante que as células usadas para a produção do vírus de potência recombinante estejam em ótimas condições e plaqueadas em uma densidade adequada, conforme demonstrado neste protocolo. Um dia antes da infecção, placa de 10 milhões de MB, três 20 células 4K em um frasco T 1 75 para obter 60 a 80% de cofluência celular no dia seguinte.

Preparar um segundo balão contendo o mesmo número de células que um controlo. Cada frasco T 1 75 deve ter 20 mililitros de MEM como volume final suplementado com 5% de L-glutamina, penicilina e estreptomicina na manhã do dia da infecção. Prepare uma mistura de vírus em um tubo de plástico de dois mililitros.

Adicione esses reagentes. ADICIONAR ajudante VP. Adicione uma multiplicidade de infecção de 10 rec PVS no MOI de 0,5 e MEM a 1,5 mililitros.

Aplicar toda a mistura de vírus num dos balões T 1 75. Incubar o balão durante duas horas a 37 graus Celsius, 92% de humidade e 5% de dióxido de carbono, agitando suavemente de 15 em 15 minutos. Incubar por mais 20 a 24 horas a 37 graus Celsius, 92% de umidade e 5% de dióxido de carbono.

Após 20 a 24 horas, substituir o meio de cultura por meio fresco e incubar o balão nas mesmas condições durante 48 horas, indicando uma produção viral eficaz. Devem ser observados sinais claros de citotoxicidade no frasco que contém células virais infectadas. Começando 36 a 48 horas após a infecção, após 48 horas, aspirar e transferir o sobrenadante médio do frasco para um tubo de centrifugação de 50 mililitros.

Lave as células duas vezes com 1,5 mililitros de olhos de tripsina PBS por três a cinco minutos e, em seguida, adicione a suspensão celular ao meio removido, centrifugue as células e o sobrenadante a 5.000 G por cinco minutos à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e adicione um mililitro de tampão TE ao pellet da célula. Suavemente vórtice o tubo para ressuspender as células. Em seguida, congele a suspensão celular em um banho de nitrogênio líquido e descongele em água morna a 37 graus Celsius.

Vortex o tubo vigorosamente por 15 segundos. Repita o ciclo de congelamento e descongelamento três vezes. Em seguida, trate a suspensão celular com nuclease Ben Nase por 30 minutos a 37 graus Celsius para digerir DNAs celulares e virais não empacotados.

Após 30 minutos, centrifugar o tubo a 5 000 g durante 20 minutos a quatro graus Celsius. Por fim, recolher o sobrenadante para um novo tubo. O sobrenadante nesta fase contém um extracto bruto do vírus.

Os rendimentos típicos de rec PV GFP produzidos seguindo este protocolo devem estar na faixa de um a 10 vezes 10 elevado às oitavas unidades infecciosas virais. Um exemplo de estimulação da produção de rec PV por um plasmídeo baseado em adenovírus é mostrado aqui. Extratos brutos de vírus contendo PHH, um PV ereto de GFP que abriga o gene GFP com ou sem.

O plasmídeo PXX baseado em adenovírus foi aplicado a células indicadoras NBK conforme observado nessas micrografias, há mais células GFP positivas na presença de PXX seis. Quando os ensaios de transdução de GFP foram realizados, um claro aumento na produção de PV rec foi obtido na presença de Pxx seis. A produção aumentou de 0,3 unidades de transdução de GFP ou TU por célula, obtidas por protocolos convencionais para aproximadamente cinco TU por célula obtidas por este protocolo.

Os resultados do ensaio de transdução GFP indicam que os genes de adenovírus E dois a, E quatro e VA RNA contidos no PXX seis são capazes de aumentar a produção de parvovírus. A próxima figura mostra um exemplo representativo da produção de PV rec por infecção. NB três células 20 4K foram infectadas com o vírus auxiliar ADP purificado e, em seguida, superinfectadas com qualquer um dos dois vírus parvo recombinantes.

Extratos de células brutas foram usados para determinar os títulos de vírus por um ensaio de transdução que mostrou que o auxiliar AD VP aumentou ainda mais a produção de rec PV até mais de 70 T de células precedidas. Finalmente, os lotes virais produzidos na presença ou na ausência de ADP foram analisados quanto ao seu conteúdo de replicação de partículas virais competentes por ensaio de placa em MB três células indicadoras 20 4K. Os resultados indicam que o ADP helper aumentou a produção de rec PV sem aumentar a ocorrência de partículas virais competentes de replicação indesejáveis após seu desenvolvimento.

Essa técnica permite que os cientistas no campo do câncer e da terapia genética aumentem ainda mais a produção de vírus de energia recombinante. Usando biorreatores, variantes podem ser produzidas em grandes quantidades necessárias em um ambiente clínico.