Name: Leishmaniose cutânea na pele do dorso de Hamsters: um modelo útil para o rastreamento de drogas leishmanicidas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Aprenda a otimizar o modelo de hamster para leishmaniose cutânea através de inoculação intradérmica de promastigotas de Leishmania. Este método preserva o bem-estar animal enquanto facilita o rastreamento de drogas leishmanicidas.

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Este estudo foi suportado por concessões do Comitê de Pesquisa da Universidade de Antioquia (CODI), o Instituto Colombiano para o Desenvolvimento da Ciência e Tecnologia - COLCIENCIAS e O Centro de Desenvolvimento de Produtos contra Doenças Tropicais - CIDEPRO.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A leishmaniose tegumentar americana é endêmica em regiões tropicais e neotropicais. É muitas vezes referido como um grupo de doenças por causa de o espectro variado de manifestações clínicas, que variam de pequenos nódulos cutâneas a destruição do tecido da mucosa bruto. A maioria dos medicamentos disponíveis são caros, exigem tratamentos longos e estão se tornando cada vez mais ineficaz, sendo necessária a descoberta de novas drogas. O modelo do rato é amplamente utilizado, mas tem algumas ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Tipo </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Reagente </td><td> Holliday-Scott SA </td><td></td></tr><tr><td> Xilacine </td><td> Reagente </td><td> Síntese </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Reagente </td><td> GIBCO </td><td> 14190-136 </td></tr><tr><td> Paquímetro digital </td><td> Equipamento </td><td> Pescador </td><td> 15-077-958 </td></tr><tr><td> Giemsa </td><td> Reagente </td><td> SIGMA </td><td> GS1L-1L </td></tr><tr><td> Formalina </td><td> Reagente </td><td> Nova laboratório </td><td> 11273 </td></tr><tr><td> Parafina </td><td> Reagente </td><td> Pechiney Embalagens Plásticas </td><td> PM-996 </td></tr><tr><td> Haemotoxilin </td><td> Reagente </td><td> Nova laboratório </td><td&gt; 10870103 </td></tr><tr><td> Eosina </td><td></td><td> Nova laboratório </td><td> 10870203 </td></tr><tr><td> Kodak Ektachem seco química </td><td> Equipamento </td><td> Kodak Ektachem </td><td> DT-60 </td></tr><tr><td> antimoniato de meglumina </td><td> Reagente </td><td> Aventis </td><td></td></tr><tr><td> Microscopia </td><td> Equipamento </td><td> Nikon </td><td> YS2-T </td></tr></tbody></table>

leishmaniose cutânea na pele do dorso de hamsters: um modelo útil para o rastreamento de drogas leishmanicidas

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Tradicionalmente, os hamsters são experimentalmente inoculados no focinho ou a pata. No entanto, esses sites não uma úlcera sempre ocorre, a medição do tamanho da lesão é um procedimento difícil e animais apresentam dificuldade para comer, respirar e se mover por causa da lesão. A fim de optimizar o modelo de hamster para a leishmaniose cutânea, macho adulto jovem e fêmeas hamsters dourados (Mesocricetus auratus) foram injectados por via intradérmica na pele dorsal com 1 a 1,5 x l0 7 promastigotas de espécies de Leishmania e progressão das lesões subsequentes foram avaliados por até 16 semanas após a infecção. O hamster dourado foi escolhido porque é considerado o adequado modelo bio-para avaliação de medicamentos contra a Leishmania como eles são suscetíveis à infecção por diferentes espécies. Infecção cutânea de hamsters resulta em lesões crónicas, mas controlada, e uma evolução clínica com sinais semelhantes aos observados nos seres humanos. Portanto, o estabelecimento of a extensão da infecção por medição do tamanho da lesão de acordo com a área de endurecimento e úlceras é viável. Esta abordagem provou sua versatilidade e fácil gerenciamento durante a inoculação, acompanhamento e caracterização de lesões típicas (úlceras), aplicação de tratamentos através de diferentes formas e obtenção de amostras clínicas após os diferentes tratamentos. Usando este método, a qualidade de vida animal sobre locomoção, busca de comida e água, jogos e actividades sociais isalso preservados.

Otimização do modelo de hamster experimental da leishmaniose cutânea por injeção intradérmica de<em&gt; Leishmania</em&gt; Promastigotas na pele dorsal. Esta abordagem é útil durante a inoculação, seguimento caracterização, de lesões, a aplicação dos tratamentos e obtenção de amostras clínicas. Busca de locomoção, por comida e água, atividades lúdicas e sociais serão preservados.

Leishmaniose cutânea na pele do dorso de Hamsters: um modelo útil para o rastreamento de drogas leishmanicidas

Tradicionalmente, os hamsters são inoculados experimentalmente no focinho ou na almofada plantar. No entanto, nesses locais nem sempre ocorre a formação de uma úlcera, e a medição de...

Para otimizar o modelo de hamster para leishmaniose cutânea, descrevemos aqui uma abordagem utilizando inoculação intradérmica de promastigotas na pele dorsal. Esta abordagem demonstrou sua versatilidade e fácil manuseio no momento da inoculação, acompanhamento e caracterização das lesões típicas, aplicação de tratamentos por diferentes vias, obtenção de amostras paraclínicas, coleta de dados sobre os diversos compostos promissores, sem que isso represente um prejuízo significativo na qualidade de vida do modelo.No que diz respeito à locomoção, busca de alimento e água, brincadeiras e atividade social com movimentos cuidadosos, seguros e estáveis, o animal deve ser contido pela base do pescoço usando os dedos, aproveitando a grande quantidade de pele que o hamster possui. A palma da mão é usada para fornecer ao animal uma superfície de apoio na qual ele se sinta confortável. Uma vez que o animal esteja relaxado, a pele do pescoço e das bolsas pode ser esticada com o polegar e o indicador, enquanto com os demais dedos se segura firmemente a pele da bolsa contra a palma da mão, de modo que o animal fique completamente imobilizado.Uma característica distintiva na fêmea é a visualização da linha Mi Mary, que é bem evidente a partir da primeira semana de idade. Outra característica é a curta distância anogenital. Quanto à determinação do sexo do macho, pode-se observar o saco escrotal contendo os testículos.Além disso, e como consequência disso, há uma maior distância entre o ânus e a pele do quarto. O animal é segurado firmemente pela base do pescoço e colocado em uma armadilha ou caixa acondicionada sobre uma balança previamente calibrada, após alguns segundos. Quando o animal está confortável nesse espaço, a leitura do peso é realizada e imediatamente registrada no formato apropriado.Os métodos mais comuns para a identificação de hamsters são a coloração de uma área da pele com ácido pírico e a perfuração da orelha para a coloração. Com o ácido pírico, o procedimento é o seguinte: segure o animal como mencionado anteriormente e, com um cotonete embebido em ácido pírico, impregne a região a ser marcada — normalmente o membro anterior ou posterior, esquerdo ou direito — com uma quantidade suficiente para garantir que a marcação dure até o fim do experimento. Para este método de identificação, recomenda-se que o animal esteja sob sedação ou anestesia.Embora não seja estritamente necessário, a orelha a ser marcada é selecionada e desinfetada com álcool. Após isso, escolhe-se a área a ser perfurada, evitando a região com vasos sanguíneos. Em seguida, a orelha é furada utilizando um furador específico para roedores, sendo o procedimento realizado de forma rápida, porém firme e segura.Considerando que em uma gaiola devem haver dois a três animais. Podem ser feitos até dois orifícios por ano. Para aplicar o anestésico no animal, ele deve ser segurado conforme indicado no início, de forma a impedir o movimento do hamster com o animal.Na posição supina, a área abdominal na qual o fármaco será aplicado é desinfetada usando álcool 70% e secada com algodão limpo. A via intraperitoneal é utilizada com o animal ligeiramente inclinado em direção à cabeça, de modo que ocorra o deslocamento visceral. A agulha é completamente introduzida de forma um pouco paralela à coluna vertebral.Uma aspiração inicial é realizada para confirmar que nenhum órgão foi perfurado, e então o produto é aplicado para depilar a região da pele que será inoculada no animal. Após posicionar adequadamente o animal, marca-se um ponto a dois centímetros da base da cauda. Com o auxílio de tesoura, todo o pêlo é removido, limpando uma área de aproximadamente dois centímetros quadrados, com cuidado para evitar lesões, dentro de uma cabine de segurança biológica e com o hamster anestesiado. Em uma seringa de um mililitro, adicionam-se 100 microlitros da quantidade conhecida de cultura na fase logarítmica.Pro maus de leishânia é administrado. A agulha deve ser fixada na seringa como precaução para evitar acidentes. Algodão com solução salina estéril é usado para limpar a área depilada do animal em um único sentido.Posteriormente, com o bisel da agulha voltado para cima, a pele do hamster é penetrada, certificando-se de que a agulha entre no subdérmico de maneira lenta e gradual. O inóculo é injetado para formar uma pápula subdérmica; para remover a agulha, gire levemente e puxe. Todo o material utilizado é descartado.Após seguir as normas de biossegurança para monitorar lesões cutâneas provocadas pela leishmânia, recomenda-se a imobilização inicial do animal em uma armadilha para facilitar o processo de medida precisa de uma lesão. A palpação da área cutânea inoculada é realizada para delimitar a induração e a úlcera formada com a ajuda de um paquímetro digital, cobrindo-se a largura da úlcera, e a medida em milímetros é registrada em um formulário destinado ao monitoramento clínico. Da mesma forma, o comprimento da úlcera é medido, devendo também ser registrado após a inoculação subdérmica.Existem entre quatro a cinco semanas de tempo de espera para obter lesões típicas comparáveis às apresentadas em humanos. O animal é imobilizado em um suporte especial que permite expor as costas, onde está localizada a lesão.Usando um conta-gotas, o composto é adicionado sobre a lesão e o líquido é deixado secar antes de devolver o animal à sua gaiola. Com o animal firmemente fixado conforme ilustrado acima, a mão mais hábil é usada para desinfetar a área com álcool e algodão em um único sentido. Em seguida, a mesma mão é usada para manipular a seringa contendo a droga a ser utilizada, em um volume máximo de 200 µL.O medicamento é injetado através dos músculos semitendinosos ou semimembranosos das ancas. Se o medicamento precisar ser aplicado por vários dias, deve-se alternar os membros para evitar desconforto e danos ao animal; com uma mão menos habilidosa, o animal é fixado conforme indicado anteriormente. A outra mão é usada para manipular a sonda orogástrica.14 garagem que se conecta a uma seringa de um mililitro para fornecer confortavelmente uma quantidade não superior a 200 microlitros. O hamster é firmemente fixado com um dispositivo imobilizador, expondo a área a ser tratada, que é limpa com algodão estéril e solução salina com uma única passagem em um sentido, usando uma seringa de um mililitro, com a bisel para baixo e um volume não superior a 100 microlitros, realizando-se uma única abordagem subdérmica por um vértice das lesões, depositando-se gradualmente o fármaco, cobrindo toda a área da lesão antes do sacrifício. Os animais são anestesiados conforme descrito anteriormente para o processo de eutanásia.O hamster é levado a uma câmara de acrílico selada que está conectada a um cilindro ou a uma rede de dióxido de carbono. A válvula é aberta lentamente durante vários minutos para amostragem dos hamsters sacrificados, fixados sobre uma superfície de dissecação. Lâmpadas de vidro são necessárias para obtenção de impressões da pele e dos órgãos internos.Tubos Falcon de 15 mililitros com formalina a 10% para amostras de histopatologia, e o material inclui dissecação, tesoura, pinça, bisturi, cabo e lâminas. Por fim, a presença de leishmânia em amostras de lesão cutânea ou cicatriz, fígado, baço, rim e linfonodos poplíteos é determinada diretamente mediante exame de esfregaços corados com Giemsa e exame histopatológico desses tecidos. Um espécime de biópsia é fixado em formalina a 10% e incluído em parafina.Seções de cinco mícrons dos tecidos fixados foram coradas com hematoxilina e eosina e examinadas ao microscópio óptico utilizando imersão de óleo com aumento de 1000×. Para estudar a microarquitetura, as características do infiltrado celular e a presença ou ausência de parasitas. Fotomicrografias são feitas e imagens digitais são capturadas.Todos os materiais devem ser descartados seguindo as regulamentações de biossegurança para descarte de resíduos biológicos. O hamster dourado Mi demonstrou ser particularmente útil para o estudo de lesões cutâneas causadas por espécies de Leishmania do Novo e do Velho Mundo. A inoculação de promastigotas é capaz de causar lesões cutâneas entre um e dois meses após a inoculação.O hamster apresenta uma evolução previsível da doença após infecção experimental, caracterizada pelo desenvolvimento de lesões semelhantes às observadas em seres humanos; devido à natureza crônica das lesões cutâneas no modelo de hamster, é possível monitorar intervenções terapêuticas por longos períodos. Tradicionalmente, os hamsters são inoculados experimentalmente no focinho ou na pata, contudo, nesses locais, nem sempre ocorrem lesões notáveis. Além disso, a mensuração do tamanho da lesão é difícil de realizar, e os hamsters apresentam dificuldades para se alimentar, respirar e se mover.Em resumo, esta abordagem demonstra que as características patológicas clínicas das lesões cutâneas induzidas na pele dorsal de hamsters são notavelmente semelhantes às da doença humana, mas surpreendentemente diferentes do modelo marinho comumente utilizado. Assim, a infecção experimental na pele dorsal de hamsters representa um modelo útil para validar o potencial de compostos candidatos a fármacos para H manual.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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